Name: 变性小鼠年龄依赖性运动障碍的步态分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习使用运动学步态分析技术监测小鼠模型中运动协调性和神经退行性病变进展的方法。该技术通过腹侧平面成像捕捉细微运动障碍，为理解帕金森病等疾病的运动功能损伤提供重要见解。

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感谢ENI动物实验中心的动物饲养员在动物繁育方面提供的帮助，以及Nuno Raimundo博士对本文稿提出的宝贵意见。I.M.的研究得到了德国研究基金会（DFG）通过合作研究中心SFB-889（项目A8）和SFB-1190（项目P02）以及Emmy Noether青年研究员奖（1702/1）提供的资助。C.M.R.得到了哥廷根神经科学、生物物理学与分子生物科学研究生院（GGNB）奖学金的支持。

本文报道的所有动物实验均依照欧盟动物福利指南（2010/63/EU）进行，并获得下萨克森州消费者保护与食品安全局（LAVES）的批准，注册编号为14/1701。
1. 研究设计
<ol>
	<li>由于动物行为学研究需要周密的规划，在设计实验时请考虑以下参数。
	<ol>
		<li>每组所需的动物数量。
		<ol>
			<li>使用统计学软件（例如，PASS、EDA 或 GPower）计算所需的组大小。 
			注：组大小取决于动物间的变异程度以及表型的严重程度。对于运动学步态分析，每组小鼠数量通常为 10 -&#160;20 只。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>实验动物的性别。
		<ol>
			<li>根据动物品系，考虑雌激素水平对实验的影响。 
			注：许多行为学研究集中于雄性动物，以避免雌激素水平对实验结果的干扰。这种影响程度因动物背景品系的不同而有所差异。</li>
			<li>若同时使用两种性别的动物，应检验性别因素的影响，并在必要时分别对两组进行评估。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>实验动物的年龄。
		<ol>
			<li>若仅需一个时间点，则使用成年动物（2 月龄或以上）。</li>
			<li>若需研究随年龄增长运动行为的变化，应选择多个时间点。最早的时间点可为 1 月龄，即小鼠断奶后。应以规律的时间间隔对动物进行测试，例如，每 1、2 或 3 个月一次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向当地主管部门申请开展动物行为测试的许可。</li>
	<li>制定实验动物的获取计划。
	<ol>
		<li>提前制定繁殖计划或及时联系动物供应商，以确保实验开始当天有足够的实验动物可用。</li>
		<li>若实验期间动物被饲养在新的房间/环境中，应让其适应环境一周时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视频录制
注意：为了说明运动学步态分析的应用，此处使用一种市售的成像系统及其配套的成像与分析软件（参见材料表）。
<ol>
	<li>启动计算机和成像软件。</li>
	<li>通过观察动物在饲养笼内的状态，并使用天平称重，评估每只动物的健康状况和福利。</li>
	<li>必要时，用画笔将红色指画颜料轻轻涂抹于动物的足部。将动物放入另一个干净的笼子中，静置约5分钟，使颜料自然风干。 
	注意：避免将动物腹部涂色，因为涂色的目的是增强足部与身体之间的对比度。准备黑色手指画颜料以便进行修正会很有帮助。此步骤适用于毛色为棕色的动物，或足部已纹纹用于识别的动物。如果选择对某一只动物的足部进行涂色，则同一组及对照组中的所有动物均需进行涂色。</li>
	<li>在设备右上方面板设置跑步机速度；若需应用多个跑步速度，应首先从最慢速度开始。</li>
	<li>将动物放入测试箱内（关闭箱盖时避免夹住尾巴或足部）。用深色布料遮盖测试箱，让每只动物适应环境 1 - 2 分钟。</li>
	<li>通过将跑步机灯光旋转开关调至开启位置，打开测试舱内的灯 &#34;在&#34; 位置。将跑步机的旋转开关转至 &#34;正向&#34; 启动跑步机，然后单击 &#34;记录&#34; 成像软件中的按钮。 
	注意：跑步机运行期间，必须仔细并持续观察动物的表现：若动物无法跟上跑步机速度，或出现与运动无关的继发性症状，应立即停止跑步机例如， 癫痫发作）。测试条件可能需要重新调整。</li>
	<li>当动物稳定奔跑（无快速向侧面、前方或后方逃逸）时，持续记录至少 5 秒，然后停止跑步机。通过点击停止录制 &#34;停止&#34; 在成像软件上，并将跑步机的旋转开关转回 &#34;关闭&#34; 位置。 
	注意：为避免动物跑动不稳定，可让其先跑数秒钟，或通过将跑步机旋转开关调至相反方向使其向反方向跑动 &#34;反转&#34; 而不是 &#34;正向&#34;).</li>
	<li>点击 &#34;处理&#34; 在成像软件中点击按钮，打开一个菜单，用于设置视频片段（用于分析）的起始点和结束点。操作时，使用屏幕底部的滑块浏览视频。</li>
	<li>要将当前时间点选为起点或终点，请单击 &#34;从第 # 帧开始&#34; 和 &#34;分别确保该部分包含动物以恒定速度稳定奔跑的至少7步/爪（总共14步）。</li>
	<li>输入动物编号、出生日期、体重和性别。将数据保存至计算机或服务器的指定位置。点击 &#34;相机&#34; 返回到记录界面。</li>
	<li>若需记录多个跑步速度，应使用所需的跑步速度重复步骤 2.6 至 2.10。在录制下一个视频前，需确认足部的红色颜料仍然存在，否则需重复步骤 2.3。</li>
	<li>记录完毕后，将动物放回其饲养笼中。移走动物后，需用肥皂水彻底清洁跑台传送带，随后再用消毒剂进行消毒，以备下一只实验动物使用。</li>
</ol>
3. 视频处理
<ol>
	<li>启动分析软件并点击 &#34;选择研究文件夹&#34; 选择包含已录制视频的文件夹。</li>
	<li>选择一个视频，或选择多个可连续处理的视频，然后单击 &#34;开始。&#34;</li>
	<li>使用 &#34;重绘&#34; 选择小鼠活动区域的功能；该区域应仅包含小鼠和白色背景。</li>
	<li>如果 &#34;反转&#34; 之前已使用过跑步机功能，请选择 &#34;检查受试动物的鼻子是否位于你的右侧 >>> 以镜像视频，因为该软件仅设计用于分析向左奔跑的动物。点击 &#34;接受&#34; 继续进行。</li>
	<li>使用 &#34;刷新&#34; 功能，以查看软件检测到的默认掩膜和爪印。 
	注意：原始视频显示在左侧，右侧为所提出的爪印黑白图像。</li>
	<li>输入数值到 &#34;长度&#34; 和 &#34;宽度&#34; 调整遮罩区域以排除动物吻部周围的红色区域，避免因该区域颜色与足掌相似而导致软件误将吻部区域识别为足掌。</li>
	<li>调整滑块 &#34;滤除噪声&#34; 和 &#34;过滤毛发和深色斑块&#34; 优化黑白爪印。设置 &#34;滤除噪声&#34; 将滑块调至约800 - 950（黑色动物）或约700 - 800（棕色或白色动物），具体数值取决于动物毛色的深浅。选择 &#34;好的&#34; 当设置满意时。 
	注意： &#34;过滤毛发和深色斑块&#34; 滑块取决于如何 &#34;红色&#34; 爪子区域的灰度值。对于染色的爪子，该值通常在100–120之间；对于未染色的爪子，最佳值通常在50–100之间。这些参数设置取决于毛发和爪子的颜色深浅，需针对每只动物进行优化。黑白爪印图像应清晰显示爪子形态，并尽可能减少背景噪声。</li>
	<li>选择一个或多个已通过首次调整（标记有 &#34;@@&#34; 在视频名称之前）并选择 &#34;开始&#34; 用于启动对这些视频的分析功能。 
	注意：每个视频的分析耗时 2 - 5 分钟。由于此步骤无需实验人员干预，可一次性运行多个视频的分析，适合过夜处理。</li>
	<li>选择一个已分析的视频（标注有 &#34;@@@&#34;）并点击 &#34;go。” 注意脚掌面积（单位：cm2随着时间推移，每个独立脚爪与传送带接触的面积（步态动力学）现在均可观察到。要比较选定区域的原始视频与计算得出的脚爪足迹，可使用 &#34;播放视频&#34; 功能。</li>
	<li>使用以下三种工具来纠正软件产生的小错误。
	<ol>
		<li>使用 &#34;正确&#34; 删除错误信号的选项， 例如， 当软件记录到信号，但相应的足爪并未接触传送带时。单击一次以放大至相关区域，第二次单击标记待删除对象的左边界，第三次单击标记右边界。</li>
		<li>使用 &#34;连接&#34; 结合两个信号的选项， 例如， 当连续数帧未记录到信号，而足爪仍与传送带接触时，单击以放大相关区域，然后在两个物体中间双击以合并。</li>
		<li>使用 &#34;删除&#34; 完全移除时间点的选项。仅在无法通过其他方式修正错误时使用此选项。 &#34;正确&#34; 或 &#34;连接&#34; 功能, 例如， 当左侧前肢足垫的信号被误记录为左侧后肢足垫信号时，单击一次以放大至相关区域，第二次单击标记需删除区域的左边界，第三次单击标记右边界。 
		注意：这些工具仅可用于纠正小的错误；系统性故障（例如， 如果一只爪子的信号极弱，则无法校正：应将该视频排除在分析之外，并在可能的情况下重新记录该动物的数据。请注意 &#34;播放视频&#34; 选项在之后不再可用 &#34;正确，“连接，”或 &#34;删除&#34; 选项已被使用，点击 &#34;撤销&#34; 按钮将重置所有 3 种编辑工具。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择 &#34;下一个肢体&#34; 继续进行四肢的检查；当 &#34;下一个肢体&#34; 在点击最后一只爪子后，软件将完成分析，并在4个屏幕上显示该动物的结果。</li>
</ol>
4. 步态分析
<ol>
	<li>当一个实验的所有视频分析完成后，选择所有视频并点击&#34;重新整理结果&#34;以导出结果（即电子表格文件中的参数列表）。</li>
	<li>打开文件名以&#34;reorganized_stride_info&#34;结尾的文件，并添加该电子表格中未包含的信息：组别信息（例如，基因型、处理方式）、年龄，以及保存在另一个以&#34;SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info&#34;结尾的电子表格文件中的动物体长和体宽测量值。</li>
	<li>根据需要将步态参数归一化为动物体宽或体长，例如，步长（SL）归一化为动物体长，步宽（SW）归一化为动物体宽。</li>
	<li>按组别、年龄和跑步速度对结果进行排序：独立分析所有这些条件。 
	注意：同一组内不能合并不同年龄或不同跑步速度的数据。</li>
	<li>针对所有实验条件，计算每个参数的平均值（均值）、标准差以及均值的标准误。</li>
	<li>根据实验设计进行统计学分析，例如，使用双尾t检验比较突变/处理动物与野生型（WT）/对照组，或使用方差分析（ANOVA）比较多个独立组别。</li>
	<li>查看所有测量得到的参数：绘制每个参数的图表有助于更直观地展示结果。如果某个参数存在统计学差异，需检查其他相关参数是否发生相应变化。 
	注意：例如，若某一测试组的步长（SL）显著减小，则会导致步频升高（因跑步速度保持不变），并可能导致步宽（SW）增加（以维持姿势稳定性）。</li>
	<li>选择对模型最具相关性且/或可与人类疾病观察结果相比较的参数。在展示时，为每组制作代表性视频，并辅以显示关键参数读数的图表，因为细微的步态变化通常难以从视频中直接察觉。</li>
</ol>
5. 故障排除
注意：一些动物，尤其是具有焦虑表型的小鼠模型，可能难以完成跑步机跑步这类简单的任务。以下是一些可采取的步骤，以降低焦虑水平并鼓励动物跑步。
<ol>
	<li>习惯化与正向强化。
	<ol>
		<li>在首次测试前 2 - 3 天，将小鼠放入测试舱内，用深色布料覆盖，保持灯光关闭。让小鼠在新环境中适应约 5 分钟。加入饲料或巧克力/坚果酱（例如， Nutella）加入测试室，以形成正向关联。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气流/后部边界负向约束。
	<ol>
		<li>小鼠不喜欢气流刺激或身后有物体移动，会逃离此类干扰。为促使小鼠奔跑，可使用轻微的气流刺激，或使构成测试腔后边界 的柔性杆产生有节奏的运动，以激励小鼠向测试腔前部奔跑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动缓慢。
	<ol>
		<li>测试高速跑步时，先以较低速度启动跑步机，然后缓慢增加跑步机速度至目标测试条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尽量减少自由活动。
	<ol>
		<li>测试室的长度由前后两个可调节的挡板限制。如果测试动物能够跟上跑步速度但跑动不稳，可缩短测试室长度以促使动物跑动更加稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果上述测量未能成功，记录次日继续跑步。若动物在连续三天测试后仍拒绝跑步，则记录该结果，并将该动物排除于后续测试之外。 
	注意：步态分析的结果取决于高质量的视频录制。如果视频录制得当，则在分析过程中没有理由排除任何视频。如果视频质量不足，在步骤 3.6 设置生成数字足印参数时便会明显显现。如果除足部和鼻尖以外的任何其他身体部位呈现红色（例如， 由于生殖器周围毛发缺失或腹部有手指涂抹痕迹等原因，视频质量会显著下降。3.6步骤中的调整仅能修正轻微问题，若无法使视频达到可接受的信噪比，则该视频需排除在分析之外，并需重新进行录制。因此，建议在完成录制后尽快分析视频。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

研究运动协调能力是表征神经退行性疾病模型的一种有效方法，尤其适用于帕金森病（PD）等运动协调功能严重受损的疾病。借助运动学步态分析功能检测方法，我们可以在动物出现运动障碍初期，或在神经退行性病变较轻、表型相对轻微的模型中，识别其步态的细微变化。鉴于各类神经退行性疾病模型的表型范围广泛，涵盖从轻微步态异常到严重运动障碍，该方法可根据动物的年龄和运动能力，有效评估其步态参数。对于运动严重受损的动物，可在平面跑台上以低速行走时进行记录；而对于损伤较轻的模型，则可在高速上下坡跑动时进行记录。这种方法能够在不使动物过度劳累的情况下，揭示神经退行性模型与其同窝对照动物之间的步态差异。
通过本方案，我们展示了VPI方法在监测小鼠衰老过程中运动功能障碍发展方面的适用性。通过对野生型小鼠在多个时间点进行检测，随着其年龄增长，我们能够识别出与年龄相关的步态异常，并表征这些异常随衰老的进展情况。此外，在操作神经退行性疾病小鼠模型时，常遇到的一个问题是，由于存在与运动行为无关的症状（例如， 焦虑、淡漠、学习困难），动物执行即使是跑步这样简单的运动任务的意愿也会降低。本文提出了一些方法改进...

神经退行性疾病给患者、家庭和社会带来了沉重负担，随着预期寿命的延长以及全球人口持续老龄化，这一问题将变得更加突出。神经退行性疾病的最常见症状之一是平衡能力和行动能力障碍。因此，对衰老的哺乳动物（例如，啮齿类）模型和/或表现出神经退行性表型的模型进行运动行为特征分析，是验证特定动物模型或旨在改善疾病症状的治疗手段在体内相关性的重要工具。几乎每一种治疗神经退行性疾病的策略，最终都必须在动物模型中进行测试，然后才能启动人类临床试验。因此，建立可靠且可重复的行为学检测方法至关重要，这些方法可用于在衰老过程中持续量化与疾病相关的表型，以确保在体外模型中显示潜力的候选药物，能够在活体动物中有效改善表型。
啮齿类动物运动行为评估的一个方面是运动学步态分析，可通过VPI（也称为腹侧平面视频记录法）来实现1,2。这一成熟的方法利用对在透明电动跑带上方行走的啮齿类动物腹部进行连续录像，从而获取数据1,2,3,4。对视频数据的分析可生成所有四肢的&#34;数字足印&#34;，动态且可靠地再现啮齿类动物的行走模式，该方法最初由&#160;Kale et al.2 和 Amende et al.3 描述。
基于成像的步态分析原理是针对每个单独的足爪，测量其在跑带表面接触面积随时间的变化。每次支撑相表现为足爪接触面积的增加（制动阶段）和随后的减少（推进阶段），之后进入摆动相，此阶段无信号被检测到。摆动相与支撑相共同构成一个步周期。除了步态动力学参数外，还可从记录的视频中提取姿势参数。代表性参数及其定义见表1，包括支撑宽度（SW；前肢或后肢到吻部-尾轴的总距离）、步长（SL；同一足爪连续两次着地之间的平均距离）以及足爪放置角度（足爪与吻部-尾轴之间的夹角）。姿势和步态动力学数据可用于推断动物的平衡能力（通过姿势参数及其在多个步态周期中的变异性）和协调性（通过步态动力学参数）。其他参数，如共济失调系数（通过[(最大SL−最小SL)/平均SL]计算得到的SL变异性）、后肢共同支撑时间（双侧后肢同时接触跑带的时间）或足爪拖曳面积（从足爪完全支撑至抬离跑带期间在跑带上的总面积）也可被提取，并已在多种神经退行性疾病模型中被报道发生改变5,6,7,8（见表1）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>单位</td>
			<td>定义</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>摆动时间</td>
			<td>ms</td>
			<td>足掌不与履带接触的时间持续长度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支撑时间</td>
			<td>ms</td>
			<td>足掌与履带接触的时间持续长度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 制动</td>
			<td>% 支撑时间</td>
			<td>足掌处于制动阶段所占支撑时间的百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 推进</td>
			<td>% 支撑时间</td>
			<td>足掌处于推进阶段所占支撑时间的百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>支撑宽度</td>
			<td>cm</td>
			<td>前足或后足到吻部-尾轴的总距离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步幅长度</td>
			<td>cm</td>
			<td>同一足掌连续两步之间的平均距离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步频</td>
			<td>步/s</td>
			<td>每秒完成的完整步数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>足掌放置角度</td>
			<td>deg</td>
			<td>足掌相对于动物吻部-尾轴的角度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>共济失调系数</td>
			<td>a.u.</td>
			<td>通过[(最大步长 - 最小步长)/平均步长]计算的步长变异性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% 共同支撑</td>
			<td>% 支撑时间</td>
			<td>后肢共同支撑时间；即双后肢同时与履带接触的时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>足掌拖动面积</td>
			<td>mm2</td>
			<td>从完全支撑到足掌抬起期间足掌在履带上的总面积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肢体负荷</td>
			<td>cm2</td>
			<td>MAX dA/dT；制动阶段足掌面积变化的最大速率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步角变异性</td>
			<td>deg</td>
			<td>后足之间角度的标准差，作为步长和支撑宽度的函数</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 可通过腹侧平面成像检测的关键步态参数定义。
评估神经退行性疾病啮齿类动物模型的运动行为可能具有挑战性，具体取决于特定模型在某一特定年龄阶段表型的严重程度。多种疾病（尤其是帕金森病，PD）在患者和动物模型中均表现出显著的运动行为（ locomotion）缺陷。PD 的四大核心症状之一是运动迟缓（bradykinesia），其随年龄增长而进展，并在 PD 早期即已表现出严重的步态障碍9。针对急性 PD 模型（即使用 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）处理的啮齿类动物）的研究已应用了 VPI 步态分析技术10,11,12。然而，由于该模型具有急性特征，这些研究未能反映运动功能障碍随年龄进展的情况。近年来多项研究对具有神经退行性改变的老年小鼠进行了步态分析，例如13,14,15，突显了理解疾病随年龄进展过程的重要性。
除了运动功能障碍外，神经退行性疾病动物模型通常难以专注于检测任务，并表现出显著的认知障碍，尤其是随着年龄增长更为明显。这种表型可能会影响运动行为测试的结果。例如，目前最广泛用于评估运动功能障碍的转棒实验16，其结果依赖于认知能力、注意力和应激状态17,18。虽然动物在电动跑轮上行走的意愿也受这些因素影响，但所记录的输出指标是跑步行为，这一特征更为标准化，且受认知改变的影响较小。应激和注意力的影响可能体现在某些特定参数中，例如摆动/支撑时间反映应激状态，步长（SL）反映注意力19,20，但不会影响整体的跑步能力。
运动学步态分析方法的另一优势在于可调整啮齿类动物模型的测试难度。通过调节跑台的角度和速度，可实现0.1 - 99.9 cm/s范围内的行走速度，因此即使存在严重行走障碍的啮齿类动物仍可在较慢速度（约10 cm/s）下进行跑动。无功能障碍的动物则可在较快速度（30 - 40 cm/s）下进行测量。观察受试动物是否能够以特定速度跑动本身即可提供一项测试结果。此外，还可通过倾斜跑台至所需角度（借助角度计）使啮齿类动物在上坡或下坡条件下跑动，以增加测试难度，或通过在小鼠或大鼠后肢连接配重雪橇来实现额外挑战。
除了对患者中发生突变的单个蛋白质的大量研究外，近年来人们 increasingly 意识到内吞作用过程缺陷与神经退行性变之间的关联13,21,22,23,24,25,26,27,28. 内吞蛋白A（下文简称endophilin）水平降低的小鼠模型，该蛋白是网格蛋白介导的内吞作用中的关键因子13,21,29,30,31,32,33,45 非网格蛋白依赖性内吞作用34表现出神经退行性变以及随年龄增长的运动活动能力损伤13,21有三个基因编码内陷蛋白家族：endophilin 1、endophilin 2 和 endophilin 3。值得注意的是，内陷蛋白缺失所导致的表型会因缺失的内陷蛋白基因数量不同而表现出显著差异。13,21尽管三种内陷蛋白（endophilin）基因全部三重敲除（triple knock-out, KO）会导致小鼠在出生后数小时内死亡，且缺乏内陷蛋白1和2的小鼠无法正常生长并在出生后3周内死亡，但在这三种内陷蛋白中任一种的单基因敲除均未在测试条件下表现出明显表型。21其他内陷蛋白突变基因型表现出寿命缩短，并随着年龄增长出现运动功能障碍13例如，endophilin 1KO-2HT-3KO 小鼠在3月龄时即表现出行走异常和运动协调障碍（通过运动学步态分析和转棒实验检测），而其同窝对照 endophilin 1KO-2WT-3KO 动物仅在15月龄时才出现显著的运动协调能力下降13由于这些模型表型具有高度多样性，有必要确定并应用一种能够整合多种挑战的测试方法，以综合评估动物的运动能力、认知能力以及年龄相关因素。本文详细描述了利用运动学步态分析来评估表现出神经退行性变化的小鼠模型中运动功能障碍的发生与进展的实验操作流程。即， 内吞蛋白突变体。这包括在不同年龄和不同严重程度的运动障碍情况下测量步态参数。

<table><tbody><tr><td>DigiGait</td><td>Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA</td><td></td><td>硬件配套提供 DigiGait 步态成像系统及分析软件</td></tr><tr><td>不透明毯子或深色布料</td><td></td><td></td><td>覆盖测试舱，以减少动物的暴露感和应激反应</td></tr><tr><td>天平</td><td>例如 Satorius</td><td></td><td>精度为 0.1 g、最大载重至少 100 g 的天平</td></tr><tr><td>红色指画颜料</td><td>例如 Kreul 或 Staedtler</td><td></td><td>用于增强足掌与动物&amp;rsquo;身体之间的对比度</td></tr><tr><td>小型画笔</td><td></td><td></td><td>柔软的刷子，用于将指画颜料涂抹到动物足掌上</td></tr><tr><td>稀释的洗涤剂</td><td></td><td></td><td>用于清洁</td></tr><tr><td>消毒剂，例如 Meliseptol 或 70% 乙醇</td><td>例如 B.Braun</td><td></td><td>用于消毒</td></tr></tbody></table>

神经退行性小鼠模型中年龄依赖性运动障碍的步态分析

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

运动行为测试常用于确定啮齿类动物模型的功能相关性，并测试在这些动物中开发的新疗法。具体而言，步态分析能够重现人类患者中观察到的与疾病相关的表型，尤其是在影响运动能力的神经退行性疾病中，如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）等。在早期相关研究中，步态参数的测量工作繁琐，且依赖于难以控制的因素（例如，奔跑速度、持续奔跑状态）。腹侧平面成像（VPI）系统的出现使得大规模开展步态分析成为可能，从而使该方法成为评估啮齿类动物运动行为的有力工具。本文详细介绍如何利用运动学步态分析来研究神经退行性小鼠模型中运动功能障碍随年龄进展的变化过程；以终蛋白（endophilin）水平降低的小鼠品系为例，这类小鼠的神经退行性损伤会随年龄增长而逐渐加重。

为了说明运动学步态分析的应用，我们对随年龄增长的野生型 C57BL/6J 小鼠以及若干内吞蛋白突变系小鼠进行了步态分析，所用仪器和软件均为商业化产品（详见材料表）。在此实验装置中，置于透明跑台下方的高速摄像机记录小鼠的奔跑过程（图 1A）。软件通过识别红色足掌与白色或黑色毛发之间的对比度实现追踪。由于实验小鼠毛色为深褐色，我们使用红色指画颜料将所有实验个体的足掌涂成红色。实验在不同的跑步速度下进行测试：慢走（10 cm/s）、奔跑（20 cm/s）和快速奔跑（30 cm/s）。测量了足掌与跑台接触的面积以及接触时间和悬空时间。基于这些数据，计算出反映步态节律（例如，摆动/支撑时间、制动/推进相）或姿势特征（例如，足角、SW）的相关参数（图 1B）。
我们进行步态分析...

本研究中，我们展示了基于腹侧平面成像的运动学步态分析方法，用于监测小鼠模型（例如，内吞蛋白突变小鼠品系）随年龄增长出现的运动协调细微变化以及神经退行性病变的进展。

运动行为测试常用于确定啮齿类动物模型的功能相关性，并用于在这些动物中测试新开发的治疗方法。

该方法有助于回答衰老与神经退行性疾病研究中的关键问题，例如步态和运动异常随年龄增长的发生与发展，特别是在神经退行性疾病的小鼠模型中。此类研究结果可转化为对神经退行性疾病患者运动功能障碍的更深入理解，例如帕金森病或共济失调患者。采用基于视频的步态分析的主要优势在于，它能够同时研究神经退行性疾病小鼠模型中细微和严重的运动功能障碍。首先通过仔细检查每只动物并在天平上称重来评估其健康状况。用刷子将红色指画颜料轻轻涂抹在动物的足部。将动物放入一个备用的清洁笼子中，等待颜料干燥。接下来，在设备右上方面板上设定跑步机的速度。然后将动物放入测试舱内，并用深色布料覆盖，使每只动物适应一到两分钟。通过将跑步机照明旋转开关转至开启位置，打开测试舱内的灯光。稍微打开盖子，以便在实验过程中观察动物。启动跑步机约半秒钟，以提醒动物任务即将开始。将跑步机旋转开关拨至前进位置，启动跑步机。然后，点击成像软件中的“记录”按钮。当动物以稳定状态奔跑时，持续记录至少五秒钟，然后停止跑步机。通过点击成像软件中的“停止”按钮结束记录，并将跑步机的旋转开关转回关闭位置。接下来，单击成像软件中的“编辑”按钮，打开一个菜单，可在其中设置视频片段的起始点和结束点。使用屏幕底部的滑块浏览视频。要将当前时间点设为起始点或结束点，请分别单击“从帧编号”和“到”。确保该片段包含动物以恒定速度稳定奔跑时每只爪至少七步，或总共至少十四步。最后，输入动物编号、出生日期、体重和性别。将数据保存至计算机或服务器上的指定位置。基于视频的步态分析原理是随时间测量每只脚爪与表面接触的爪垫面积。从录制的视频中可提取多种步态动力学和姿势参数，例如摆动时间、支撑时间与支撑宽度、步长和步频。其他步态特征，如共济失调系数或步角变异性，可基于这些原始测量数据进一步计算得出。通过启动分析软件并点击“选择研究文件夹”来开始视频分析，以选定包含已录制视频的文件夹。选择其中一个视频，然后点击“开始”。使用重绘功能选定小鼠奔跑的区域。注意：该区域应仅包含小鼠和白色背景。接下来，在长度和宽度输入框中输入数值，以调整用于排除动物吻部周围红色区域的掩膜，避免其参与分析。调节“滤除噪声”和“滤除毛发及深色斑块”滑块，以优化黑白爪印图像。对于黑色动物，将“滤除噪声”滑块设置为800至950；对于棕色或白色动物，则设置为700至800，具体数值取决于动物毛发的确切颜色，然后选择“确定”。然后选择一个已通过首次调整的视频，并点击“Go”功能以开始视频分析。接着，选择一个已分析的视频并点击“Go”。注意，此时可以观察到每个独立脚爪随时间与传送带接触的脚印区域。要比较原始视频与所选区域的计算脚印，请选择“Play Video”功能。要修正小的错误，请使用“修正”、“连接”或“删除”选项。使用“修正”选项可删除错误的信号。单击一次以放大至相关区域，第二次单击标记要删除对象的左边界，第三次单击标记右边界。使用“连接”选项来合并两个信号。单击一次以放大相关区域，然后在两个对象中间双击以进行合并。使用“删除”选项可从分析中完全移除时间点。单击一次以放大至相关区域，第二次单击标记需去除区域的左边界，第三次单击标记右边界。然后选择“下一肢体”以依次处理四个肢体。注意，在对最后一只爪子点击“下一肢体”后，软件将完成分析，并在四个屏幕上显示该动物的结果。最后，当一个实验的所有视频分析完成后，选择所有视频并点击“重新组织结果”以导出结果。导出的文件中会计算并列出约 50 个步态参数。按组别、年龄和跑步速度对结果进行排序，并分别独立分析这些条件下的数据。在对野生型小鼠随年龄增长进行的步态分析中，结果显示，以标准化动物宽度计算的站立相宽度不随年龄增长而改变。然而，野生型动物的后肢双支撑时间及肢体负荷随年龄增长而增加。此外，尽管所有测试的小鼠在一个月大时均能以每秒30米的速度奔跑，但内吞蛋白突变体小鼠随着年龄增长出现奔跑能力缺陷。此外，内陷蛋白突变体会导致步态节律受损。例如，随着小鼠年龄增长，内陷蛋白突变体的推进时间会缩短。在进行该操作时，需要牢记最关键的步骤是原始视频的录制。所有进一步的分析都依赖于高质量的视频。步态分析是一种对神经退行性疾病小鼠模型的步态和运动行为进行分类的有用方法。然而，该方法无法充分评估运动行为的某些方面，例如肌肉力量。因此，有必要将基于视频的步态分析与一系列其他运动行为测试（如握力测试和横梁行走测试）相结合。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在随年龄增长而出现运动功能障碍的小鼠模型中进行步态分析。

gait-analysis-age-dependent-motor-impairments-mice-with

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变性小鼠年龄依赖性运动障碍的步态分析

可通过平衡木实验评估精细运动协调能力的缺陷。小鼠在平衡木上的表现通过其通过平衡木的速度以及在平衡木上打滑的次数来量化。...

使用平衡木评估小鼠的运动平衡与协调能力

在本视频中，我们介绍了用于评估小鼠步态和运动协调能力的足迹测试方法及相关分析流程。...

通过足迹分析评估步态：一种检测小鼠运动协调能力的方法

矢状面运动学步态分析可提供关于运动执行方式的高度精确信息。本文描述了这些技术在识别经受自身免疫介导脱髓鞘小鼠步态缺陷中的应用。这些方法也可用于表征其他具有运动功能障碍的小鼠模型的步态缺陷。...

C57BL/6小鼠经MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎后的矢状面运动学步态分析

在神经病理性动物模型中精确评估疼痛反应对于研究疼痛性疾病的病理生理机制以及开发新型镇痛药物至关重要。本文介绍一种利用自动化步态分析系统客观、灵敏地测定啮齿类动物后肢足底感觉功能的方法。...

慢性缩窄性损伤小鼠的自动化步态分析

足迹分析是一种低成本的替代方法，可用于研究人员量化小鼠运动异常，替代数字化步态分析程序。由于其速度快、操作简单且具有纵向研究潜力，该方法非常适合小鼠模型的行为表型分析。...

低成本步态分析用于神经肌肉疾病小鼠模型的行为表型鉴定

自动步态分析是评估周围神经损伤和脊髓挫伤动物模型功能恢复的可行工具。尽管只需一次设置即可评估多种实验模型的运动功能，但对动物进行精细的硬件和软件调整及训练至关重要。...

用于评估外周神经或脊髓挫伤损伤啮齿类动物功能恢复的自动化步态分析

本文介绍了RatWalker系统，该系统通过重新设计MouseWalker装置，以适应大鼠更大的体型和体重。该系统采用全内反射失配（FTIR）技术、高速视频采集以及开源分析软件，用于追踪并量化步态参数。...

应用 RatWalker 系统对帕金森病遗传性大鼠模型进行步态分析

本论文介绍了一组高度可重复的行为学实验，用于验证Angelman综合征小鼠模型。...

Angelman综合征小鼠模型的行为学表征

提供了一种利用 MouseWalker（MW）工具箱对自由行走小鼠的运动模式进行定量描述的实验流程，该流程涵盖从初始视频录制和追踪到后期定量分析的各个环节。采用小鼠脊髓挫伤模型以展示 MW...

利用MouseWalker量化脊髓损伤小鼠模型中的运动功能障碍

本研究描述了一种利用机器学习检测啮齿类动物模型（包括TgF344-AD大鼠）运动功能障碍的精细运动行为测试方法。...

一种用于在神经退行性疾病临床前模型中研究关节运动学的精细运动任务

学习使用运动学步态分析技术监测小鼠模型中运动协调性和神经退行性病变进展的方法。该技术通过腹侧平面成像捕捉细微运动障碍，为理解帕金森病等疾病的运动功能损伤提供重要见解。

神经退行性小鼠模型中年龄依赖性运动障碍的步态分析

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