量化成年斑马鱼模型中 Vibrio cholerae 的定植与腹泻

该方法有助于解答霍乱弧菌研究领域中的关键问题，例如霍乱弧菌如何在寂静海岸定植，并与肠道微生物群竞争以建立生态位。该技术的主要优势在于鱼类是霍乱弧菌的天然宿主，因此我们可以研究霍乱弧菌的完整生命周期。演示该实验操作的是来自我实验室的博士后Dhrubajyoti Nag以及我实验室的博士生Paul Breen。

制备霍乱弧菌培养物后，通过浸润法接种斑马鱼。首先，将四到五条斑马鱼放入含有200毫升无菌感染用水的400毫升烧杯中。然后加入一毫升霍乱弧菌培养物，以达到所需的感染浓度。

然后，用带孔的盖子盖住烧杯。在准备好所有烧杯后，将其转移至设定为 28 摄氏度的玻璃门培养箱中。若进行短暂暴露处理，约六小时后，通过鱼网将烧杯中的水倒出以收集鱼类。感染后的水必须用漂白剂处理，以杀死细菌。

然后，将鱼放入200毫升无菌感染水中浸泡5分钟。5分钟后，用鱼网过滤该溶液，并将废液倒入含漂白剂的容器中处理。此时，可将鱼转移至新的洁净烧杯中，加入200毫升无菌感染水。

当实验达到预期终点时，取15毫升感染水样用于诊断。随后收集鱼类，并妥善处理感染的水。将鱼腹面朝上放置，用一枚针穿过下颌，另一枚针穿过肛门后方，以固定鱼体。

将两枚针均向外侧远离鱼体的方向倾斜。接着，用70%乙醇擦拭鱼的腹侧表面。然后，用70%乙醇和火焰对解剖刀和Vannas剪进行灭菌。

现在，使用手术刀在腹部沿纵轴做一小段切口，切口需穿透鳞片，但深度仅限于皮肤层。接着，用剪刀小心地沿身体纵轴方向延长切口，切割深度不得超过皮肤层。注意避免切到肛门。

然后朝头部方向做两个侧向切口以扩大开口。接着，将侧切口两侧的皮肤固定在解剖面上，将大头针倾斜向外、远离身体方向固定。此时肠道应已可见，呈一条非常细的浅色管状结构。

现在，使用两对经火焰灭菌的镊子小心地取出整个肠道组织，该组织可能非常脆弱。将组织转移至含有玻璃珠和一毫升冷缓冲液的匀浆管中。接着，按照文本方案中所述方法对组织进行匀浆，并定量分析肠道定植水平。

接下来，对肠组织匀浆液和缓冲液进行系列稀释。每条鱼制备五到六个十倍梯度稀释液，每个稀释液体积为一毫升。用涡旋振荡器充分混匀各管。

然后，将每个稀释液的100至200微升接种到含有链霉素和X-gal的LB琼脂平板上。在30°C下孵育平板16至18小时。过夜孵育后，计数平板上的霍乱弧菌菌落。

这些细菌在含有X-gal的LB培养基上通常形成淡蓝色菌落。如果观察到多种菌落形态，应将每种不同形态的数个菌落分别转接至不同的TCBS平板上。在TCBS培养基上，霍乱弧菌（V. cholerae）形成较大、略扁平的黄色菌落，菌落中心不透明，边缘透明。

为测定鱼类腹泻中的黏蛋白水平，需在96孔板上进行检测。每种实验条件（包括空白对照）均设三个复孔，每孔加入100 µL感染水。随后，向每个检测孔中加入50 µL新鲜的0.1%过碘酸溶液，并混匀。

使用移液操作进行混匀。接着，用塑料膜将酶标板严密包裹，并在37摄氏度条件下孵育1至1.5小时。孵育结束后，将酶标板冷却至室温。

向每个孔中加入 100 微升品红溶液，并用移液器混匀。然后重新封好板子，置于室温摇床上。约 20 分钟后，使用酶标仪在 560 纳米处读取吸光值。

为了定量溶液中黏蛋白引起的反应。为了检测鱼类腹泻中的蛋白质水平，使用考马斯亮蓝法（Bradford 法）。取 66 微升的一种 BSA 标准品或 66 微升感染水样，与 1,000 微升考马斯亮蓝试剂混合于一次性比色皿中。

现在，将样品在室温下孵育两分钟，然后使用分光光度计在660纳米处读取吸光度。衡量腹泻程度的一个简单指标是水样在600纳米处测得的浊度。

充分混匀水样，取1毫升加入一次性比色皿中进行测量。以干净的感染用水作为空白对照，进行基线测量。也可对排出的霍乱弧菌（V. cholerae）进行测量。

可在接种后已转移至清洁水中的鱼类进行此操作。取水族箱水样一份，按前述方法进行系列稀释。随后将稀释液接种于选择性培养基上，于30°C培养24小时。

随后，按照先前所述方法计数菌落，并计算CFU。将斑马鱼群体饲养于200毫升水中，接种五百万CFU的流行性霍乱弧菌。在含有细菌的水中放置6小时后，将鱼转移至清洁水中继续培养18小时。

随后收获了鱼的肠道。每条鱼体内大约含有 100,000 至 1,000,000 个 V. cholerae 细胞。感染用的水被用于其他检测。

当感染剂量较高时，黏蛋白水平也较高。当鱼类感染霍乱弧菌（V. cholerae）后，水的OD600显著升高。最后，感染鱼类所处水中的总蛋白水平几乎是未感染鱼类所处水中总蛋白水平的两倍。

观看本视频后，您应能充分掌握如何对成年斑马鱼进行霍乱弧菌感染，并量化感染所引起的腹泻。在此实验流程基础上，还可进一步开展其他方法，如传播实验，以评估既往感染鱼对未感染鱼的传染情况。