激光捕获显微切割分离新鲜冷冻人体肠神经节的优化
June 14th, 2018
该协议的目的是获得高完整性的 RNA 样本从无固定的, 新鲜切除的人肠道组织, 利用激光捕获显微切割 (LCM) 分离。该协议包括制备人体肠道组织、cryosectioning、乙醇染色和脱水、LCM 和 RNA 提取的闪光冷冻样品。
这种方法可以帮助回答有关肠道神经系统的关键问题，例如成人肠道中肠神经节的表达谱。该技术的主要优点是可用于从人肠神经节中获得高产量的 RNA，同时最大限度地保持 RNA 质量。从切成 20 厘米长的肠道组织开始。
首先，修剪掉脂肪和结缔组织。避免划伤浆膜，这可能导致肌间神经丛的结构损伤。接下来，沿着修剪后的样品的整个长度做一个纵向切口，最好在肠系膜附着部位。
然后，解剖并丢弃结肠中的绦虫大肠杆菌，以便组织变平。现在，将肠子张开，粘膜面朝下，放在冰凉的砧板上。然后，沿组织的全长切割 1.25 厘米宽的条带。
切割时，将每块转移到冷冻组织储存溶液中进行临时储存。接下来，将每条条带切成 2 到 1.5 厘米长的段。将条带切成段后，将段吸干。
重要的是，组织必须非常干燥，这样在组织冻结时就不会在组织上形成冰晶。现在，将干燥的组织块（粘膜面朝上）放在冰冷的一次性塑料模具上。然后，使用弯曲的镊子将每块压平，以去除滞留的气泡。
组织在变平时会膨胀。将组织段压平后，在冷冻前评估其厚度。如果需要，将标本的边缘向内推，直到肠道标本接近其原始厚度。
现在，将加载的基模转移到干冰和 2-甲基丁烷的浆料上。组织应在 30 到 60 秒内完全冻结。然后，立即使用保存在干冰上的冷抹布擦干模具底部。
现在，检查样本。记下任何看起来不平坦的样本。接下来，用预先贴有标签的铝箔包裹模具，并在使用前冷却。
然后，用一层保鲜膜覆盖铝箔，以尽量减少脱水。将样品保存在冰上，直到它们可以在零下 80 摄氏度下储存。准备好所需的材料后，将一堆 3 到 5 毫米的 TFM 倒在一个大型低温恒温器样品架上，然后立即将肠道样品（浆膜面朝上）转移到 TFM 上。
在室温下几秒钟后，将样品架转移到干冰中，并用干冰粉覆盖。切片前，请确保 TFM 位于肌间神经丛平面下方。接下来，将样品架安装到低温恒温器样品头中，并将样品与低温恒温器刀片对齐。
使肌间神经丛的平面平行于切割刀片。现在，通过浆膜和纵肌制作 8 微米切片，直到到达肌间神经丛。要找到肌间神经丛，请安装样品并用水性染料（如 1% 结晶紫）染色。
要继续，请确定纵向肌肉层和圆形肌肉层之间的交界处。在切片开始时，浆膜将以结缔组织的存在为标志。一些剩余的肠系膜脂肪也可能存在于浆膜沿线。
然后，外纵肌层的片材变得可见一旦到达纵肌层和环状肌层之间的边界，就会观察到肠神经节的一部分。在接下来的几个部分中，肌房神经丛将变得非常明显，单个切片内存在大片神经节。现在，收集用于激光捕获显微解剖的连续切片。
将 PEN 玻片在低温恒温器中冷却 5 到 10 秒，然后使用它们安装切片。最好的部分会有很多神经元和神经胶质细胞。现在，按照文本方案中的说明对切片进行染色，然后脱水。
准备时，将 LCM 帽盒插入 LCM 显微镜载物台。然后，将样品载玻片加载到载物台上并获取载玻片的概览图像。确定 LCM 的所需位置，并将 CAP 加载到载玻片上。
然后，对准红外激光器并调整激光的功率和持续时间，以获得直径为 20 至 30 微米的捕获点。接下来，概述要收集的所需神经节。确保保持在上限上的可收集区域的边界内，该区域显示为绿色圆圈。
对于紫外线切割轨迹勾勒出的每个神经节，调整 IR 点，使每 100 到 500 微米至少有一个 IR 点，以确保当盖子从样品上取下时，神经节将被全部收集。然后，按 IR UV Cut 按钮继续收集所有标记的神经节。收集完成后，将瓶盖移至新位置并重复收集过程。
这可以重复 60 到 80 分钟。当 LCM 帽加载了足够的神经节时，将其转移到质量控制站。如果瓶盖上有碎屑，请使用为 RNA 使用而准备的细头油漆刷将其擦去。
使用移液器吸头去除任何难以去除的碎屑。然后，将盖子固定在装有 230 μL RNA 裂解缓冲液的 0.5 mL 微量离心管上。倒置瓶盖，短暂涡旋，然后将样品在室温下孵育 30 分钟。
然后，以 5， 000 g 或更快的速度将样品离心 5 分钟，然后将微量离心管转移到干冰中。样品现在已准备好进行 RNA 提取。当每个样品拉出两个肠神经节帽时，获得的 RNA 大于 1 ng，足以用于 RNA-Seq，并且 RNA 质量极佳。
所示样品的 RNA 完整性为 8.3。还收集了完整性值为 7.5 和 6.9 的样品。总的来说，超过 95% 的制备样品都足以用于 RNA-Seq。
使用生物信息学管道评估 RNA-Seq 数据集的质量。末端偏差表明样本已成功测序，并且只有适度的 3 个主要偏差。基因生物型图显示测序结果基本一致。
一旦掌握，该技术可用于在短短 8 至 12 小时内从肠道神经节中收集足够质量和数量的 RNA 生物复制品，用于 RNA-Seq。在尝试此程序时，重要的是将人类肠道样本尽可能平放。这将确保您可以收集非常大的人类肠道神经节横截面，这些横截面可通过激光捕获显微切割快速轻松地进行处理。
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概述
本研究概述了一种使用激光捕获微切割（LCM）从新鲜切除的人类肠组织中分离的肠神经节中提取高完整性RNA的协议。该方法旨在研究人类肠道肠神经系统的表达谱，增强我们对胃肠道神经功能的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 分子生物学
- 胃肠病学
背景
- 肠神经系统在胃肠功能中起着关键作用。
- 高质量的RNA对于研究基因表达谱至关重要。
- 激光捕获微切割允许精确分离细胞结构。
- 该技术有助于从完整组织中进行详细的分子分析。
研究目的
- 从人类肠神经节中获得高产量的RNA。
- 在最大程度上减少组织损伤的同时，保持RNA质量。
- 评估人类肠神经系统中的基因表达谱。
使用的方法
- 从人类组织样本中使用激光捕获微切割（LCM）分离肠神经节。
- 处理新鲜切除的肠组织以分离神经节。
- 关键步骤包括冷冻切片、染色和脱水。
- RNA提取遵循LCM技术以实现高RNA完整性。
主要结果
- 该协议为测序获得了超过1纳克的高质量RNA。
- RNA完整性数字表明RNA质量优秀，适合RNA-Seq。
- 超过95%的样本适合用于测序分析。
结论
- 本研究展示了一种从人类肠神经节中分离RNA的有效方法。
- 结果使我们能够更深入地了解肠神经系统的分子机制。
- 该方法对胃肠道疾病和神经功能研究具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of enteric ganglia from human intestinal tissue, providing high-integrity RNA for transcriptomic analysis. This approach supports target validation in gastrointestinal neuroscience by delivering disease-relevant molecular data from primary human tissue. The method reduces biological noise and enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on enteric nervous system pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of enteric ganglia for RNA-seq analysis.
- Operational Value: Preserves RNA integrity while minimizing contamination from surrounding tissue layers.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct measurement of gene expression in disease-relevant human neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-quality RNA inputs suitable for reproducible transcriptomic assays.
- Operational Value: Uses PEN-membrane slides and ethanol-compatible dyes to improve capture efficiency and RNA yield.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA integrity number) for assay qualification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue data that bridges discovery and preclinical validation.
- Operational Value: Yields sufficient RNA quantity (>1 ng per sample) for downstream sequencing applications.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling profiling of enteric nervous system targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The LCM workflow fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification prior to lead identification. It generates quantitative molecular readouts that inform go/no-go decisions in target selection. The method produces reusable, standardized tissue preparations that support enterprise-scale screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating pure neuronal populations for molecular profiling.
- Screening: Delivers standardized, high-integrity RNA samples enabling reliable compound effect measurements.
- Analytics: Provides RNA integrity number (RIN) and yield metrics to assess sample quality before sequencing.
- Translational Research: Connects human tissue data to preclinical models through conserved gene expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable protocol for isolating neural tissue across multiple tissue blocks and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid acquisition of human-validated molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on human enteric nervous system expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryosectioning, and laser-capture microdissection.
- Dependent on cryostat, LCM system, and RNA-compatible staining reagents (e.g., Cresyl Violet).
- Necessitates standardized protocols for tissue flattening, freezing, and section orientation.
- Must account for tissue variability across donors and intestinal regions when scaling.
- Limited by RNA degradation risks if samples are not processed rapidly or kept sufficiently dry.
