通过毛细管凝胶电泳和亲和毛细管电泳分析AtHIRD11蛋白的内在无序性及其对金属离子的结合能力

该方法有助于解答有关内在无序蛋白在金属铁结合后发生的构象变化等关键科学问题。此技术的主要优势在于所需设备极少，且能够快速获得结果。本实验操作将由我实验室的研究生 Matthias Stein 进行演示。

首先，使用玻璃刀在玻璃板上将一根外层涂有聚酰胺、内径为50微米的裸熔融石英毛细管切割成33厘米和30厘米两种长度。用记号笔在毛细管上标记检测窗口的中心位置，该检测窗口宽1厘米；在CGE实验中，此位置距离毛细管一端24.5厘米；在ACE实验中，距离一端21.5厘米。使用喷灯将每个标记前后各0.5厘米范围内的聚酰胺外涂层烧除。

同样，使用喷灯去除毛细管两端一厘米长的涂层。然后用乙醇和柔软的纸巾清洁毛细管的两端及检测窗口。将一根毛细管安装到毛细管电泳系统中，使检测窗口靠近出口端。

根据文本方案配制溶液后，使用250微摩尔的氯化钙溶液填充一支10毫升的注射器。然后将一个0.2微米的PVDF滤器连接到注射器上，推动2毫升溶液通过滤器并弃去。使用注射器中剩余的氯化钙溶液，将10个小瓶填充至允许的最大体积。

将每个小瓶标记为250微摩尔氯化钙溶液进样瓶。然后，用氯化钙溶液将10个小瓶填充至一半，并将每个标记为250微摩尔氯化钙溶液出样瓶。

然后，用其他含金属盐的溶液以类似方式填充小瓶。此外，针对每一对进样和出样小瓶，使用 30 微摩尔 Tris 缓冲液配制一组相应的进样和出样小瓶。用 60 微摩尔乙酰苯胺 EOF 标记物填充 10 个小瓶。

然后使用1 mg/mL的样品溶液填充一个样品瓶。按照文本方案完成分析准备后，在CGE实验中通过在入口端施加0.1 bar压力、持续4分钟，对样品溶液进行流体动力学进样。随后，在毛细管两端施加-16.5 kV电压和2.0 bar压力，持续25分钟。

在完成无配体条件下的检测方法制备后，开始制备含配体条件下的检测方法：首先使用0.1摩尔的EDTA溶液在2.5 bar压力下冲洗毛细管1分钟，然后用去离子水冲洗毛细管。接着，使用配体溶液在2.5 bar压力下冲洗毛细管1.5分钟，以平衡毛细管。

然后，在0.05 bar压力下注入乙酰苯胺溶液持续6秒，并将进样端和出样端的小瓶更换为含有配体的缓冲液小瓶。施加0.05 bar压力2.4秒，以将乙酰苯胺溶液进一步推入毛细管末端。施加10.0千伏电压运行6分钟，并在200纳米波长处检测乙酰苯胺的峰信号。

在用EDTA去离子水和配体溶液冲洗毛细管后，注入蛋白质样品，并将进样端和出样端的小瓶更换为含有新鲜配体的缓冲液小瓶。或者，交替进行有配体和无配体条件下的测量。然后，使用碱土金属配体溶液重复该方法。

最后，使用以下溶液执行相同的方法，然后计算不同蛋白质-金属离子相互作用的电荷大小比率变化。此处显示的是在CGE实验期间获得的AtHIRD11样品的电泳图谱。

肽的尺寸从左到右逐渐增大。第四号峰的质量最大，代表完整的蛋白质。较小的第二号和第三号峰则代表较小的杂质。

该图显示了ACE实验中乙酰苯胺的电泳图谱。乙酰苯胺溶液仅显示一个高峰，因其不应含有杂质。峰最大值的检测时间指示了电渗流的迁移时间，并用于相互作用的计算。

该电泳图谱为ACE实验中AtHIRD11样品在无SDS和金属离子条件下获得。除CGE电泳图谱中的两种杂质外，至少存在五个与蛋白质本身相关的峰。此处展示了在不同金属离子存在下，第六个峰测得的迁移时间变化的图示分析结果。

该值以计算出的 Delta R 与 RF 的比值表示。每个结果的数值及其符号均指示了蛋白质-金属离子复合物总电荷整体变化所引起的迁移程度。一旦掌握，该技术可在八小时内完成一个相互作用伙伴的检测，包括毛细管凝胶电泳（CGE）相互作用分析（若操作得当）。在进行该实验时，需注意在长时间测量过程中更换蛋白质溶液，因为降解产物可能随时间增加；同时应更换 Tris 缓冲液，以获得更精确的结果。

观看本视频后，您应能充分掌握毛细管的切割与清洗方法，以及如何建立亲和毛细管电泳方法，以评估内在无序蛋白的结合行为。