Name: 新型杀虫化学对蚊子毒性测试规程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解新型杀虫化学对蚊子幼虫和成体的毒性测试规程。本方法采用高通量筛选和剂量反应评估，用于鉴定潜在杀幼虫剂和杀成蚊剂，助力杀虫剂研发与病媒控制研究。

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作者感谢利物浦热带医学院的 H. Ranson 在检测方法开发及提供 LITE 方案方面给予的帮助，以及普渡大学的 M. Scharf 在实验设计方面的建议。

注意：以下方案中所述工作所需的所有菌株和试剂及其供应商均列于材料表中。
1. 蚊子幼虫和成虫的培养
注意：易感杀虫剂的蚊子品系可从疟疾研究与试剂参考库获取。推荐品系如下：Aedes aegypti 利物浦（LVP）品系、Anopheles gambiae 基苏木（KISUMU1）品系和 Culex quinquefasciatus 约翰内斯堡（JHB）品系。
<ol>
	<li>按照 Nuss29 所述方法，在 28 °C 和 75–85% 相对湿度（RH）条件下，将蚊子幼虫卵置于 25 cm × 40 cm 的塑料托盘中（每盘约 400 条幼虫），在 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期下培养。幼虫饲喂磨碎的沙鼠饲料（用于埃及伊蚊 A. aegypti 和冈比亚按蚊 An. gambiae）或片状鱼粮（用于致倦库蚊 C. quinquefasciatus）。进行幼虫实验时，采集处于三龄幼虫（L3）阶段的幼虫。</li>
	<li>将蛹转移至塑料杯中，在上述条件下于昆虫饲养室内的 20 L 塑料笼中培育成成蚊。按照其他文献29 所述方法，以 20% 蔗糖溶液维持成蚊生长。在羽化后 3–5 天收集成蚊。</li>
</ol>
2. 幼虫接触实验（单点剂量或剂量反应实验）
注意：该检测可使用溶于水或二甲基亚砜（DMSO）的化合物进行，前提是检测孔中DMSO的终浓度不超过1%。其他溶剂也可考虑，但必须首先确认其终浓度在暴露72小时后不会导致超过10%的死亡率。该检测可作为单点剂量检测或剂量-反应检测进行。若进行后者，建议测试一系列浓度（至少五个），覆盖预期的LC50范围。
<ol>
	<li>将透明的24孔细胞培养板的各孔按如下所示进行标记 图1.</li>
	<li>在1.5 mL离心管中配制待测化学品的储备溶液。
	<ol>
		<li>使用分析天平称量每种化学试剂，并根据其溶解特性，用无菌 ddH₂O 重悬。2O，DMSO 或其他合适的有机溶剂（参见 图2). 
		注意：计算时应考虑化学物质的纯度。例如，对于纯度为99%的化学物质，将10.1 mg溶解于1,000 µL丙酮中，可得到1%的溶液。用封口膜密封后，于-20 °C保存。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定待评估的测试化学品的最终浓度，并使用适当的溶剂从储备液相应地制备系列稀释液。 
	注意：化学物质的浓度和溶剂体积可通过公式 C1*V1= C2*V2 其中 C1=样品1的浓度，C2=样品2的浓度，V1= 样品1的体积和V2= 样本2的体积。参见所示的示例计算 图2 和 表1.
	<ol>
		<li>配制10 mM的储备液，并根据需要进行系列稀释，以获得所需的测试浓度（表1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用宽口塑料移液管，将五条L3期幼虫转移至组织培养检测板的孔中；L3期幼虫可根据其体长（约2.5–3.5 mm）和头壳宽度（约0.025 mm）进行识别24用1 mL移液器轻轻吸去水分，并替换为所需体积的ddH₂O2O（见下文）。每种处理重复操作，以获得 n = 4 的技术重复（即， 每处理组共20只幼虫。</li>
	<li>向24孔测试板中的四个重复孔分别加入适量的待测化学品，轻轻摇动平板以确保化学品均匀混合。将平板置于恒定条件的测试或培养环境中。例如， 建议温度为 25 °C，相对湿度约为 75–85%，并尽可能维持 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期。 
	注意：为了确保实验间的可重复性，后续检测应在相同的环境条件下进行。</li>
	<li>在暴露后30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、24小时、48小时和72小时（或其它指定时间点），记录每孔中死亡/无反应幼虫的数量，并填写在评分表上表2）。轻敲培养板侧面，若无活动迹象，再用无菌牙签轻轻触碰幼虫。将对敲击或触碰无反应的幼虫记为 &#34;死亡&#34;. 
	注意：可能观察到其他形态学和行为学表型，可进行记录。</li>
	<li>如有需要，可使用修正的Abbott公式校正对照组死亡率，方法如下： 
	死亡率（%）= (X - Y) × 100 / (100 - Y) 
	其中，X = 处理样本中的死亡率百分比，Y = 对照组中的死亡率百分比。</li>
	<li>使用GraphPad Prism 6或类似软件，将结果绘制成直方图或对数曲线。&#160;并计算相对于对照组的致死浓度（LC）值。</li>
	<li>使用另一批蚊子重复实验，以获得 n = 3 或更多的生物学重复。</li>
</ol>
3. 成虫外用实验（单点剂量或剂量反应实验）
注意：成虫外用实验采用丙酮作为溶剂。也可选用其他溶剂，但必须首先确认最终浓度在暴露后48小时内的致死率不超过10%。该实验可作为单剂量点或剂量反应实验进行，用于确定致死剂量（LD）。若进行后者，建议测试一系列浓度（至少五个），覆盖预期的LD50范围。
<ol>
	<li>确定完成该检测所需的成年雌性蚊子数量。 
	注意：单个化合物的单剂量检测至少需要90只蚊子（30只用于阳性对照，30只用于仅含丙酮的阴性对照，30只用于待测化合物）。</li>
	<li>培养3至5日龄的成年雌性蚊子，并使用吸虫器将其转移至单独的20 mL塑料杯中（图3）。</li>
	<li>用待测化合物的名称和浓度标记9盎司纸杯。为每个纸杯准备10 cm × 10 cm的纱网片和橡皮筋（见 图4）。</li>
	<li>选择一种现有杀虫剂作为阳性对照（例如，合成拟除虫菊酯类杀虫剂联苯菊酯），用丙酮配制1%的储备液（10 µg/µL）。 
	注意：计算时应考虑化合物的纯度。例如，对于纯度为99%的化合物，将10.1 mg溶解于1,000 µL丙酮中，即可获得1%的溶液。用石蜡膜密封后，于-20 °C保存。</li>
	<li>采用与上述相同的方法，配制待测化合物的储备液。 
	注意：许多待测化合物化学性质不稳定，建议每次进行生物测定前新鲜配制溶液。</li>
	<li>使用先前用丙酮冲洗过的20 mL玻璃小瓶，从储备液中按 图5 所示方法配制阳性对照和待测化合物的系列稀释液。</li>
	<li>用丙酮冲洗1 mL玻璃注射器，再用丙酮充满，并将其固定在微量施用器上，调整至可递送0.25 µL体积。</li>
	<li>以每批10只为单位，使用吸虫器从笼中取出3–5日龄的成年雌性蚊子，在冰箱或冰上于4 °C下麻醉最多5分钟。随后将蚊子转移至培养皿中，并置于冰上最多10分钟。</li>
	<li>迅速操作，用精细镊子夹取一只雌蚊，使用注射器微量施用器将0.25 µL待测溶液施加至其背部胸节。通过解剖显微镜观察确认化合物已成功递送，确保每只蚊子均接受准确体积的待测化合物。</li>
	<li>将处理后的蚊子转移至置于冰上的已标记纸杯中，重复操作共10次，以获得n = 10只处理蚊子。用纱网片覆盖杯口，并用橡皮筋固定密封，随后将纸杯转移至塑料箱或培养箱中，在恒定条件（28 °C，75–85%相对湿度，建议采用12小时光照/12小时黑暗循环）下培养。</li>
	<li>重复上述实验两次，以获得每个处理组或对照组n = 3个技术重复（即，总共30只蚊子）。</li>
	<li>依次对测试化合物和阳性对照重复步骤3.7–3.10。 
	注意：若蚊子数量充足，可增设另一项有用的对照，即一组不接受任何测试化合物或溶剂的30只麻醉蚊子，作为&#34;空白&#34;对照。</li>
	<li>在暴露后30分钟、60分钟、2小时、24小时和48小时（或其他替代时间点），使用评分表（表3）记录&#34;死亡/无反应&#34;蚊子的数量。若蚊子无活动能力，表现为侧卧或仰卧且无法飞行，则记为&#34;死亡/无反应&#34;。</li>
	<li>如需校正对照组死亡率，可采用修正的阿伯特公式计算： 
	死亡率（%）= (X - Y) × 100 / (100 - Y)， 
	其中X = 处理组的死亡率百分比，Y = 对照组的死亡率百分比。</li>
	<li>以直方图或指数曲线形式展示结果。对于剂量反应检测，计算待测化合物相对于对照的LD50、LD75或LD90值。</li>
	<li>至少重复该检测两次，使用不同批次的蚊子，以获得n = 3或更多的生物学重复。</li>
</ol>
4. 成虫吸血实验（单点剂量或剂量反应实验）
<ol>
	<li>收集约150只4至5日龄的成年雌性蚊子，并转移至单独的笼子中。若进行剂量反应实验，重复此步骤以获得6个笼子。在喂食实验前1至24小时移除糖源。</li>
	<li>按照前述方法配制化合物的储备液（需根据化合物纯度进行校正，典型储备液浓度为80 mM，溶于水或盐缓冲液中），然后根据需要在水或缓冲液中进行系列稀释。</li>
	<li>将每种稀释液各取40 µL加入960 µL脱纤维兔血中，以获得所需测试浓度。将膜片覆盖于饲喂装置上，并用橡胶圈密封。用移液器转移1 mL血液，将饲喂装置连接至加热装置。</li>
	<li>用新鲜配制的10%乳酸溶液轻轻擦拭膜表面，将饲喂装置放入成蚊笼中。用深色布料或黑色垃圾袋覆盖笼子，让蚊子自由取食一小时。</li>
	<li>对剩余的测试溶液及阴性对照（仅含血液）重复步骤4.2至4.4。</li>
	<li>喂食结束后，将笼子置于4 °C冰箱中5分钟以麻醉蚊子。移除雄蚊及未吸血的雌蚊，通过观察腹部判断并记录吸血完全和部分吸血的蚊子总数。</li>
	<li>保留部分吸血和完全吸血的雌蚊，每剂量组至少保留50只吸血雌蚊。</li>
	<li>将笼子转移至塑料桶或培养室中，在恒定条件下（28 °C，75–85%相对湿度）饲养，建议采用12小时光照/12小时黑暗循环。</li>
	<li>在喂血后0.5、1、1.5、2、24、48和72小时（或根据需要选择其他时间点），使用评分表（表4）记录各时间点死亡或无反应蚊子的总数。</li>
	<li>在吸血后第三天，向笼中放入产卵杯，连续收集72小时内的卵。在解剖显微镜下计数每种处理组产生的总卵数。</li>
	<li>根据每组处理及对照组中吸血雌蚊总数，计算死亡率和生殖力（产卵量）。如需，可使用修正的Abbott公式校正对照组死亡率。</li>
	<li>使用所选软件将毒性与生殖力数据绘制成直方图或指数曲线（若进行剂量反应实验），并计算测试化合物相对于对照的LD50、LD75或LD90值。</li>
	<li>至少重复实验两次，使用不同批次的蚊子，以获得n = 3或更多的生物学重复。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

杀虫剂是防控疟疾等蚊媒疾病的重要工具25登革热和寨卡病毒26大量使用杀虫剂已导致蚊虫种群对化学防治产生抗性，从而引发杀虫剂抗性的形成，这被认为是持续控制疾病面临的最大威胁。过去十年中，蚊虫种群数量急剧增加 按蚊属 对非洲蚊帐中使用的合成拟除虫菊酯（SPs）具有抗性的 spp.7. 种群 白纹伊蚊， 在佛罗里达州和新泽西州已发现对有机磷类杀虫剂具有抗性的登革热和寨卡病毒传播媒介6同样，已在种群中记录到对 DDT 和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性 按蚊属 和 伊蚊 哥伦比亚的 spp.27,28迫切需要开发新的幼虫杀灭剂和成虫杀灭剂，这些杀灭剂可结合已知分子靶点上的多种正构位点或变构位点，或干扰新的靶点即， 新颖的作用机制化学物质29,30 且对环境影响极小。此外，人们对利用内吸杀虫剂进行蚊虫控制的潜力也日益重视。31,32,33.
为了促进此类产品的快速开发，我们描述了一系列实验方案，旨在通过接触和摄食两种给药途径，评估小分子化合物对蚊虫幼虫和成虫的毒性。世界卫生组织（WHO）敏感性试验和美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲法等方案目前常用于评价现有杀虫制剂的毒性和驱避性1,2。然而，这些方法在分析未经配方处理的新化学实体（NCEs）时存在局限性，且难以适用于中高通量条件下大量化合物的筛选测试。
在此，我们描述了一种标准的幼虫实验方法，可用于快速评估新化学实体（NCEs）在单点剂量下的活性，并可扩展用于高通量分析。我们还描述了一种对LITE开发的实验方法的改进版本21 用于评估小分子化学物质对成年蚊虫的接触毒性。最后，我们描述了一种摄食实验，用于评估通过血液餐供给成年雌蚊的新型化学实体（NCEs）的毒性，并探讨其作为内服杀虫剂的潜力。这些幼虫和成虫实验可在一系列剂量下进行，以分别确定LC值和LD值；幼虫和成虫接触实验均可与一种或多种现有化学制剂进行比较。成虫局部给药实验还可实现对单只蚊虫LD值的计算。这些实验方案可用于多种蚊种 伊蚊，按蚊 和 库蚊16,29 可根据需要修改，以适应特定物种的生物学特性。根据我们的经验，灭蚊化学物质通常在这三个属中均表现出广泛的活性。16,29，但评估物种选择性具有重要意义。
这些检测方法可作为快速筛选多种化学物质杀虫活性的起点。在一种或多种检测中表现出毒性的化学物质可被选中，进一步通过二级和三级检测进行分析。例如LITE跗节检测和糖饲检测34,35。额外检测方法的选择通常取决于预期市场和应用场景，检测结果可为潜在的产品递送方式提供参考。在本文展示的代表性结果中，我们探讨了阿米替林（amitriptyline）的毒性作用；阿米替林是一种哺乳动物和无脊椎动物多巴胺受体拮抗剂，已被评估作为新型作用机制（MoA）杀虫剂的潜力10,12,13,16。阿米替林在微克（μg）浓度范围内对埃及伊蚊（Ae. aegypti）的幼虫和成虫均表现出毒性，提示其具有杀幼虫和杀成虫的活性，并为进一步探索基于阿米替林的化合物系列、以寻找高活性类似物提供了依据。在血液餐中暴露于阿米替林的埃及伊蚊（Ae. aegypti）中，未观察到其对死亡率或生殖力有显著影响。尽管该化学物质在去纤维化血液中的稳定性以及每只蚊子实际摄入的有效剂量尚不明确，但考虑到检测方法的显著局限性，这些数据表明阿米替林及其他作用于G蛋白偶联受体（GPCR）的化合物在未配方状态下可能作为内吸杀虫剂（endectocides）的潜力有限。
为限制不同实验之间的生物学变异，采取预防措施至关重要。所有实验均应在标准的温度和湿度条件下进行，最好在昆虫培养室中操作，以确保实验结果的可重复性。对表型终点的评分方法必须进行标准化，因为这些评估可能具有高度主观性，不同实验人员记录的数据可能存在显著差异。幼虫实验最适合用于评估可溶于水的化合物，尽管也可使用有机溶剂（如DMSO）进行实验，前提是每孔中溶剂的终浓度低于1%。我们认识到成虫点滴法存在若干局限性。首先，在配制系列稀释液和给药时必须快速操作，因为载体（丙酮）具有高挥发性，蒸发可能导致实际给药量出现差异。其次，应尽量缩短麻醉时间，以避免其对死亡率造成影响。还应注意，丙酮等溶剂在点滴实验开始后的最初几小时内可能引起快速的&#34;击倒&#34;效应，不应将其与测试化合物本身的作用相混淆。我们注意到，蚊虫个体间血餐体积存在差异，这使得在成虫摄食实验中难以准确评估每只成虫所摄入的剂量。最后，若阴性对照组的死亡率超过10%，则该实验数据不应被采纳。
具有协同作用的产品因其能够扩展现有产品的用途并控制杀虫剂抗性害虫种群而日益受到重视15,16,36。幼虫生物测定已被用于研究甲脒类杀虫剂胺甲萘（amitraz）与多种作用于无脊椎动物章胺受体的化学物质之间的协同效应14,15。本文所述的幼虫测定法以及成虫触杀测定法适用于评估不同测试化学物质组合之间的协同或相加效应。需要注意的是，诸如增效醚（piperonyl butoxide, PBO）等增效剂可被纳入本文描述的三种测定方法中的每一种。
上述所述的检测方法为评估未经配方处理的小分子药物对水生和陆生蚊虫生活阶段的作用提供了一套标准化的实验流程。这些检测方法专门用于评估药物毒性，相较于目前常用的检测方法具有多项优势。重要的是，这些方法适用于自动化操作，可在工业规模下进行，从而实现对数千种测试化合物的高效评估。最后，随着领域内逐步推进作用机制新颖的产品开发——包括作用于新分子靶点和生化通路的干预手段——除了死亡率和麻痹等传统指标外，对多种表型终点进行评分将变得至关重要。上述检测体系支持此类研究，因而为迈向未来高度创新的杀虫技术提供了重要一步。

蚊子传播影响全球人类健康的传染病病原体1。影响人类健康的三种最重要蚊属为Aedes、Anopheles和Culex。Aedes蚊种传播引起寨卡病毒病、登革热、黄热病和基孔肯雅热的虫媒病毒。Anopheles蚊种传播疟原虫，Culex蚊种传播西尼罗病毒和丝虫线虫2。世界卫生组织（WHO）已提出到2020年根除十种被忽视的热带病（NTD）的目标3，并确定蚊虫控制为最可行的策略。杀虫剂是控制蚊虫并减少疾病传播的有力工具4,5。然而，杀虫剂抗性蚊群的出现威胁着多种疾病的持续防控6,7,8。创新媒介控制联盟（IVCC）已启动首个专门致力于开发用于蚊虫控制的替代杀虫剂的项目9。为实现世卫组织的目标并有效控制疾病，亟需具有新颖作用方式（MoA）的新杀虫剂。发现和开发具有新颖作用方式的新杀虫剂类别，需要采用整体生物测定方法，以实现对化合物进行快速、高通量的分析，并与行业标准进行比较10。
有多种检测方法可用于评估杀虫剂对蚊虫幼虫和成虫的驱避性及毒性，其中一些方法适用于新型已配制或未配制化学物质的评价。世界卫生组织（WHO）标准操作程序11 是一种用于检测产品对四龄幼虫作用的接触试验。已发表的研究还描述了多种幼虫试验方法，用于检测小分子化合物对幼虫的毒性。 埃及伊蚊，冈比亚按蚊 和 致倦库蚊10,12,13,14,15,16疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲法通过评估致死浓度（LC）和致死时间（LT），并与商用杀虫剂的标准诊断剂量进行比较，用于检测野外捕获的成蚊种群对杀虫剂的抗性水平17世界卫生组织（WHO）敏感性测试提供了另一种评估成蚊杀虫剂抗性的方法，该方法将蚊子置于含有杀虫剂浸渍滤纸的玻璃小瓶中暴露1小时，随后在24小时时评估死亡率。18其他检测方法将喷雾制剂喷洒于密闭笼内，并在预定时间点记录蚊虫的击倒和死亡情况19通过在蚊子胸部进行局部施用，已用于评估不同杀虫剂的效力20利物浦昆虫测试机构（LITE）21 采用标准操作程序 用于评估化学物质对成蚊的生物活性。LITE成蚊局部施用试验通过将少量待测产品施加于成蚊胸部，并在48小时后记录死亡率，从而实现对每只蚊虫实际接收剂量的定量分析21LITE 趾垫试验用于评估受试产品对停留在化学处理表面的成蚊的毒性，可用于鉴定适于开发为室内滞留喷洒剂（IRS）或用于杀虫剂处理蚊帐（ITN）以控制蚊媒的候选化合物 按蚊属 蚊子。
世界卫生组织（WHO）和美国疾病控制与预防中心（CDC）的检测方法在测试新型、未配制的化学物质时存在局限性，而CDC瓶式生物测定法的目的是在较短的检测周期（两小时）内评估敏感性，而非毒性22,23此外，还可通过检测血液餐中递送化学物质的毒性，以及评估开发具有全身作用效果产品的潜力，来开展相关检测。即， 内吸杀虫剂）尚缺乏。本文介绍了检测新型化学物质对蚊虫幼虫和成虫杀灭活性的实验方法，这些化学物质可溶于水或多种有机溶剂之一。 伊蚊，按蚊 和 库蚊首先，我们展示一种先前由本研究组描述的幼虫实验方法10,12,13,16，此处用于：（1）通过单点剂量快速评估多种化合物的活性；（2）进行剂量反应实验，以确定致死浓度（例如， 液相色谱50, 液相色谱75 或 LC90,一种单一化学物质的测定。接下来，我们描述两种用于测定致死剂量（LD）的成蚊检测方法。第一种方法是对LITE方案的改进，用于将新型外用化学物质与阳性对照相比，测试其对成蚊的效果。第二种方法是通过血液餐递送化学物质的摄食检测法。

<table><tbody><tr><td>对杀虫剂敏感的蚊虫品系&amp;nbsp;</td><td>疟疾研究与试剂参考库&amp;nbsp;</td><td>https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx；推荐品系：埃及伊蚊利物浦（LVP）品系、冈比亚按蚊科苏木（KISUMU1）品系和致倦库蚊约翰内斯堡（JHB）品系</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>CAS 67-64-1</td><td>用于稀释和对照</td></tr><tr><td>阿米特拉嗪</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>CAS 33089-61-1</td><td>需用DMSO稀释</td></tr><tr><td>阿米替林</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>CAS：549-18-8</td><td>可用丙酮稀释</td></tr><tr><td>联苯菊酯</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>CAS：51529-01-2</td><td>用作阳性对照的合成拟除虫菊酯</td></tr><tr><td>顺式-(Z)-氟哌噻吨</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>CAS：51529-01-2</td><td>作为多巴胺样受体干扰剂进行药理学测试</td></tr><tr><td>去纤维蛋白兔血</td><td>止血钳</td><td>DRB0100</td><td>适应人工饲喂的蚊虫血液来源</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>MKBF2985</td><td>用于溶解阿米特拉兹的有机溶剂</td></tr><tr><td>Hemotek 膜饲系统&amp;nbsp;</td><td>Hemotek有限公司</td><td>序列号 1303</td><td>用于喂食蚊子</td></tr><tr><td>微施用器</td><td>Burkard Manufacturing Co.&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>进行局部应用实验所需的工具</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板（带盖）</td><td>康宁公司</td><td>3526</td><td>-</td></tr><tr><td>Advantage 橡胶带</td><td>Alliance Rubber Co.</td><td>-</td><td>用于密封纸杯</td></tr><tr><td>玻璃注射器（1 ml）</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>512004</td><td>微应用所需。玻璃优于塑料</td></tr><tr><td>一次性闪烁瓶（20 ml）</td><td>Fisher Scientific</td><td>74505-20</td><td>玻璃瓶可防止蒸发</td></tr><tr><td>白色纱布织物</td><td>沃尔玛</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>纸杯</td><td>Dixie Consumer Products LLC</td><td>PF15675/13D</td><td>用于在成蚊局部实验中饲养成蚊</td></tr><tr><td>培养皿（150 mm）</td><td>康宁生命科学</td><td>-</td><td>用于维持蚊虫的生存 &quot;睡眠&quot; 在低温环境中，避免与冰直接接触</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>用于分选幼虫</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ6045</td><td>用于幼虫实验评分和微操作应用</td></tr><tr><td>镊子（精细）</td><td>Fontax&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>用于处理成年蚊子</td></tr></tbody></table>

测试新型杀虫化学物质对蚊虫毒性的实验方案

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

需要具有新颖作用机制的新类型杀虫剂，以控制传播寨卡病毒、登革热和疟疾等疾病的抗药性蚊虫种群。本文介绍了针对蚊虫幼虫和成虫的未配制新型化学物质进行快速、高通量分析的检测方法。我们描述了单点剂量和剂量反应检测的实验方案，用于评估小分子化学物质对蚊虫的毒性 Aedes aegypti 寨卡病毒、登革热和黄热病的传播媒介&#160;疟疾传播媒介， Anopheles gambiae 以及北方家蚊， 致倦库蚊 通过接触和摄食途径。例如，我们通过幼虫试验、成虫局部施用试验和成虫吸血试验，评估了阿米替林（amitriptyline）——一种G蛋白偶联受体的小分子拮抗剂——的毒性。这些实验方案为探究杀虫潜力提供了起点。文中结合进一步实验，讨论了结果在产品应用及递送机制研究中的意义。

图6 显示L3的死亡率百分比 埃及伊蚊 在暴露于多巴胺受体拮抗剂阿米替林五个剂量后，分别于24、48和72小时与仅含水的阴性对照组比较。本示例中，各时间点收集的数据均呈现典型的对数曲线，揭示阿米替林对幼虫死亡率具有剂量依赖性效应。LC50 值在实验的时间过程中逐渐降低，可利用72 h的数据进行计算（即， 对数曲线的中点。
图7显示了3至5日龄成年雌性埃及伊蚊（Ae. aegypti）在暴露于多巴胺受体拮抗剂阿米替林（400 µM剂量，即10 µg/µL）后的死亡率百分比，并与合成拟除虫菊酯类杀虫剂联苯菊酯阳性对照（原药级；500 pg/µL）、仅丙酮阴性对照以及未处理蚊虫（空白）进行了比较。本示例中，阿米替林和联苯菊酯相对于阴性对照均引起显著的成蚊死亡率。请注意，成蚊死亡率随时间推移而下降，推测是由于测试化合物被代谢解毒所致。
图8 显示了用含四种不同浓度多巴胺受体拮抗剂阿米替林的血液餐饲喂后，3-5日龄成年雌性 Ae. aegypti 的死亡率（左侧y轴），以及与对照组蚊虫（仅饲喂血液；阴性对照）相比，首次生殖营养周期的繁殖力（右侧y轴；每只雌蚊平均产卵数）。数据表明，与对照组相比，阿米替林对成蚊死亡率无显著影响，但在最高剂量（400 µM）下显著提高了繁殖力。
<img alt="浓度梯度实验的微孔板检测设置；用于化学或生物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1．幼虫剂量反应检测的设置。 图像显示使用埃及伊蚊（Aedes aegypti）L3幼虫在24孔板中进行的幼虫剂量反应检测的设置情况。
<img alt="幼虫实验；方法步骤，24孔板中的稀释系列；毒理学实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2。在24孔板中进行（A）单点剂量或（B）剂量反应幼虫实验的操作流程示意图。 将五条L3幼虫转移至各孔后，用移液器轻轻吸除多余水分，并替换为新鲜的无菌ddH2O。随后，制备待测化合物的母液及系列稀释液，并加入孔中，使每孔终体积为1 mL。<a href="/files/ftp_upload/57768/57768fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在封闭环境中进行蚊子的实验室实验，观察其行为以用于昆虫学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3．成蚊的培养。 图像显示用于培养成蚊的 20 L 塑料桶，以及使用吸蚊器移除蚊子的过程。
<img alt="纸杯中的蚊虫 containment 实验；带细密网罩的生物学研究装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4．使用 4–5 日龄雌性 Aedes aegypti 进行的成蚊触杀试验。 经化合物或溶剂处理后，将成蚊置于纸杯中，并转移至测试室中完成整个试验过程。
<img alt="蚊虫给药稀释过程示意图；从储备液到工作液；显示浓度梯度步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5．储备液与系列稀释液。 示意图显示成年蚊虫局部接触法所用（A）储备液和（B）系列测试溶液的配制流程。<a href="/files/ftp_upload/57768/57768fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="阿米替林的剂量-反应曲线；死亡率与浓度关系；24、48、72小时数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6。幼虫接触剂量-反应实验的代表性数据。 代表性数据来自一项幼虫接触剂量-反应实验，显示埃及伊蚊（Aedes aegypti）三龄幼虫在暴露于多巴胺受体拮抗剂阿米替林后24、48和72小时的死亡率百分比。每个数据点代表以 µM 为单位的平均值 ± 标准误（SEM）。数据来自 n = 3 次生物学重复实验。
<img alt="杀虫剂功效柱状图；死亡率随时间变化；联苯菊酯与阿米替林对比；包含对照组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7成人局部剂量反应实验的代表性数据。 成年个体局部剂量反应实验的代表性数据，显示多巴胺受体拮抗剂阿米替林（amitriptyline）的毒性（10 µg/µL) 至 3-5 日龄雌性 Aedes aegypti 相对于合成拟除虫菊酯联苯菊酯（500 pg/µL阳性对照和阴性对照（仅丙酮溶剂）在 2、24 和 48 h. 数据代表 3 次生物学重复实验。误差线表示标准误（SEM）。
<img alt="阿米替林对死亡率和繁殖力的影响；剂量浓度分析柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57768/57768fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8。成年蚊虫摄食实验的代表性数据。 成年蚊虫摄食实验的代表性数据，显示多巴胺受体拮抗剂阿米替林在100 µM、200 µM和400 µM剂量下对3-5日龄雌性埃及伊蚊（Aedes aegypti）的毒性作用及其对繁殖力的影响（以首个生殖营养周期内每只雌蚊平均产卵总数表示）。数据为3次生物学重复实验的结果，误差线表示±标准误（SEM）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="6">A. 三种化学物质的单点剂量实验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td colspan="5">浓度（400 µM）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Amitriptyline </td>
			<td colspan="5">80 mM 储液：2 mg 阿米替林 × 98%（粉末纯度）× 0.001 g/1 mg × 1 mol /313.86 g × 1 L/0.08 mol × 106 µL/L = 78.06 µL 水。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">系列稀释：用 ddH2O 将储液按 1:2 稀释，再按 1:4 稀释，得到 10 mM 溶液。向含有 960 µL ddH2O 的孔中加入 40 µL 10 mM 储液，使终浓度为 400 µM/孔。将 10 mM 储液按 1:2 进行系列稀释，制备 5 mM、2.5 mM、1.25 mM 和 0.625 mM 的储液。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cis-(z)-flupenthixol</td>
			<td colspan="5">80 mM 储液：2 mg cis(z)-氟奋乃静 × 98%（粉末纯度）× 0.001 g/1 mg × 1 mol/507.44 g cis(z)-氟奋乃静 × 1 L/0.08 mol × 106 µL/L = 48.28 µL 水。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">系列稀释：同上。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Amitraz</td>
			<td colspan="5">80 mM 储液：2 mg 胺甲唑 × 0.001 g/1 mg × 1 mol/293.4 g 胺甲唑 × 1 L/0.08 mol × 106 µL/1 L = 85.21 µL DMSO（注意：胺甲唑仅溶于 DMSO）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">系列稀释：同上。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">B. 剂量反应实验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">化学物质</td>
			<td>剂量 1</td>
			<td>剂量 2</td>
			<td>剂量 3</td>
			<td>剂量 4</td>
			<td>剂量 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 µM</td>
			<td>200 µM</td>
			<td>100 µM</td>
			<td>50 µM</td>
			<td>25 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">例如：Amitriptyline、cis-(Z)-flupenthixol 或 amitraz</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>40 µL </td>
			<td>40 µL</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>40 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM 储液</td>
			<td>5 mM 储液 </td>
			<td>2.5 mM 储液 </td>
			<td>1.25 mM 储液 </td>
			<td>0.625 mM 储液  </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 埃及伊蚊（Aedes aegypti）三龄幼虫（A）单点剂量实验和（B）剂量反应实验的计算示例。
<img alt="用于记录剂量反应、死亡数及随时间变化的百分比分析的蚊子幼虫实验数据表。" src="/files/ftp_upload/57768/57768tbl2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表 2"> 
表 2. 用于记录蚊子幼虫剂量反应实验数据的示例评分表。 对照组为仅含水、或含1% DMSO或其他溶剂的水溶液。测试小分子拮抗剂类化合物（如阿米替林）时常用的剂量为 25 µM、50 µM、100 µM、200 µM 和 400 µM。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="7">蚊虫成虫（3-5日龄）体表施药试验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">开始日期：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">实验人员：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">物种/品系：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">试验类型：单点剂量/剂量反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">A. 死亡数（死亡蚊虫数量）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间（小时）</td>
			<td>剂量1</td>
			<td>剂量2</td>
			<td>剂量3</td>
			<td>剂量4</td>
			<td>剂量5</td>
			<td>对照组</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">B. 死亡率（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间（小时）</td>
			<td>剂量1</td>
			<td>剂量2</td>
			<td>剂量3</td>
			<td>剂量4</td>
			<td>剂量5</td>
			<td>对照组</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 用于记录成年个体局部剂量反应试验数据的示例评分表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="7">蚊虫成虫（3-5日龄）摄食实验</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">实验开始日期：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">研究人员：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">物种/品系：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">实验类型：单点剂量/剂量反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">A. 摄食蚊虫数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>剂量 1</td>
			<td>剂量 2</td>
			<td>剂量 3</td>
			<td>剂量 4</td>
			<td>剂量 5</td>
			<td>对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>已摄食</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未摄食</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>摄食率（%）</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未摄食率（%）</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">B. 死亡率（死亡蚊虫数量）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间（小时）</td>
			<td>剂量 1</td>
			<td>剂量 2</td>
			<td>剂量 3</td>
			<td>剂量 4</td>
			<td>剂量 5</td>
			<td>对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">C. 死亡率百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间（小时）</td>
			<td>剂量 1</td>
			<td>剂量 2</td>
			<td>剂量 3</td>
			<td>剂量 4</td>
			<td>剂量 5</td>
			<td>对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4. 用于记录成年蚊虫吸血实验数据的示例评分表。 测试小分子拮抗剂化合物（如阿米替林）的典型剂量为 50 µM、100 µM、200 µM 和 400 µM。

本文描述了用于评估化学物质对幼蚊和成蚊毒性的实验方案，旨在开发新型的杀幼蚊剂、杀成蚊剂和内吸杀虫剂。这些方案支持对多种化学物质在单一剂量条件下进行高通量测试，并可通过剂量反应实验进一步评估其通过接触或摄食途径产生的毒性效应。

需要研发具有新型作用机制的杀虫剂新类别，以控制传播疾病的蚊虫中已产生杀虫剂抗性的种群。

该方法有助于解答杀虫剂研发和病媒控制领域中的关键问题，例如，未经配方处理的化学物质对蚊子幼虫或成虫群体的毒性如何？该化学物质是否具有开发为幼虫杀灭剂或成虫杀灭剂的潜力？此外，最有效的递送途径可能是什么？该技术的主要优势在于，可用于评估未经配方处理的化学物质的毒性，评估一种化学物质对多种媒介蚊虫的毒性，并且能够扩大规模，以高通量方式评估数百种化合物。本次实验操作将由我实验室的科研技术员 Jasleen Kaur 演示。首先，标记一个24孔组织培养板的各孔。使用分析天平称取待测化合物。然后，将该化合物溶于1.5 mL离心管中的无菌双蒸水中，配制成80 mM的储备液。接下来，使用双蒸水对原液进行连续稀释，以配制所需浓度的工作液。注意在将幼虫加入孔板、去除多余水分以及添加待测化合物时需格外小心，避免对幼虫造成物理损伤。损伤可能增加幼虫死亡率，从而导致假阳性结果或使实验无效。使用宽口塑料移液管将五只三龄幼虫转移至板的每个孔中。然后，用1 mL移液器轻轻吸去孔中液体，并替换为所需体积的双蒸水。在吸去液体时需小心操作，避免触碰幼虫，同时动作要迅速，以确保幼虫不会干燥。通过将测试化合物沿塑料孔的对侧加入，轻柔地完成加样。向每个孔中加入适量的测试溶液，并轻轻旋转培养板以确保均匀混合。将培养板置于生长培养箱中，在25摄氏度、75%至85%相对湿度条件下保持12小时光照/12小时黑暗的循环。为观察幼虫运动情况，可轻轻敲击培养板。若未观察到活动，可用无菌牙签轻轻触碰幼虫。若幼虫无任何反应，则记为死亡，并在文本方案所述的时间点，使用记分表记录每个孔中死亡幼虫的总数。将三至五日龄的成年雌蚊饲养于20升的塑料笼中。用测试化合物的名称和浓度标记九盎司纸杯。接着，在20 mL玻璃小瓶中用丙酮配制浓度为10 mg/mL的测试化合物储备液。然后，将储备液进行系列稀释，以获得所需的工作浓度。用丙酮清洗1 mL玻璃注射器。然后吸入适当浓度的待测溶液。将注射器固定在微量施用器上，并调节至递送0.25 µL体积。接下来，使用吸虫器从笼中移出10只三至五日龄的成年雌性蚊虫。在4摄氏度下麻醉5分钟，然后将蚊虫转移至培养皿中。将培养皿置于冰上10分钟。为避免损伤成蚊而导致死亡，确保其在冰箱中麻醉时间不超过5分钟，或在冰上固定时间不超过10分钟，并尽量减少对蚊虫的操作。如果具备冷台以及带有可移动载物台的显微操作仪，则可进一步减少对蚊虫的接触操作。使用精细镊子将每只蚊子从培养皿中取出。在解剖显微镜下，用注射器微量点样器将 0.25 µL 测试溶液滴加至蚊子的背部胸区。接着，将蚊子转移至预先标记并置于冰上的纸杯中。用 10 cm × 10 cm 的网状方格和橡皮筋密封纸杯。然后，将纸杯转移至培养箱中，并按照前述方法记录死亡蚊子的数量。用吸虫器收集约150只4至5日龄的成年雌蚊，并将其转移至单独的笼子中。在喂食实验前1至24小时移除糖源。用水配制80 mM的待测化合物储备溶液。然后用水进行连续稀释，以获得所需浓度的工作储备液。为获得所需的测试浓度，取每种稀释液40 µL加入含有960 µL脱纤维兔血的1.5 mL离心管中，并通过移液混匀。将滤膜置于喂食装置上，并用橡胶圈密封。接下来，使用移液器将1 mL血液与检测试剂通过喂养单元背面的输送口转移。将喂养单元连接至加热装置。然后，用新配制的10%乳酸溶液轻轻擦拭膜表面。将饲喂装置放入蚊笼中。用深色布料覆盖蚊笼，让蚊子饲喂一小时。蚊子吸血后，将蚊笼置于4°C冰箱中5分钟，以麻醉蚊子。然后，统计并记录笼中蚊子的总数。通过观察腹部，统计并记录完全吸血和部分吸血的雌蚊总数。每个剂量组应至少获得50只吸血雌蚊。移除所有未吸血的蚊子。接着，将笼子转移到培养箱中，并使用记录表在相应的时间点记录死亡蚊子的数量。在吸血后的第三天，将一个产卵杯放入笼中，持续 72 小时。使用解剖显微镜统计每种处理条件下产生的卵的总数。通过幼虫接触实验评估阿米替林（一种多巴胺受体拮抗剂）对幼虫随时间推移的致死效应。实验数据显示，随着实验时间的延长，LC50值逐渐降低。将阿米替林对成年雌性蚊虫死亡率的影响与联苯菊酯及两种阴性对照进行了比较。与丙酮处理组和未处理阴性对照组相比，阿米替林和联苯菊酯在各个实验时间点均引起显著的死亡率。通过定量摄食实验，评估了三种不同剂量的阿米替林对成年雌性蚊虫生殖力及死亡率百分比的影响。数据显示，在最高剂量下饲喂阿米替林的蚊子与仅饲喂血液的对照组相比，其繁殖力无统计学上的显著差异。一旦掌握，此处所述的任何一项检测方法，若操作得当，单人约两小时内即可完成。在进行该实验操作时，重要的是要记住轻柔地处理生物体，并在局部施用以及幼虫或成虫检测评分过程中保持一致性。通过此操作步骤，还可进行其他方法，如通过蚊虫跗节吸收来评估毒性的生物测定法、CDC瓶法以及WHO管法，以进一步回答有关未配制化学物质或配制产品作为触杀型杀虫剂或空间喷雾剂在功效及开发潜力方面的其他问题。

protocols-for-testing-toxicity-novel-insecticidal-chemistries-to

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

新型杀虫化学对蚊子毒性测试规程

在本视频中，我们介绍了一种幼虫接触实验方法，用于评估多巴胺受体拮抗剂阿米替林对多种人类传染病已知传播媒介——蚊子三龄幼虫的毒性作用。通过在不同时间间隔下，将幼虫与不同浓度的阿米替林共同孵育，观察其死亡率，从而确定阿米替林的半数致死浓度（LC50）。...

幼虫接触实验：一种通过直接接触测试杀幼虫化合物评估蚊虫幼虫死亡率的操作流程

在本视频中，我们演示了通过点滴法检测潜在杀虫剂对成年雌性蚊虫的毒性。该方法利用一种多巴胺受体拮抗剂，该拮抗剂可导致蚊虫神经传递发生致死性抑制，从而评估杀虫剂经体表施用后的毒理效应。...

局部施用测试实验：通过局部施用评估多巴胺受体拮抗剂对成年雌性蚊虫杀虫潜力的技术方法

本视频展示了一种通过血液饲喂来评估具有新型作用机制的测试化合物对雌性蚊虫致死率和生殖力影响的实验方法。该技术有助于筛选新型杀虫剂，以杀灭抗药性蚊虫种群并控制疾病传播。...

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用于检测表观遗传药物对疟疾蚊虫发育、繁殖力及存活率影响的毒理学实验

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我们描述了用于测定蚊虫和果蝇杀虫剂敏感性的局部施用生物测定法的方法学及其重要性。本方法通量高，利用昆虫的总质量——从而能够计算基于质量归一化的致死剂量而非浓度——且相较于其他类似方法可能具有更低的变异性。...

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蚜虫是植物病毒的有效传播媒介。蚜虫病毒显微注射技术，也就是我们今天将向您展示的方法，是一种允许研究人员将病毒直接注入蚜虫血腔的技术，从而绕过肠道——这是病毒以循环方式传播的两大主要屏障之一。该技术同样可用于注射dsRNA以进行RNA干扰（RNAi）。...

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我们描述了一种新型的红色荧光蛋白（RFP）报告基因，该报告基因特异性地在黑腹果蝇（Drosophila）眼部表达。本文详细介绍了眼成虫盘的解剖方法，以及如何利用该报告基因辅助解剖并鉴定发育过程中眼部的特定细胞类型。...

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