新型杀虫化学对蚊子毒性测试规程
February 13th, 2019
介绍了评估化学物对未成熟蚊子和成年蚊子对发育的毒性的协议, 作为新型杀幼剂、掺假剂和内杀剂。该协议能够在单点剂量下对多种化学物质进行高通量测试, 并随后通过剂量反应分析进行评估, 以确定接触或摄入时的毒性。
该方法有助于回答杀虫剂发现和病媒控制领域中的关键问题。例如，一种未解释的化学成分对蚊子幼虫或成年人来说毒性如何？化学是否具有作为杀幼虫剂或杀菌剂的发展潜力？
而且，最有效的交付途径是什么？该技术的主要优点是，它可用于评估未配化学的毒性化学对多种病媒蚊子的毒性，并可以放大以评估数百种高通量能力的化合物。演示这个程序的将是贾斯琳·考尔，一个来自我实验室的科技人员。
首先，标记 24 孔组织培养板的孔。使用分析平衡来称量测试化合物。然后，在1.5mL管中将无菌双蒸馏水中的化合物解出，形成80mM的库存溶液。
接下来，使用双蒸馏水连续稀释库存溶液，以准备所需浓度的工作库存溶液。请注意，在去除多余的水时，以及在添加测试化学成分时，必须注意将幼虫添加到井中，以避免对幼虫造成物理损害。伤害可能会增加死亡率，从而产生误报结果或使检测无效。
使用宽孔塑料转移移液器将五分之三的星幼虫转移到盘子的每个孔中。然后，使用一 mL 移液器轻轻去除水，然后用所需的双蒸馏水体积替换。当快速去除水时，注意不要触摸幼虫，以确保幼虫不会干燥，并轻轻地通过移液剂对塑料井的对面添加测试化学。
在每个井中加入适当体积的测试溶液，轻轻旋转板以确保均匀的混合。将板放在生长室中，在 25 摄氏度下保持 12 小时的光/暗循环，相对湿度为 75% 至 85%。要检查幼虫的移动，请轻轻敲按板。
如果未观察到任何运动，则用无菌牙签轻轻触摸幼虫。如果没有注意到任何反应，则将幼虫评分为死幼虫，并使用记分表记录每个井中死亡幼虫的总数，即文本协议中描述的时间点。培养三到五天大的成年雌性蚊子在一个20升塑料笼子里。
标记九盎司纸杯的名称和浓度的测试化合物。接下来，在20mL玻璃瓶中准备丙酮测试化合物的10mg/mL库存溶液。然后，连续稀释库存溶液，以获得所需的工作浓度。
用丙酮清洁一个 mL 玻璃注射器。然后在适当的浓度下用测试溶液填充。将注射器固定在经过调整的微施用器中，以提供 0.25uL 的体积。
接下来，使用吸气器将10、3到5天大的成年雌性蚊子从笼子里取出。在摄氏四度下，对它们进行五分钟的麻醉。然后将蚊子转移到培养皿中。
将盘子放在冰上10分钟。为了避免损害可能导致死亡的成年人蚊，请确保它们在冰箱里麻醉不超过五分钟，或在冰上固定超过10分钟，并尽量减少对蚊子的处理。如果您能够接触到一个冷盘和具有可移动阶段的微操纵器，可以进一步最大限度地减少对蚊子的处理。
使用细钳子将每只蚊子从盘子里除掉。用注射器微施剂将0.25uL的测试溶液涂在后胸上，在解剖显微镜下下，将蚊子转移到冰上贴有标签的纸杯上。用10×10cm的网状方形和橡皮筋密封杯子，然后将其转移到生长室，并记录死亡蚊子的数量，如前所述。
用吸气器收集大约150只4到5天大的成年雌性蚊子，然后将它们转移到一个单独的笼子里。在进食测定前24小时取出糖的来源。准备水中测试化合物的 80mM 库存溶液。
然后，连续用水稀释，获得所需浓度的工作库存溶液。为了获得所需的测试浓度，在1.5mL管中加入每稀释40uL至960uL的除颤兔血，然后通过移液混合。将成员过滤器放在进料装置上，然后用橡胶圈密封。
接下来，使用移液器通过位于进给装置反侧的输送口将一 mL 的血液与检测溶液转移。将进料装置连接到加热装置。然后，用新鲜准备的 10% 乳酸溶液轻轻擦拭膜表面。
将进料装置放在笼子中。用黑布盖住笼子，让蚊子喂一个小时。蚊子喂食后，将笼子放在4摄氏度的冰箱中，5分钟，对蚊子进行麻醉。
然后，计算并记录笼子里蚊子的总数。通过检查腹部，计算和记录完全和部分喂养的雌性蚊子的总数。每剂应至少获得50只血液喂养的蚊子。
清除任何未喂食的蚊子。接下来，将笼子转移到生长室，并使用记分表记录在适当时间点的死蚊子数量。在第三天喂血后，在笼子里放置一个蛋杯72小时。
使用解剖显微镜计算每个治疗产生的鸡蛋总数。进行了幼虫接触测定，以评估多巴胺受体拮抗剂阿米替林对幼虫死亡率的影响。数据表明LC 50值在实验过程中会随时间而减小。
将阿米替林对成年雌性蚊子死亡率的影响与双芬特林和两种负对比进行比较。与丙酮处理和未经治疗的阴性对比相比，阿米替林和双芬特林在每个实验时间点都诱发显著死亡率。进行了定量喂养检测，以评估三种不同剂量的阿米替林对成年雌性蚊子的繁殖率和死亡率百分比的影响。
数据显示，与仅对血液喂养的对口蚊子相比，以最高剂量喂养的蚊虫的繁殖量没有统计学上显著差异。一旦掌握了，我们在这里描述的任何分析，可以在大约两个小时由一个人完成，如果执行得当。在尝试此程序时，重要的是要记住轻轻处理生物体，在局部应用和评分幼虫或成人检测期间应保持一致性。
按照这个程序，还可以通过蚊子焦油、CDC瓶测定和世卫组织管测定，进行生物测定等通过吸收评估毒性的方法，以回答有关未配化学或配方产品功效的其他问题，以及作为接触性杀虫剂或空间喷雾剂的发展潜力。
概述
本文介绍了评估各种化学品对未成熟和成年蚊子毒性的协议，旨在开发新的幼虫杀虫剂和成虫杀虫剂。这些方法允许高通量测试和剂量-反应评估，以通过接触或摄入来确定毒性。
关键研究组成部分
科学领域
- 杀虫剂发现
- 病媒控制
- 毒理学
背景
- 了解未配制化学品的毒性对蚊子控制至关重要。
- 高通量测试可以高效评估多种化合物。
- 协议旨在最小化对实验对象的物理损害。
- 探索了不同的化学品测试递送途径。
研究目的
- 评估各种化学品对蚊子种群的毒性。
- 识别潜在的幼虫杀虫剂和成虫杀虫剂。
- 确定这些化学品最有效的递送方法。
使用的方法
- 制备原料溶液和测试化合物的系列稀释。
- 使用24孔组织培养板进行幼虫测定。
- 使用微量涂布器向成年蚊子施用测试溶液。
- 用去纤维蛋白的兔血与测试溶液混合进行喂养测定。
主要结果
- 协议展示了对幼虫和成年蚊子死亡率的有效评估。
- 数据表明被测化合物在不同时间的毒性水平不同。
- 阿米替林和比芬硫磷的比较显示出死亡率的显著差异。
- 高通量能力允许评估大量化合物。
结论
- 开发的协议对杀虫剂发现和病媒控制研究有价值。
- 结果可以指导新的蚊子控制策略的开发。
- 需要进一步研究以探索这些化学品的长期影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage evaluation of novel insecticidal chemistries against key mosquito vectors, supporting target validation and lead identification in vector control programs. By providing standardized, high-throughput assays for larval and adult toxicity via contact and ingestion routes, it facilitates mechanistic de-risking and predictive confidence in compound prioritization. The approach aids in triaging compounds for further development as larvicides or adulticides, reducing late-stage attrition in pesticide discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of toxicological hypotheses and pathway clarification for novel chemistries against mosquito vectors.
- Operational Value: Supports functional target validation through dose-response mortality assays in Aedes aegypti, Anopheles gambiae, and Culex quinquefasciatus.
- Strategic Value: Provides predictive confidence for portfolio triage by identifying compounds with larvicidal or adulticidal potential early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible toxicity endpoints.
- Operational Value: Enables assay standardization and scalability, allowing evaluation of hundreds of compounds in high-throughput format.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse for iterative compound testing across delivery routes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system testing using primary vector species of Zika, dengue, yellow fever, and malaria.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent mortality and fecundity readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying toxicity and sublethal effects such as fecundity reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hit evaluation to lead optimization, particularly for vector control programs seeking novel modes of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying toxicity across species and exposure routes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs (LC50, mortality rates) for reliable compound evaluation in 24-well and feeding assay formats.
- Analytics: Generates dose-response data and time-course mortality profiles that enable cross-compound comparison and structure-activity relationship initiation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through standardized adult feeding assays and fecundity assessments in disease-relevant mosquito models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for iterative testing of unformulated chemistries across multiple projects and vector species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in toxicity profiling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across larval contact, adult topical, and blood-feeding assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in insecticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on species-specific toxicity and delivery route efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, handling, and assay techniques to avoid artifacts from physical damage.
- Needs analytical balances, micro-applicators, growth chambers with controlled temperature/humidity, and dosing equipment for precise compound delivery.
- Demands cross-team standardization in larval staging, adult age synchronization, and scoring criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to alternative mosquito species or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as solvent compatibility (e.g., acetone for topical applications) and the need to minimize organism stress during handling.
