Name: 激光捕获显微切割分离新鲜冷冻人体肠神经节的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习使用激光捕获显微切割技术从新鲜冷冻人体肠道组织中分离肠神经节，以获取高质量RNA用于转录组测序分析。该方法可高效保存RNA完整性，为研究肠神经系统基因表达提供可靠方案。

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我们感谢为本研究提供支持的捐献者及其家属。同时感谢国际医学研究所和田纳西器官捐献服务机构的工作人员，他们在本研究所需组织样本的采集协调工作中提供了帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 OT2-OD023850（授予 EMS2）以及 NIH T32-DK007673 为 AMZ 提供的津贴支持。我们感谢范德堡大学转化病理共享资源中心工作人员提供激光显微切割仪的使用权限，并在组织制备方面给予指导。范德堡组织病理共享资源中心部分由 NIH 资助项目 P30-CA068485-14 和 U24-DK059637-13 支持。我们感谢华盛顿大学医学院遗传学系基因组技术应用中心在基因组分析方面提供的帮助。基因组技术应用中心部分由国家癌症研究所（NCI）癌症中心支持基金 #P30 CA91842（授予西特曼癌症中心）以及国家研究资源中心（NCRR，隶属于美国国立卫生研究院 NIH）和 NIH 医学研究路线图资助的 ICTS/CTSA 基金 #UL1TR002345 支持。本出版物的内容完全由作者负责，不代表 NCRR 或 NIH 的官方观点。

本文所述所有方案均已获得范德堡大学机构审查委员会（IRB）批准。
1. 组织到达前的准备工作
<ol>
	<li>获得适当的机构审查委员会批准，并与人体器官捐献机构协调，获取符合研究所需全部标准的捐献者的新鲜切除、未固定的肠道组织。 
	&#8203;注意：本方案可经调整后用于小鼠及其他啮齿类动物模型。
	<ol>
		<li>每个肠段切除后，立即用预冷的PBS或组织保存液彻底冲洗肠腔，以去除残留的腔内物质或粪便。</li>
		<li>冲洗并弃置废液至适当的生物危害容器后，将组织浸入足量的组织保存液中（例如肠道组织体积的3-5倍），并置于单独标记的防水塑料容器内，保持浸没状态，置于冰上或冷藏保存至使用。</li>
		<li>在组织采集后的18至26小时内进行处理，以防止RNA发生显著降解。 
		注：根据肠段的清洁程度和保存情况，可能可以延长我们建议的时间限制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提前准备好本方案中指定的人体组织采集所需的所有材料（参见 材料表 有关更详细的产品信息，请参见相关资料。确保始终佩戴所有必需的个人防护装备。</li>
	<li>准备好干冰桶以及干冰与2-甲基丁烷混合的干冰浆，如图所示 图1.
	<ol>
		<li>将足量的干冰粉碎，填满4个标准圆形冰桶和1个矩形冰桶。其中一个标准冰桶的干冰表面需放置小尺寸（11 × 21 cm）的实验室用纸巾。如有可能，使用全新未开封的实验室用纸巾盒。</li>
		<li>在干净的矩形冰桶中将2 L干冰粉碎，制成干冰浆。</li>
		<li>将预冷的2-MB加至干冰表面，使用移液器吸头盒盖轻轻混合并压平浆状物，使浆状物表面形成一个凹槽，凹槽周围由矩形桶两侧较大的干冰块包围。</li>
		<li>在冰桶边缘放置几块薄的干冰，以促进更快的冷冻。干冰浆桶内应留有足够空间，可同时松散放置≥4个底模。
		<ol>
			<li>可选地，将冰桶叠放在另一个装满冰的矩形冰桶内 &#188; 用干冰。这种放置方式有助于更好地隔热干冰悬液，并防止在操作过程中频繁调整干冰和2-MB。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将干冰桶按以下顺序排列成流水线：1）干冰悬浆桶，2）实验室组织-干冰桶，3 &amp;#38; 4) 普通干冰桶，5) 矩形干冰桶（图1A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 快速冷冻人肠道组织的制备
注意：整个过程可能需要45至80分钟每个肠段，具体时间取决于肠组织的质量。我们还建议在进行激光捕获显微切割（LCM）之前，收集质量控制样本以评估RNA质量和组织学特征。
<ol>
	<li>在大托盘中装满湿冰，并将手术切板放在干冰上。</li>
	<li>在此设置中，将一个500 mL和一个100 mL的烧杯置于冷保存液中冷却，用于存放组织及修整后的组织片段。预先将底模放置在切片板上冷却，以便随时接收组织。</li>
	<li>收到新鲜肠道组织后，倒掉组织运输所用的培养基，并将其保留在预冷的烧杯中。在这些烧杯中需预留一定空间，用于暂时存放肠道组织及后续步骤中修剪好的组织片段。</li>
	<li>将肠段切割至约 20 cm 的长度，可提供充足的组织（40–60 cm2）以生成用于下游应用和质量控制的RNA样本。根据组织完整性的不同，可能只需更短的组织长度即可完成用于下游处理的RNA分离即， 5 cm 肠道</li>
	<li>使用手术剪从肠道上修剪去除脂肪组织和结缔组织。肠浆膜表面残留的脂肪组织会影响后续步骤中组织的充分展平。在去除脂肪和结缔组织时，应仔细修剪，避免损伤浆膜，以防对肌间神经丛造成结构损伤，或导致组织外表面在切片时展平不均。</li>
	<li>沿肠样本全长做一纵向切口，优先选择在肠系膜附着处进行。</li>
	<li>从结肠上解剖并弃去结肠带，使其在解除张力后更易于展平。</li>
	<li>将肠组织黏膜面朝下展开于预冷的切板上，沿组织全长切割成1.25厘米宽的条状。 
	注意：肠道组织在修剪后常会膨胀，因此应相应调整此尺寸。</li>
	<li>将条带暂时储存在预冷的组织保存液中。 
	注意：我们使用Belzer UW冷保存液，因为它具有较长的保存期限，相对经济实惠，且可在需要前于室温下储存。</li>
	<li>从冷藏保存液中取出一段组织，并将其切成约1.5-2厘米长的片段。</li>
	<li>用实验室擦拭纸快速吸干肠段表面的多余液体，以防止在速冻过程中肠浆膜表面形成冰晶。若组织未充分干燥，将难以获得高质量的肌间神经丛切片。</li>
	<li>将吸干后的肠组织片黏膜面朝上放置于预冷的大型一次性塑料底模（37 mm x 24 mm x 5 mm）中。</li>
	<li>用弯头镊子轻轻拉伸组织并将其平整地铺在底模表面，同时轻压以排出浆膜下可能滞留的气泡。注意组织在展平过程中会膨胀。如有需要，可对组织片段进行修剪，并将剩余样本切成更小的尺寸。 
	注意： 如果组织过度拉伸，会扭曲肌间神经丛。在冷冻前，待所有气泡去除后，评估样本的厚度。如有需要，将标本边缘向内推压，直至肠组织样本接近其原始厚度。</li>
	<li>将装有组织的底模置于干冰与2-MB混合液的表面。组织应于30-60秒内完全冻结，具体时间取决于肠段的大小与厚度。</li>
	<li>用预先在第二个干冰桶中预冷的实验室纸巾快速擦拭底模底部，以去除残留的2-MB。</li>
	<li>将干燥的样本转移至第三个盛有干冰的容器中，并埋入干冰表面以下，直至准备进行包裹。</li>
	<li>在包裹前迅速观察底模底部，以检查样本制备的质量。注意记录任何不平整或含有大气泡的样本，此类样本应避免用于冷冻切片和激光捕获显微切割。</li>
	<li>将样本包裹在预先标记好的铝箔中，铝箔置于盛有干冰的桶内，确保在完全冷冻的条件下进行组织包裹。</li>
	<li>用一层塑料膜包裹样本，以减少在 -80 ℃ 保存期间的组织脱水 &#176;C.</li>
	<li>将样本存放在矩形桶中，直至准备转移至冷冻机。</li>
	<li>预先标记并预冷冻存盒至 -80 &#176;样本采集后立即用于储存。</li>
	<li>在进行激光显微切割（LCM）之前，从每段肠组织中取少量组织用于RNA完整性评估。
	<ol>
		<li>为每个片段预先标记一个2 mL无RNase的离心管，管内装有≥500 &#181;裂解缓冲液 L。我们建议使用RNA提取试剂盒 &#34;D&#34;，列于 材料表.</li>
		<li>将一小块（2 mm × 2 mm）肠组织在标准组织微型匀浆器中匀浆（20–40 秒，直至无组织碎片残留）。随后，立即在干冰上冷冻RNA裂解液，并于-80℃保存。 &#176;C，然后进行RNA提取。</li>
		<li>可选地，将部分切片嵌入组织冷冻介质（TFM）中作为备份。按照本节所述完全相同的方法制备组织切片，但在速冻前先将样本浸入底模中的 TFM 内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 冷冻切片
<ol>
	<li>在冷冻切片前，准备好染色和脱水所需的所有材料，并将目标组织样本从 -80 ℃ &#176;将C冷冻机中的样本放入装有干冰的桶中。</li>
	<li>将冷冻切片机调节至最佳切片温度（-18 至 -22 ℃）以备使用 &#176;C）用100%乙醇擦拭表面，并用RNase去污染溶液处理刀片和刷子托盘。</li>
	<li>为使样本最佳地粘附于样品台，采用以下方法。
	<ol>
		<li>将镊子置于干冰中至少30秒，然后取出并打开肠组织样本，将其浆膜面朝上放置在干冰表面。</li>
		<li>将3-5 mm厚的组织冷冻介质（TFM）倒入大型冰冻切片机样本托上，立即把肠组织样本浆膜面朝上置于TFM上。</li>
		<li>将样本架迅速转移至干冰上，并在室温下使TFM与样本黏附2-5秒后，用粉末状干冰覆盖。确保TFM保持在肌间神经丛平面以下。 
		&#8203;注意：理想情况下，在样本未发生解冻的情况下，肠黏膜的外表面应在TFM开始冻结前完全贴附于TFM上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本架安装到冷冻切片机的样本头中，并将样本与冷冻切片机刀片对齐，使肠肌丛的切面与切片刀刃平行。</li>
	<li>将冷冻切片机的切片厚度设置为 8 &#181;m. 完美对齐样本的目的是在每张切片上获得尽可能大的肌间神经丛表面积。该厚度通常适用于人和啮齿类动物组织，但可根据需要进行调整。</li>
	<li>切至浆膜和纵行肌层，直至肠肌间神经丛。
	<ol>
		<li>为定位肌间神经丛，将样本切片贴附于载玻片上，并使用水溶性染料（如1%焦宁蓝或甲苯胺蓝）对切片进行染色。 等等.</li>
		<li>在40-2000倍放大倍数下，于光学显微镜下观察切片，以识别纵行肌与环形肌层之间的交界处。显微镜参数见下文 材料表切片开始时，浆膜由结缔组织的存在标记出来。浆膜上可能还残留部分肠系膜脂肪。随后出现外层纵行肌层的薄片。当到达纵行肌层与环形肌层交界处时，即可观察到部分肠神经节。 
		注意：在接下来的几个切片中，肌间神经丛将变得非常明显，单个切片内将出现大范围的神经节群图2C如果在切片开始时组织未能完全展平，则在任意时刻每个切片中仅会包含部分神经节。有时，尽管组织外观完全平整，肠样本身固有的肌间神经丛可能存在不均匀分布，十二指肠样本尤其如此。根据我们的经验，这类样本使用激光捕获显微切割（LCM）处理所需时间可能显著延长，但在单日实验时间内仍可收集到足量的RNA。肌间神经丛在不同样本中的确切位置可能存在较大差异，这取决于组织类型及其在冷冻前的处理方式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始采集用于激光捕获显微切割（LCM）的连续切片，最佳采集方案应使每张载玻片上的神经元和胶质细胞数量最大化。根据样本表面积的大小，可将多个切片合并至同一张聚萘酯（PEN）膜载玻片上。</li>
	<li>将切片贴附至聚乙烯萘膜（PEN膜）载玻片上，并在冷冻切片机中短暂预冷5-10秒。贴附时应仅使组织轻微融化，以最大程度地保持RNA完整性。</li>
</ol>
4. 染色
注意：有关染色过程的概述，请参见表1。所有溶液均在标准的50 mL圆锥形离心管中配制。对管外表面使用RNase去污染溶液处理似乎并不能改善结果（数据未显示）。
<ol>
	<li>至少提前一天配制含4%焦宁蓝（Cresyl violet）的95%乙醇饱和溶液，并在装入注射器前充分重悬焦宁蓝。 
	&#8203;注意：染色效果不佳时可能需要降低乙醇浓度，具体参见讨论部分。我们尚未测试染色过程中使用50%或75%乙醇是否会显著降低RNA完整性。焦宁蓝对光敏感，应避光保存。</li>
	<li>将肠肌间神经丛切片贴附于载玻片后，立即将载玻片浸入装有预冷至-20 °C的95%乙醇的锥形瓶中，持续30秒。
	<ol>
		<li>若切片在前一步骤中未能完全贴附于载玻片，可用戴手套的手轻轻加热载玻片底部（载玻片与手套之间应垫上实验室擦拭纸），以确保完全贴附后再浸入95%乙醇。该溶液可重复使用至少3–6次，且不会降低RNA完整性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片面朝上放置于经预处理的无RNase容器上方的实验室擦拭纸上8。</li>
	<li>用3 mL注射器预先抽取4%焦宁蓝溶液，并连接0.2 µm注射器滤器。 
	注意：推荐使用醋酸纤维素滤器。</li>
	<li>直接将6–10滴染液滴加至组织切片上8，染色10–30秒，或直至脱色时染料保留量适中。染色过程中应手动轻轻旋转载玻片容器，确保组织切片均匀覆盖染液。</li>
	<li>倒出染液后，立即将载玻片浸入75%乙醇瓶中进行脱色。反复浸没载玻片，直至大部分过量染料脱离样本，此过程可能需要10–20秒。</li>
	<li>通过反复将样本浸入95%乙醇瓶中10秒完成最终脱色。反复浸没样本，直至所有过量染料完全去除。
	<ol>
		<li>根据需要调整脱色时间，以优化神经节染色效果。若脱色过度，样本将过于透明，难以观察。 
		注意：本染色方案基于多篇文献5,8,10,11优化而来，在获得满意结果前需进行适当调整。因此，必要时应调整染液及脱色过程中乙醇的浓度，以获得最佳效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 脱水
<ol>
	<li>立即将载玻片浸入100%乙醇中2-3次，总时长为10-20秒。</li>
	<li>将载玻片浸入无水100%乙醇中至少30秒。由于无水乙醇具有很强的吸湿性，应在操作开始前向100%乙醇瓶中加入分子筛（8-12目），以去除吸收的水分，从而更彻底地脱水样本5。</li>
	<li>反复将载玻片浸入二甲苯中15-20秒。此步骤可完全去除载玻片上的乙醇层。应提前向二甲苯管中加入分子筛，以充分吸附过量乙醇和水分子5。 
	警告：二甲苯被归类为对眼睛和上呼吸道有刺激性的物质，应在化学通风橱中使用。</li>
	<li>将载玻片浸入二甲苯（含分子筛，8-12目）中至少10分钟。 
	注意：如有需要，可在本步骤后短暂中断。样本可在二甲苯中放置4-5小时，而不会对染色、激光捕获显微切割或RNA得率/完整性产生不利影响。</li>
	<li>可选：此时可单独制备若干额外的载玻片。若在完成所有已制备载玻片的激光捕获显微切割后需进行第二轮切片，则由于组织表面脱水，可能需要重新修整冷冻切片机中的组织。在获得可用切片前，可能需要丢弃1至4个切片。</li>
</ol>
6. 激光显微切割（LCM）
<ol>
	<li>将载玻片从二甲苯中取出，在化学通风橱中晾干至少1分钟。将激光显微切割（LCM）帽盒插入LCM显微镜载物台上，将载玻片装入载物台，并获取载玻片的概览图像。</li>
	<li>确定激光显微切割的目标位置，并将切割帽装入载玻片位置。</li>
	<li>校准红外（IR）激光，调节其功率和持续时间，形成直径为20-30 µm的捕获点。</li>
	<li>定位紫外（UV）激光，并设置合适的切割速度和强度。</li>
	<li>使用LCM软件勾画拟采集的肠神经节轮廓，确保轮廓位于切割帽可收集区域范围内（在软件程序的载玻片概览图中以绿色圆圈标示）。</li>
	<li>在每一条轨迹中，调整红外（IR）激光点，使每100-500 µm范围内至少有一个IR点。</li>
	<li>按下IR/UV切割按钮，开始收集所有标记的肠神经节。</li>
	<li>完成收集后，可将切割帽移至新位置重复收集过程，或当切割帽已充分收集肠神经节（或达到推荐的60-80分钟时限）时，将切割帽转移至质控（QC）工作站进行检查。</li>
	<li>若切割帽表面存在碎片，使用经RNase去污染溶液预处理、无核酸酶水冲洗并完全干燥的细头画笔轻轻擦拭去除。</li>
	<li>通过肉眼或在明场显微镜下放大观察，仔细检查切割帽，确保所有碎片均已清除。若使用预处理画笔无法去除碎片，则使用无RNase的细小移液器吸头轻轻刮除。</li>
	<li>将切割帽牢固固定在含有230 µL RNA裂解缓冲液（RNA提取试剂盒“B”的RLT缓冲液，添加β-巯基乙醇至终浓度10 µL/mL）的0.5 mL微量离心管上。</li>
	<li>倒置切割帽，短暂涡旋振荡，室温孵育30分钟。</li>
	<li>以≥ 5,000 x g离心5分钟，随后将微量离心管置于干冰上。 
	注意：本步骤可暂停。RNA裂解液可在-80 °C保存至少1周，RNA降解程度不显著。若同日进行RNA提取，则将样品置于冰上冷藏，待后续提取使用。</li>
	<li>在将载玻片从二甲苯中取出后，所有额外的收集操作应在推荐的最长80-90分钟时限内完成。由于脱水切片暴露于环境湿度中，RNase可能逐渐重新激活。限制收集时间可最大限度减少此类影响，保持RNA完整性。</li>
</ol>
7. RNA 提取
<ol>
	<li>准备一个无RNase的工作站用于RNA提取。</li>
	<li>根据RNA提取试剂盒的说明书准备所有离心管和试剂。 
	注意：尽管目前有多种可用于激光显微切割（LCM）后RNA分离的试剂盒，但我们使用材料列表中列出的RNA提取试剂盒“B”获得了最佳效果。RNA提取试剂的并列比较见图5。</li>
	<li>从-80 °C冰箱中取出样品，并在37 °C水浴中快速解冻。</li>
	<li>立即对解冻的样品涡旋震荡2-3秒，以均匀分散硫氰酸胍盐。</li>
	<li>向每个样品中加入等体积的70%乙醇。如有必要，可将2个或更多裂解液合并，以达到足够的RNA浓度。</li>
	<li>按照RNA提取试剂盒说明书中的制造商操作步骤进行，使用专为显微切割样品优化的方案。</li>
	<li>在最后一步中，将RNA洗脱至推荐的最小体积的无核酸酶水中（14 µL）。</li>
	<li>RNA提取完成后，将每个样品的1-2 µL RNA分装至新的预标记无RNase离心管中，用于通过微流控设备进行质量评估/质量控制，该设备可检测微量RNA，例如Bioanalyzer。另取1 µL分装至另一离心管中，用于高灵敏度RNA定量试剂盒的定量。
	<ol>
		<li>根据需要调整这些步骤，以获得足够量的RNA用于下游分析（i.e.，在RNA提取前合并更多数量的LCM收集帽）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将RNA储存于-80 °C，直至收集到足够数量的样品用于下游分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法能够高效收集大量肠神经节，作为提取RNA用于RNA测序的来源。本文在最大限度保持RNA完整性的前提下，优化并加快了现有方案中的各个步骤。由于本实验流程中所有步骤相互关联，因此必须从研究初期即排除所有问题，并尽可能使所有样本的处理条件保持一致，以获得可靠的RNA测序结果。
从实验开始时起，如果器官捐献后组织采集与实验室接收处理之间的时间间隔（冷缺血时间）过长，RNA的完整性可能受到不利影响。鉴于这一问题，我们惊讶地发现，即使冷缺血时间长达24小时，仍能从肠道样本中提取出高质量的RNA。当肠道样本在低温保存液中被妥善冷藏和储存时，组织完整性和RNA质量可得到极好的保护。我们要求器官采集团队在采集时立即对肠道组织进行灌洗，以限制肠道暴露于消化酶、RNase及其他可能在此期间影响RNA质量的分子。我们发现，若肠道标本未完全灌洗，会显著降低样本的RIN值。
通过采用我们优化的肠道组织样本制备流程，能够避免将样本包埋在TFM中。由于TFM会与乙醇和二甲苯反应生成深棕色沉淀物，干扰肠神经节的观察，因此我们倾向于在样本中排除TFM的使用...

本方法旨在利用激光捕获显微切割技术（LCM）从人肠道组织中获取高质量的肠神经节RNA样本。本文所述方案已优化，可获得适用于RNA测序（RNA-seq）的足够质量和产量的RNA，适用于新鲜切除、未经固定、速冻的人肠道组织。
功能性胃肠道疾病和肠道运动障碍影响着美国四分之一的人口。肠神经系统（ENS）通常被称为“第二大脑1”，在这些疾病中常处于核心地位，因为它在维持肠道稳态和运动功能中发挥着关键作用。目前对肠道运动的干预手段通常仅限于手术切除无神经节或无收缩功能的组织、长期饮食调整和/或药物治疗。令人意外的是，成年个体肠神经系统的完整转录组至今尚未完成测序，这极大地限制了我们识别肠神经系统中可用于药物靶向或干细胞治疗的分子的能力。
目前从人肠神经节中分离RNA的方法相对较少。第一种方法是细胞解离2，该方法需要较高的孵育温度和较长的孵育时间；而这两个因素均已被证实会促进RNA降解并改变转录组2,3。另一种替代方法——激光显微切割（LCM），能更可靠地保持转录组的完整性，并保护RNA的完整性。尽管已有若干研究采用LCM从新鲜冷冻的人类肠道组织中收集神经节4,5,6，但这些方法在实际操作中存在RNA质量与产量不佳、操作极为耗时，或需要对染色或RNA提取技术进行修改等问题。在LCM产品手册中发现的其他旨在保护RNA的LCM方案虽提供了进一步改进7,8，但在应用于肠神经节分离时仍需进行调整8,9。基于上述原因，我们结合这些资源开发了一种优化的实验方案，可从人肠神经节中获得大量高完整性的RNA，具有相对较快的操作流程，并能在大量样本中实现稳定一致的结果。
本研究概述了一套优化的实验流程，可从切除的人类肠道组织来源的肠神经节中分离出高完整性的RNA。我们的方法包含五个关键环节。首先，新鲜切除且未经固定的肠道样本应裁剪至合适尺寸，用实验室吸水纸去除所有多余水分，并置于大底座模具中压平，随后在干冰与2-甲基丁烷（2-MB）混合物上进行速冻。第二，应制备肠道组织的组织学切片，以在载玻片上获得肌间神经丛的完整平面，从而提供大量肠神经节。此步骤的成功在很大程度上依赖于组织制备过程。第三，由于肠神经系统（ENS）中神经节结构的不均一性，需使用聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片6，此类载玻片在激光显微切割（LCM）过程中具有最高的速度与精确度。第四，应选用与乙醇兼容的染料（如焦宁Y）对肠神经节进行染色，以保持RNA的完整性。最后，RNA提取过程对RNA测序（RNA-Seq）的成功至关重要。我们采用的RNA提取方法需满足以下要求：获得高完整性的RNA，当起始材料为少量肠神经节时仍能最大化RNA得率，彻底去除DNA污染，并尽可能保留多种RNA分子种类。
综上所述，本研究中对这些因素的优化显著加快了实验流程，并获得了RNA数量和质量均极佳的肠神经节样本。在大量样本中，实验结果具有高度一致性，表明该方法具有良好的可重复性。此外，我们已利用这些方法成功对数十个肠神经节RNA样本进行了测序。本文所强调的策略也可广泛适用于外周和中枢神经系统中特定神经节或细胞核的激光显微切割，以及其他需要分离高质量RNA的研究场景。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>3 mL注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆底离心管，聚丙烯材质&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模 37x24x5mm</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>5025511</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW&amp;nbsp; 冷储存液</td><td>生命之桥</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>CapSure 宏激光显微切割帽</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>保鲜膜，按压&amp;rsquo;n 封口&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;格拉德&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>N.A.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙酸焦油紫</td><td>Acros Organics</td><td>AC405760025</td><td></td></tr><tr><td>砧板</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>63308</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，190-proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200度</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>手套，加长袖口</td><td>Microflex&amp;nbsp;</td><td>19010144</td><td></td></tr><tr><td>一次性外科手术服</td><td>Kimberly-Clark&amp;nbsp;</td><td>19-088-2116</td><td></td></tr><tr><td>托盘，20 L（大型聚丙烯灭菌盘）</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>1335920B</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes（大号）</td><td>Kimberly-Clark&amp;nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes（小号）</td><td>Kimberly-Clark&amp;nbsp;</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>激光捕获显微切割系统（ArcturusXT）</td><td>ThermoFisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>徕卡冷冻切片机样本头，大型&amp;nbsp; 40 mm&amp;nbsp;</td><td>东南病理仪器服务</td><td>N.A.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜（20X）</td><td>奥林巴斯 UPlanFl 20X/0.50 &amp;infin;/0.17</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜（10X）</td><td>奥林巴斯 UPlanFl 10X/0.25 &amp;infin;/-</td><td>N.A.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分子筛</td><td>Acros Organics</td><td>AC197255000</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 提取试剂盒</td><td>应用生物系统公司</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>研钵与研杵</td><td>Kimble Kontes</td><td>4621973</td><td></td></tr><tr><td>PEN膜LCM切片</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM022</td><td></td></tr><tr><td>无RNase离心管，1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Sigma-R2020</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒 &quot;A&quot; (PicoPure)</td><td>应用生物系统公司</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒 &quot;B&quot; (RNeasy&amp;nbsp; 微型试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取方法 &quot;C&quot; (TRIzol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒 &quot;D&quot; （RNeasy PLUS Mini试剂盒）</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>防溅面罩，一次性面罩</td><td>Fisher</td><td>17-310</td><td></td></tr><tr><td>手术剪，14.5 cm &quot;锐-锐&quot;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，醋酸纤维素（0.2 &amp;mu;m)</td><td>Nalgene&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>组织冷冻介质</td><td>通用医疗健康数据</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

优化激光显微切割技术以分离新鲜冷冻人组织中的肠神经节

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

本方法旨在利用激光显微切割技术（LCM），从未固定的新鲜切除的人类肠道组织中分离的肠神经节获取高完整性的RNA样本。我们已确定工作流程中的五个关键步骤，以确保从肠神经节中提取的RNA在质量和数量上均足以满足RNA测序的要求。第一，在制备肠道组织时，每个样本必须在将浆膜尽可能展平于大号底模底部之前，通过吸水纸彻底去除所有多余液体。随后，将样本迅速置于干冰与2-甲基丁烷混合物上进行速冻。第二，在组织切片过程中，应正确放置冷冻模具，使肠道切片与肌间神经丛的完整平面平行，从而在每张切片上获得最大面积的肠神经节暴露。第三，在激光显微切割过程中，采用聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片可更快速、灵活地勾勒出肠神经节不规则的外形，便于高效收集。第四，为了在组织切片中清晰识别肠神经节，相较于水溶性染料，使用乙醇兼容性染料（如焦宁 Violet）能更好地保持RNA的完整性。最后，在从捕获的神经节中提取RNA时，我们发现不同商业RNA提取试剂盒在RNA产量和质量方面存在差异，其中某些试剂盒不仅能显著提高RNA的得率和纯度，还可有效去除DNA污染。在本方案中对上述各因素进行优化，可极大加快实验流程，并获得RNA质量和数量均极为优异的肠神经节样本。

我们对现有方案进行了多项改进，能够利用激光显微切割技术（LCM）从人肠道样本中相对快速地采集肠神经节，并满足RNA测序（RNA-Seq）的质量标准。首先，我们优化了将肠道组织片段置于盛有干冰与2-甲基丁烷（2-MB）混合物的大型底模表面进行快速冷冻的步骤（图1B）。在冷冻切片及后续的激光显微切割过程中，最成功的做法是将肠段平放于底模内，黏膜面朝上（图1B-1C）。应确保底模底部尽可能平整，任何弯曲都会显著增加获取完整肌间神经丛横切面的难度。该方法可使组织轻松切出厚度为8 µm的切片（图1E），并完全省去染色过程中的组织固定介质（TFM）。我们发现TFM会干扰染色过程，从而影响肠神经节的识别。以该方向放置组织还可避免切到富含RNase的黏膜层12；尽管根据我们的经验，使用乙醇类染液在很大程度上可抑制这些RNa...

本实验方案的目的是利用激光显微切割技术（LCM），从未经固定、新鲜切除的人类肠道组织中分离肠神经节，并获得高完整性的RNA样本。该方案包括制备速冻的人类肠道组织样本、冷冻切片、乙醇染色与脱水、激光显微切割以及RNA提取等步骤。

该方法的目的是从未经固定、新鲜切除的人类肠道组织中采集的肠神经节获取高完整性RNA样本。

该方法有助于回答有关肠神经系统的关键问题，例如成人人类肠道中肠神经节的表达谱。该技术的主要优势在于，可在最大程度保持RNA质量的同时，从人肠神经节中获得高产量的RNA。起始材料为切成20厘米长度的肠道组织。首先，去除脂肪组织和结缔组织。注意避免划伤浆膜，以免造成肌间神经丛的结构损伤。接着，沿修剪后样本的全长做一纵向切口，最好在肠系膜附着处进行。然后，剥离并弃去结肠上的结肠带，使组织能够展平。接着，将肠管展开，黏膜面朝下，置于冷藏的切板上。随后，沿组织全长切割成1.25厘米宽的条状。切割后，立即将每一片段转移至预冷的组织保存液中进行临时保存。接着，将每条组织条切成2至1.5厘米长的片段。将组织条切分完毕后，用吸水纸吸干片段表面液体。组织必须充分干燥，以防止冷冻时在组织上形成冰晶。现在，将干燥的组织片黏膜面朝上，排列在冰冷的一次性塑料模具上。然后用弯头镊子压平每一片组织，以去除夹带的气泡。组织在压平时会扩张。压平组织片段后，在冷冻前评估其厚度。如有需要，将样本边缘向内推压，直至肠组织样本接近其原始厚度。现在，将装有样品的底模转移至干冰与2-甲基丁烷的混合物中。组织应在30至60秒内完全冻结。随后，立即使用预先置于干冰上的低温湿巾擦拭模具底部，使其干燥。现在检查样品。注意观察是否有样品表面不平整。接下来，用预先标记并冷藏过的铝箔包裹模具。然后，用一层塑料膜覆盖锡箔，以尽量减少脱水。将样品置于冰上，直至可储存于零下80摄氏度。在准备好所需材料后，将3至5毫米高的TFM小丘倒入大型冷冻切片机样本托上，并立即将肠道样本（浆膜面朝上）转移至TFM上。在室温下放置数秒后，将样本架转移至干冰中，并用粉末状干冰覆盖。切片前，确保TFM位于肠肌神经丛平面以下。接着，将样本架安装到冷冻切片机的样本头中，并将样本与冷冻切片机刀片对齐。使肌间神经丛的平面与切片刀平行。现在，从浆膜层和纵行肌开始进行8微米厚的切片，直至到达肌间神经丛。为定位肌间神经丛，可取一组织样本制片，并使用水溶性染料（如1%结晶紫）染色。继续操作时，需辨认纵行肌层与环形肌层之间的交界处。在开始切片时，浆膜层将因存在结缔组织而被识别。部分残留的肠系膜脂肪也可能存在于浆膜层周围。随后，外层纵行肌层的片状结构将变得可见。当达到纵行肌层与环行肌层之间的边界时，即可观察到部分肠神经节。在接下来的数个切片中，肌间神经丛将变得十分明显，单个切片内可见大范围的神经节群。此时，收集连续切片用于激光捕获显微切割。将PEN载玻片在冷冻切片机中冷却5到10秒，然后用其贴附组织切片。最佳切片应含有大量神经元和胶质细胞。随后，按照文本方案中所述步骤进行染色，然后脱水。准备时，将 LCM 帽插入 LCM 显微镜载物台中。然后将样本载玻片装入载物台，并获取载玻片的概览图像。确定 LCM 所需的位置，并将帽加载到载玻片上。然后，校准红外激光器，并调整激光的功率和持续时间，以获得直径为20至30微米的捕获点。接下来，勾画出需要采集的神经节区域。务必确保操作范围位于盖片上可采集区域的边界内，该区域以绿色圆形显示。对于每个由紫外切割轨迹标出的神经节，调整红外光斑的位置，确保每100至500微米范围内至少有一个红外光斑，以保证在将帽体从样本上提起时能够完整收集所有神经节。然后，按下红外紫外切割按钮，开始收集所有标记的神经节。完成收集后，将帽体移至新的位置，并重复收集过程。此步骤可重复60至80分钟。当LCM帽上收集到足够数量的神经节后，将其转移至质量控制工作站。如果帽上有碎片残留，使用已为RNA实验准备好的细头画笔轻轻擦拭去除。对于难以去除的残留物，可使用移液器吸头进行处理。然后，将盖子拧紧在一个装有 230 微升 RNA 裂解缓冲液的 0.5 毫升微量离心管上。将离心管倒置，短暂涡旋振荡，随后在室温下孵育 30 分钟。随后，将样品在5,000 ×g或更高的条件下离心5分钟，然后将微量离心管转移至干冰中。样品此时已准备好进行RNA提取。每份样品采集两顶肠神经节时，可获得超过1纳克的RNA，足以用于RNA测序，且RNA质量优良。所示样品的RNA完整性为8.3。同时收集了完整性数值为7.5和6.9的样品。总体而言，所有制备样品中超过95%的样品质量足以用于RNA测序。使用生物信息学流程对RNA-Seq数据集的质量进行了评估。末端偏差表明样本已成功测序，且仅存在轻微的3'端偏差。基因生物类型图显示测序结果总体一致。一旦掌握，该技术可在短短 8 到 12 小时内从肠神经节中获取足够质量和数量的 RNA 生物学重复样本，用于 RNA-Seq 分析。在实施该操作过程中，关键是要将人肠道样本尽可能平展地冷冻。这将确保您能够收集到大面积的人肠神经节横截面，并可通过激光捕获显微切割技术快速、便捷地进行处理。

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