测试新型杀虫化学物质对蚊虫毒性的实验方案

该方法有助于解答杀虫剂研发和病媒控制领域中的关键问题，例如，未经配方处理的化学物质对蚊子幼虫或成虫群体的毒性如何？该化学物质是否具有开发为幼虫杀灭剂或成虫杀灭剂的潜力？

此外，最有效的递送途径可能是什么？该技术的主要优势在于，可用于评估未经配方处理的化学物质的毒性，评估一种化学物质对多种媒介蚊虫的毒性，并且能够扩大规模，以高通量方式评估数百种化合物。本次实验操作将由我实验室的科研技术员 Jasleen Kaur 演示。

首先，标记一个24孔组织培养板的各孔。使用分析天平称取待测化合物。然后，将该化合物溶于1.5 mL离心管中的无菌双蒸水中，配制成80 mM的储备液。

接下来，使用双蒸水对原液进行连续稀释，以配制所需浓度的工作液。注意在将幼虫加入孔板、去除多余水分以及添加待测化合物时需格外小心，避免对幼虫造成物理损伤。损伤可能增加幼虫死亡率，从而导致假阳性结果或使实验无效。

使用宽口塑料移液管将五只三龄幼虫转移至板的每个孔中。然后，用1 mL移液器轻轻吸去孔中液体，并替换为所需体积的双蒸水。在吸去液体时需小心操作，避免触碰幼虫，同时动作要迅速，以确保幼虫不会干燥。通过将测试化合物沿塑料孔的对侧加入，轻柔地完成加样。

向每个孔中加入适量的测试溶液，并轻轻旋转培养板以确保均匀混合。将培养板置于生长培养箱中，在25摄氏度、75%至85%相对湿度条件下保持12小时光照/12小时黑暗的循环。为观察幼虫运动情况，可轻轻敲击培养板。

若未观察到活动，可用无菌牙签轻轻触碰幼虫。若幼虫无任何反应，则记为死亡，并在文本方案所述的时间点，使用记分表记录每个孔中死亡幼虫的总数。将三至五日龄的成年雌蚊饲养于20升的塑料笼中。

用测试化合物的名称和浓度标记九盎司纸杯。接着，在20 mL玻璃小瓶中用丙酮配制浓度为10 mg/mL的测试化合物储备液。然后，将储备液进行系列稀释，以获得所需的工作浓度。

用丙酮清洗1 mL玻璃注射器。然后吸入适当浓度的待测溶液。将注射器固定在微量施用器上，并调节至递送0.25 µL体积。

接下来，使用吸虫器从笼中移出10只三至五日龄的成年雌性蚊虫。在4摄氏度下麻醉5分钟，然后将蚊虫转移至培养皿中。

将培养皿置于冰上10分钟。为避免损伤成蚊而导致死亡，确保其在冰箱中麻醉时间不超过5分钟，或在冰上固定时间不超过10分钟，并尽量减少对蚊虫的操作。如果具备冷台以及带有可移动载物台的显微操作仪，则可进一步减少对蚊虫的接触操作。

使用精细镊子将每只蚊子从培养皿中取出。在解剖显微镜下，用注射器微量点样器将 0.25 µL 测试溶液滴加至蚊子的背部胸区。接着，将蚊子转移至预先标记并置于冰上的纸杯中。用 10 cm × 10 cm 的网状方格和橡皮筋密封纸杯。然后，将纸杯转移至培养箱中，并按照前述方法记录死亡蚊子的数量。

用吸虫器收集约150只4至5日龄的成年雌蚊，并将其转移至单独的笼子中。在喂食实验前1至24小时移除糖源。用水配制80 mM的待测化合物储备溶液。

然后用水进行连续稀释，以获得所需浓度的工作储备液。为获得所需的测试浓度，取每种稀释液40 µL加入含有960 µL脱纤维兔血的1.5 mL离心管中，并通过移液混匀。将滤膜置于喂食装置上，并用橡胶圈密封。

接下来，使用移液器将1 mL血液与检测试剂通过喂养单元背面的输送口转移。将喂养单元连接至加热装置。然后，用新配制的10%乳酸溶液轻轻擦拭膜表面。

将饲喂装置放入蚊笼中。用深色布料覆盖蚊笼，让蚊子饲喂一小时。蚊子吸血后，将蚊笼置于4°C冰箱中5分钟，以麻醉蚊子。

然后，统计并记录笼中蚊子的总数。通过观察腹部，统计并记录完全吸血和部分吸血的雌蚊总数。每个剂量组应至少获得50只吸血雌蚊。

移除所有未吸血的蚊子。接着，将笼子转移到培养箱中，并使用记录表在相应的时间点记录死亡蚊子的数量。在吸血后的第三天，将一个产卵杯放入笼中，持续 72 小时。

使用解剖显微镜统计每种处理条件下产生的卵的总数。通过幼虫接触实验评估阿米替林（一种多巴胺受体拮抗剂）对幼虫随时间推移的致死效应。实验数据显示，随着实验时间的延长，LC50值逐渐降低。

将阿米替林对成年雌性蚊虫死亡率的影响与联苯菊酯及两种阴性对照进行了比较。与丙酮处理组和未处理阴性对照组相比，阿米替林和联苯菊酯在各个实验时间点均引起显著的死亡率。通过定量摄食实验，评估了三种不同剂量的阿米替林对成年雌性蚊虫生殖力及死亡率百分比的影响。

数据显示，在最高剂量下饲喂阿米替林的蚊子与仅饲喂血液的对照组相比，其繁殖力无统计学上的显著差异。一旦掌握，此处所述的任何一项检测方法，若操作得当，单人约两小时内即可完成。在进行该实验操作时，重要的是要记住轻柔地处理生物体，并在局部施用以及幼虫或成虫检测评分过程中保持一致性。

通过此操作步骤，还可进行其他方法，如通过蚊虫跗节吸收来评估毒性的生物测定法、CDC瓶法以及WHO管法，以进一步回答有关未配制化学物质或配制产品作为触杀型杀虫剂或空间喷雾剂在功效及开发潜力方面的其他问题。