Name: 吞噬细胞内复制脓肿分枝杆菌毒力标志物的鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学习利用转座子突变文库筛选和RNA测序技术，研究脓肿分枝杆菌在吞噬细胞内的基因组适应与转录组变化。该方法可识别细菌胞内存活关键基因，为疫苗靶点开发提供重要依据。

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我们非常感谢美国波士顿哈佛医学院的 E.J. Rubin 教授惠赠突变文库，感谢英国南安普顿大学医学院 Ben Marshall 博士对本文稿的校正。我们衷心感谢法国囊性纤维化患者协会“Vaincre la Mucoviscidose”和“L'Association Gregory Lemarchal”提供的经费支持（项目编号：RF20150501377）。同时感谢法国国家科研署（ANR）项目 DIMIVYR（ANR-13-BSV3-0007-01）以及法兰西岛大区“重大感染与新发疾病研究领域”（Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes）对 V.L-M. 博士后奖学金的资助。L. L. 为法国高等教育与研究部（Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche）资助的博士研究生。

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M. abscessus 的行为特征与慢生长分枝杆菌（SGM）如 M. tuberculosis 更为相似，而与其他属于快生长分枝杆菌（RGM）的分枝杆菌则差异较大2。SGM 致病性的关键因素在于其能够在抗原呈递细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）内存活甚至增殖。
M. abscessus 已经获得了一些基因组优势，这通过其基因组的全序列分析得以证实14，从而使其能够在真核吞噬细胞内存活。M. abscessus 的基因组表现出快速进化和高度可塑性的特征，包含许多近期插入的序列，例如前噬菌体和新基因15。尽管与 M. tuberculosis 相比，关于 M. abscessus 毒力因子的研究数据较少，但 M. abscessus 似乎能够迅速且主动地向增强毒力的方向进化。迄今为止，对 M. abscessus<...

分枝杆菌属包括从无害的腐生生物到重要的人类病原体在内的多种物种。众所周知的致病性物种如 结核分枝杆菌, Mycobacterium marinum 和 Mycobacterium ulcerans 属于生长缓慢的分枝杆菌（SGM）亚群。相比之下，快速生长的分枝杆菌（RGM）亚群的特点是在琼脂培养基上可在少于7天内形成可见菌落。RGM群包含超过180个物种，主要为非致病性的腐生分枝杆菌。关于RGM与其宿主相互作用的研究主要集中于 Mycobacterium smegmatis 并证明这些分枝杆菌会因巨噬细胞的杀菌作用而被迅速清除。
Mycobacterium abscessus 是一种罕见的快速生长分枝杆菌（RGM），对人类具有致病性，可引起多种感染，从皮肤和软组织感染到肺部及播散性感染均有涉及。M. abscessus 与Mycobacterium avium 被认为是囊性纤维化患者中主要的分枝杆菌病原体1。
针对 M. abscessus 开展的多项研究表明，该分枝杆菌表现出胞内病原体的特性，能够在肺部和皮肤的巨噬细胞及成纤维细胞中存活，逃避其杀菌反应，这一特性在快速生长分枝杆菌（RGM）中通常并不常见2,3,4。M. abscessus 的基因组分析发现，其含有典型存在于与土壤、植物及水生环境接触的环境微生物中的代谢通路，而这些环境中常存在自由生活的阿米巴原虫5。研究还表明，M. abscessus 拥有多种在腐生性且非致病性的RGM中未发现的毒力基因，这些基因可能通过水平基因转移获得，发生在有利于基因交换的生态位中，该环境可能聚集了多种抗阿米巴的细菌。
实验上，最早引人注目的结果之一是观察到 M. abscessus 与 M. tuberculosis 一样，能够在巨噬细胞内生长6。M. abscessus 还能抵抗吞噬体的酸化、细胞凋亡和自噬，这三种机制是细胞抵抗感染的关键环节2。甚至已有研究表明，M. abscessus 能够在吞噬体与细胞质溶胶之间建立直接通讯，而细胞质溶胶营养更丰富，可能更有利于细菌增殖2。目前对 M. abscessus 所具备或获得的、使其能在细胞内环境中存活的基因组优势了解甚少。阿米巴共培养是一种有效的方法，已用于分离出多种新的抗阿米巴细菌，例如 Mycobacterium massiliense7,8。在小鼠气溶胶化 M. abscessus 的模型中，观察到其在阿米巴内增殖的能力，这可能赋予 M. abscessus 更强的毒力4。一种假说是，M. abscessus 在该环境中演化出了某些遗传特征，使其能在吞噬细胞中存活，而这些特征不同于其他非致病性快速生长分枝杆菌（RGM）。这些获得性特征可能增强了其在人类宿主中的传播能力和毒力。
本报告介绍了用于揭示基因组赋予优势的工具和方法 M. abscessus 在变形虫环境中生存。为此，筛选 M. abscessus 转座子突变体的构建方法首次被描述，基于 Acanthamoeba castellanii 模式菌株，可用于鉴定在胞内生长方面存在缺陷的突变株。另有报道在巨噬细胞中进行第二轮筛选，以确认该缺陷在人体宿主中是否仍然存在。其次，为了理解所涉及的机制 M. abscessus 以适应吞噬细胞内的生活并增强其在动物宿主中的毒力，一种专门优化的方法 M. abscessus 已开发, 在与阿米巴共培养后，从中提取了胞内细菌的总RNA。因此，获得了全面的视图 M. abscessus 用于细胞内生存所必需的基因的研究方法已得到开发。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Thermofisher</td><td>11874235</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Thermofisher</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater&amp;nbsp;</td><td>Bertin</td><td>Precellys 24</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计 2000</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuBit 荧光仪</td><td>Thermofisher</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>氧化锆珠/二氧化硅珠</td><td>Biospec products</td><td>11079101Z</td><td>珠子</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/细胞名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Acanthamoeba&amp;nbsp;castellanii&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>30010</td><td>菌株</td></tr><tr><td>阿米卡星&amp;nbsp;</td><td>Mylan</td><td>150927-A</td><td>粉末</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>溶液</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>&gt;93% 颗粒状无水物</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>25666</td><td>溶液</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cla&lt;/em&gt;I 酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td>酶</td></tr><tr><td>哥伦比亚琼脂&amp;nbsp;</td><td>Biomerieux</td><td>43041</td><td>90 mm</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&amp;nbsp;</td><td>粉末</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11500596</td><td>培养基</td></tr><tr><td>无DNase和RNase的水&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td>溶液</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.&amp;nbsp;coli&lt;/em&gt; 电转感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td>细菌</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>粉末</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>临床分离株</td><td>个人库存</td><td>细菌</td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td>15505-40</td><td>4% 硫酸水溶液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>血清</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>溶液</td></tr><tr><td>硫氰酸胍&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0046-D</td><td>粉末</td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>溶液</td></tr><tr><td>J774.2 巨噬细胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J774.2</td><td>菌株</td></tr><tr><td>卡那霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>粉末</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>单碱式，无水</td></tr><tr><td>LB 液体培养基&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td>粉末</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td>粉末</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Labosi</td><td>M275</td><td>纯品</td></tr><tr><td>Microbank TM（含珠冷冻管）</td><td>Pro-Lab Diagnostic</td><td>PL.170/M</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0428</td><td>粉末</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 培养基</td><td>Thermofisher</td><td>11753473</td><td>粉末</td></tr><tr><td>M&amp;uuml;ller-Hinton 琼脂</td><td>Biorad</td><td>3563901</td><td>粉末</td></tr><tr><td>N-月桂酰肌氨酸</td><td>Merck</td><td>S37700 416</td><td>粉末</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>98-102%</td></tr><tr><td>苯酚/氯仿&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>溶液</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Thermofisher</td><td>EO0491</td><td>粉末</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD</td><td>211684</td><td>动物组织酶解产物</td></tr><tr><td>pUC19 质粒</td><td>New England Biolabs</td><td>54357</td><td>质粒</td></tr><tr><td>SDS&amp;nbsp; 20%</td><td>Biorad</td><td>1610418</td><td>溶液</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Calbiochem</td><td>567446</td><td>粉末</td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88810</td><td>粉末</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154563</td><td>粉末</td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>12044977</td><td>溶液</td></tr><tr><td>吐温80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754&amp;nbsp;</td><td>溶液</td></tr><tr><td>酵母提取物&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMBION DNase 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>10792877</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>DNA Agilent 芯片</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>GeneJET 质粒小提试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>K0503</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>PureLink PCR 纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>Quant-It&quot; 检测试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>Q33140/Q32884</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Y90001</td><td>试剂盒</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded RNA LT 建库试剂盒</td><td>Illumina</td><td>15032611</td><td>试剂盒</td></tr></tbody></table>

脓肿分枝杆菌在吞噬细胞内复制的毒力标志物鉴定

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Mycobacterium abscessus 与其他腐生性分枝杆菌的区别在于其能够抵抗人巨噬细胞的吞噬作用，并能在这些细胞内增殖。这些毒力特征使得 M. abscessus 具有致病性，尤其是在患有基础结构性肺部疾病的易感宿主中，例如囊性纤维化、支气管扩张或结核病患者。目前尚不清楚患者是如何感染 M. abscessus 的。与许多其他分枝杆菌不同，M. abscessus 并未在环境中被发现，但可能寄生于阿米巴原虫内，而环境中的吞噬性阿米巴可能是 M. abscessus 的潜在储存库。事实上，M. abscessus 对阿米巴的吞噬作用具有抗性，且在阿米巴细胞内的生存似乎可在实验感染模型中增强 M. abscessus 的毒力。然而，关于 M. abscessus 自身的毒力机制仍知之甚少。为了揭示赋予 M. abscessus 胞内生存优势的基因，研究人员建立了一种 M. abscessus 转座子突变文库的筛选方法。同时，还开发了一种在与阿米巴共培养后从胞内分枝杆菌中提取RNA的方法。该方法经过验证，能够对细胞内的完整 M. abscessus 转录组进行测序，首次全面揭示了 M. abscessus 对胞内生存环境的适应机制。这两种方法共同为我们理解 M. abscessus 的毒力因子提供了重要线索，这些因子使 M. abscessus 能够在人体呼吸道中定植。

M. abscessus 能够抵抗并逃避免疫细胞（如巨噬细胞）和环境原生动物（例如阿米巴）的杀菌作用。M. abscessus 在与阿米巴接触生长时会表达毒力因子，使其在小鼠中更具致病性4。本方法的首要目标是鉴定 M. abscessus 中使其能够在阿米巴内生存和增殖的基因。
为此，通过转座子（Tn）递送获得M. abscessus subsp.massiliense的突变体文库9，随后在存在阿米巴原虫的条件下进行共培养筛选，以鉴定在此胞内环境中生长减弱的突变体（图1）。还通过与巨噬细胞共培养评估了相同突变体的行为，以分析其生长减弱表型是否在小鼠巨噬细胞中得以保留。
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在此，我们介绍两种用于研究吞噬细胞-脓肿分枝杆菌 相互作用：通过转座子突变体文库筛选细菌胞内缺陷表型，以及利用RNA测序确定细菌胞内转录组。这两种方法均可揭示增强细菌胞内适应性的基因组优势与转录组适应机制。

与其它腐生性分枝杆菌不同，脓肿分枝杆菌的特点在于其能够抵抗人巨噬细胞的吞噬作用，以及具备……

对细胞内病原体的突变体文库筛选和转录组学研究有助于解答有关目标病原体为在宿主细胞内存活而发生的基因组和调控适应性的关键问题。这些技术的主要优势在于其属于大规模研究手段，并能客观揭示病原体对胞内生存环境的适应机制。这些技术的应用意义延伸至脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）相关疾病的治疗，通过揭示疫苗治疗的潜在靶点，为治疗策略提供依据。首先，在75平方厘米的组织培养瓶中，于室温下用30毫升蛋白胨酵母葡萄糖培养基培养卡氏棘阿米巴（Acanthamoeba castellani，简称Ac）。一小时后，使用25毫升移液管吸去上清液，并用不含碳和氮的Ac缓冲液每次10毫升，洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，通过一次剧烈振荡使阿米巴从培养瓶底部脱落，将细胞转移至Falcon管中，并用新鲜Ac缓冲液调整细胞浓度至每毫升5 × 10⁵个阿米巴。在96孔板中每孔接种5 × 10⁴个阿米巴原虫。将培养板置于32°C条件下静置孵育1小时，使悬浮的阿米巴滋养体贴附于孔壁。同时，将细菌置于冰上预冷，孵育结束时向每孔加入5 µL解冻后的细菌。在32摄氏度下孵育1.5小时后，在生物安全柜中将培养板倒置，弃去上清液，使其流入无菌金属托盘中的一叠无菌纱布上。每孔用200 µL新鲜Ac培养基洗涤三次。最后一次洗涤后，每孔加入含阿米卡星的20 µL新鲜培养基，继续孵育共培养体系2小时，以清除任何残留的胞外分枝杆菌。随后用新鲜的Ac培养基洗涤三次，方法如前所述。然后，向每孔加入200 µL培养基，并添加新鲜的阿米卡星，接着加入5 × 10⁷个热灭活的大肠埃希菌（Escherichia coli）细菌。48小时后，每孔加入10 µL 10%十二烷基硫酸钠（SDS），在32°C下裂解细胞30分钟，取5 µL裂解液接种于含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板上。通过在每滴裂解液中加入 25 微升无菌水进一步稀释。当所有裂解液接种完毕后，用塑料封口膜密封培养皿，并在 37 摄氏度下培养 3 至 4 天。当培养皿上出现菌落时，拍摄培养物照片，并通过细菌菌落数量最少的沉积区域鉴定出胞内生长缺陷的突变株。对于胞内分枝杆菌RNA的提取，首先将脓肿分枝杆菌（M.abscessus）接种于添加了甘油和葡萄糖的7H9培养基中，在50毫升试管中于120 rpm条件下培养至对数中期。培养结束后，用10毫升Ac缓冲液洗涤细菌两次，每次洗涤后测量OD600以估算细菌浓度。随后，在10毫升新鲜Ac培养基中，将8.5×10⁸个分枝杆菌与8.5×10⁶个阿米巴共同孵育，于30°C、80 rpm条件下孵育1小时。孵育结束后，通过离心收集细胞，并在相同离心条件下，每次用10毫升新鲜Ac缓冲液洗涤沉淀，共洗涤三次。然后将细胞重悬于10毫升含阿米卡星的新鲜Ac缓冲液中，以清除任何胞外细菌，在30摄氏度、80转/分钟条件下孵育4小时，随后用新鲜Ac缓冲液洗涤两次。最后一次洗涤后，将感染的阿米巴虫重悬于4毫升冰冷溶液三中，并加入280微升β-巯基乙醇，在冰上裂解阿米巴虫10分钟。孵育结束后，离心细胞裂解液以沉淀释放的胞内细菌，并将细菌沉淀重悬于 1 毫升冰冷溶液三中。必须彻底去除上清液，以避免样品被阿米巴 RNA 或可能存在的蛋白酶污染。通过第二次离心收集释放的细菌，并将沉淀重悬于 1 毫升裂解缓冲液中。然后在负80摄氏度下孵育24小时。将分枝杆菌溶液转移至含有氧化锆珠的2毫升螺旋管中，液面至500微升刻度线处，并将试管在负80摄氏度下再储存24小时，以促进RNA合成激活和细胞裂解。在分析当天，将样品置于冰上解冻，并进行细胞裂解：以6000转/分钟均质化处理两轮，每轮25秒，随后再进行一轮6000转/分钟、20秒的均质化处理。每次匀浆后，将样品置于冰上冷却1分钟，以防止RNA降解。第三次匀浆后，将样品在冰上冷却20分钟，然后向每根试管中加入200微升溶于异戊醇的氯仿。涡旋振荡1分钟，随后离心样品，并向水相中加入0.8毫升预冷的异丙醇，在负20摄氏度下孵育2至3小时。孵育结束后，再次离心样品，并用500 µL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，不要混匀。然后立即通过离心去除乙醇。用移液器吸去上清液，将沉淀在离心浓缩仪中干燥，再将沉淀重悬于100 µL无DNA/RNA酶的水中。如本实验所示，分枝杆菌 mRNA 的提取可通过将基因按其在营养和矿物质受限环境、低氧环境或酸性环境中响应作用进行分类，来评估被诱导或被抑制的基因家族。同时可用于研究分枝杆菌在抵抗氧化应激和亚硝基应激过程中的基因表达，或在应对环境中的阿米巴原虫时毒力因子的表达。在进行这些操作时，必须注意同时处理对照样本和感染样本的培养及RNA提取，以避免批次效应。在完成该实验步骤后，可进一步采用其他方法（如双RNA测序）来探究宿主与病原体相互作用的更多问题。该技术建立后，为微生物学领域的研究人员利用阿米巴宿主模型研究分枝杆菌的毒力奠定了基础。请注意，操作阿米巴时可能存在极高风险，若未严格按照本实验方案中的步骤操作，阿米巴可能转化为包囊形式。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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