脓肿分枝杆菌在吞噬细胞内复制的毒力标志物鉴定

对细胞内病原体的突变体文库筛选和转录组学研究有助于解答有关目标病原体为在宿主细胞内存活而发生的基因组和调控适应性的关键问题。这些技术的主要优势在于其属于大规模研究手段，并能客观揭示病原体对胞内生存环境的适应机制。这些技术的应用意义延伸至脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）相关疾病的治疗，通过揭示疫苗治疗的潜在靶点，为治疗策略提供依据。

首先，在75平方厘米的组织培养瓶中，于室温下用30毫升蛋白胨酵母葡萄糖培养基培养卡氏棘阿米巴（Acanthamoeba castellani，简称Ac）。一小时后，使用25毫升移液管吸去上清液，并用不含碳和氮的Ac缓冲液每次10毫升，洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，通过一次剧烈振荡使阿米巴从培养瓶底部脱落，将细胞转移至Falcon管中，并用新鲜Ac缓冲液调整细胞浓度至每毫升5 × 10⁵个阿米巴。

在96孔板中每孔接种5 × 10⁴个阿米巴原虫。将培养板置于32°C条件下静置孵育1小时，使悬浮的阿米巴滋养体贴附于孔壁。同时，将细菌置于冰上预冷，孵育结束时向每孔加入5 µL解冻后的细菌。

在32摄氏度下孵育1.5小时后，在生物安全柜中将培养板倒置，弃去上清液，使其流入无菌金属托盘中的一叠无菌纱布上。每孔用200 µL新鲜Ac培养基洗涤三次。最后一次洗涤后，每孔加入含阿米卡星的20 µL新鲜培养基，继续孵育共培养体系2小时，以清除任何残留的胞外分枝杆菌。

随后用新鲜的Ac培养基洗涤三次，方法如前所述。然后，向每孔加入200 µL培养基，并添加新鲜的阿米卡星，接着加入5 × 10⁷个热灭活的大肠埃希菌（Escherichia coli）细菌。48小时后，每孔加入10 µL 10%十二烷基硫酸钠（SDS），在32°C下裂解细胞30分钟，取5 µL裂解液接种于含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板上。

通过在每滴裂解液中加入 25 微升无菌水进一步稀释。当所有裂解液接种完毕后，用塑料封口膜密封培养皿，并在 37 摄氏度下培养 3 至 4 天。当培养皿上出现菌落时，拍摄培养物照片，并通过细菌菌落数量最少的沉积区域鉴定出胞内生长缺陷的突变株。

对于胞内分枝杆菌RNA的提取，首先将脓肿分枝杆菌（M.abscessus）接种于添加了甘油和葡萄糖的7H9培养基中，在50毫升试管中于120 rpm条件下培养至对数中期。培养结束后，用10毫升Ac缓冲液洗涤细菌两次，每次洗涤后测量OD600以估算细菌浓度。随后，在10毫升新鲜Ac培养基中，将8.5×10⁸个分枝杆菌与8.5×10⁶个阿米巴共同孵育，于30°C、80 rpm条件下孵育1小时。

孵育结束后，通过离心收集细胞，并在相同离心条件下，每次用10毫升新鲜Ac缓冲液洗涤沉淀，共洗涤三次。然后将细胞重悬于10毫升含阿米卡星的新鲜Ac缓冲液中，以清除任何胞外细菌，在30摄氏度、80转/分钟条件下孵育4小时，随后用新鲜Ac缓冲液洗涤两次。最后一次洗涤后，将感染的阿米巴虫重悬于4毫升冰冷溶液三中，并加入280微升β-巯基乙醇，在冰上裂解阿米巴虫10分钟。

孵育结束后，离心细胞裂解液以沉淀释放的胞内细菌，并将细菌沉淀重悬于 1 毫升冰冷溶液三中。必须彻底去除上清液，以避免样品被阿米巴 RNA 或可能存在的蛋白酶污染。通过第二次离心收集释放的细菌，并将沉淀重悬于 1 毫升裂解缓冲液中。

然后在负80摄氏度下孵育24小时。将分枝杆菌溶液转移至含有氧化锆珠的2毫升螺旋管中，液面至500微升刻度线处，并将试管在负80摄氏度下再储存24小时，以促进RNA合成激活和细胞裂解。在分析当天，将样品置于冰上解冻，并进行细胞裂解：以6000转/分钟均质化处理两轮，每轮25秒，随后再进行一轮6000转/分钟、20秒的均质化处理。

每次匀浆后，将样品置于冰上冷却1分钟，以防止RNA降解。第三次匀浆后，将样品在冰上冷却20分钟，然后向每根试管中加入200微升溶于异戊醇的氯仿。涡旋振荡1分钟，随后离心样品，并向水相中加入0.8毫升预冷的异丙醇，在负20摄氏度下孵育2至3小时。

孵育结束后，再次离心样品，并用500 µL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，不要混匀。然后立即通过离心去除乙醇。用移液器吸去上清液，将沉淀在离心浓缩仪中干燥，再将沉淀重悬于100 µL无DNA/RNA酶的水中。

如本实验所示，分枝杆菌 mRNA 的提取可通过将基因按其在营养和矿物质受限环境、低氧环境或酸性环境中响应作用进行分类，来评估被诱导或被抑制的基因家族。同时可用于研究分枝杆菌在抵抗氧化应激和亚硝基应激过程中的基因表达，或在应对环境中的阿米巴原虫时毒力因子的表达。在进行这些操作时，必须注意同时处理对照样本和感染样本的培养及RNA提取，以避免批次效应。

在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法（如双RNA测序）来探究宿主与病原体相互作用的更多问题。该技术建立后，为微生物学领域的研究人员利用阿米巴宿主模型研究分枝杆菌的毒力奠定了基础。请注意，操作阿米巴时可能存在极高风险，若未严格按照本实验方案中的步骤操作，阿米巴可能转化为包囊形式。