Name: 光片荧光显微术在小鼠心脏研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习光片荧光显微术结合光学透明化技术对小鼠心脏进行快速成像的方法。该技术可观察基因治疗后心脏结构变化，适用于发育心脏病学及神经学等多领域研究。

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作者谨向加州大学洛杉矶分校（UCLA）的 Thao Nguyen 和 Atsushi Nakano 致谢，感谢他们提供用于成像的小鼠样本。本研究获得了以下资助：NIH HL118650（授予 Tzung K. Hsiai）、HL083015（授予 Tzung K. Hsiai）、HD069305（授予 N. C. Chi 和 Tzung K. Hsiai）、HL111437（授予 Tzung K. Hsiai 和 N. C. Chi）、HL129727（授予 Tzung K. Hsiai）以及德克萨斯大学系统 STARS 项目资助（授予 Juhyun Lee）。

所有涉及动物使用的操作程序均已获得加利福尼亚大学洛杉矶分校机构审查委员会（IACUC）的批准。
1. 成像系统设置
注意：参见图1和图2。
<ol>
	<li>取一个具有三个波长的连续波（CW）激光器：405 nm、473 nm 和 532 nm。将两个反射镜（M1 和 M2）相距 150 mm 放置，并将其镜面与光束成 45° 对齐。 
	注意：此步骤用于将激光从双侧照明装置中偏转出去。所得光束方向将与初始光束方向相同。</li>
	<li>使光束依次通过一个直径为 25 mm 的虹膜光阑/针孔（PH）、一个直径为 50 mm 的中性密度滤光片（NDF）（光密度范围为 0 - 4.0）、一个扩束器（BE）、一个宽度约为 0 - 6 mm 的 30 mm 狭缝（S）以及一个反射镜（M3），所有元件之间相距 150 mm。将反射镜放置为其镜面与光束成 45°。</li>
	<li>使光束通过一个距离 M3 为 150 mm 的 50:50 分束器。在分束器前方 150 mm 处放置一个反射镜（M6），并将其镜面与向前发射的光束成 45° 对齐。利用反射光束构成双侧照明光片的一侧。</li>
	<li>在分束器另一侧 150 mm 处放置一个反射镜（M4），并将其镜面与从分束器以 90° 角发射出的光束成 45° 对齐。在 M4 前方 150 mm 处放置第二个反射镜（M5），并将其镜面与从 M6 反射的光束成 45° 对齐。利用从 M5 发射出的光束构成双侧照明光片的另一侧。</li>
	<li>以对称方式搭建双侧照明系统（见图 1）。在一侧，将一个柱面透镜（CL1）[直径（d）= 1 英寸；焦距（f）= 50 mm] 沿从 M5 发射的光束方向放置，距离为 150 mm；在另一侧，将另一个相同的柱面透镜（CL2）沿从 M6 发射的光束方向放置，距离也为 150 mm。在两个柱面透镜的光路中分别放置两个反射镜（M7 和 M8），距离透镜 50 mm，用于将光束以 90° 反射。</li>
	<li>使用一对透镜组成一个消色差双合透镜。将第一个透镜 L1（d = 1 英寸；f = 100 mm）放置在距离 M7 100 mm 处，第二个透镜 L2（d = 1 英寸；f = 60 mm）放置在距离 L1 160 mm 处。在双侧照明系统的另一侧，使用相同规格的透镜（L3、L4）重复此配置，距离 M8 相同。</li>
	<li>分别在距离透镜 L2 和 L4 60 mm 处沿光束方向放置反射镜 M9 和 M10。将照明物镜 OL1 和 OL2（d = 2 英寸；f = 150 mm）分别放置在距离 M9 和 M10 150 mm 处，并与光束对齐。从物镜发射出的光束形成用于样品成像的光片。</li>
	<li>使用 3D 打印机以丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）材料打印样品 holder。在样品室两侧垂直于照明光束方向嵌入一片盖玻片 [折射率（RI）= 1.4745]，以最小化折射率失配。将样品室均匀地置于两个物镜发射的光束之间。</li>
	<li>安装一台配备 1X 放大倍率物镜和科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的体视显微镜，使其垂直于照明平面（见图 2）。</li>
</ol>
2. 成像系统校准
<ol>
	<li>取直径为 0.53 μm 的荧光聚苯乙烯微球。</li>
	<li>通过将微球溶液用折射率匹配溶液（RIMS）稀释至 1:150,000，并加入 1% 低熔点琼脂糖进行荧光微球样品的制备。将一段内径为 12 mm、外径为 18 mm 的硼硅酸盐玻璃管切割成 30 mm 长。 
	注意：硼硅酸盐玻璃管用于匹配折射率（1.47）。</li>
	<li>将稀释后的微球样品与 1% 琼脂糖混合，用移液器将微球/琼脂糖溶液注入硼硅酸盐玻璃管中。在室温（23 °C）下使琼脂糖凝固。</li>
	<li>用 99.5% 的甘油溶液填充 ABS 腔室（来自步骤 1.7）。将含有微球的硼硅酸盐玻璃管放入腔室内。将 ABS 腔室置于成像系统中，使其位于双光源系统产生的高斯光束中心。</li>
	<li>将三维电动平移台连接至硼硅酸盐玻璃管，以控制样品在 ABS 腔室内的移动和取向（见补充图 1）。</li>
	<li>使用 sCMOS 相机以每秒 30 帧（fps）的速率采集图像。利用电机控制器，将样品在横向移动 1 mm，并使用 sCMOS 相机在每个 1-mm 增量处采集图像。持续进行，直至完成整个样品的成像。</li>
	<li>使用可视化软件对采集的图像进行堆叠（见材料表）。利用这些微球图像测量系统的点扩散函数（PSF）。在后续步骤的图像处理中，使用该 PSF 进行去卷积。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>在P7阶段，从野生型P1小鼠以及携带Rosa26-YFP基因的双杂合肌脂蛋白-Cre基因敲入小鼠（SlnCre/+; R26YFP reporter/+）中解剖心脏。 
	注意：安乐死采用戊巴比妥钠，并依据Robbins 等10所描述的技术进行。解剖操作按照美国国家心肺血液研究所（NHLBI）所述技术进行10,11。</li>
	<li>按照Kevin Sung 等12所述方法对小鼠心脏进行化学透明化处理。 
	注意：由于所用化学试剂具有毒性，以下步骤应在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗心脏，每次10分钟，共清洗3次。清洗后，将心脏置于4%多聚甲醛溶液中，并于4 °C下过夜孵育。</li>
		<li>将样品置于含0.5% w/v 2,2’-偶氮双（2-甲基丙脒）二盐酸盐的4%丙烯酰胺溶液中，于4 °C下过夜孵育。过夜孵育后取出样品，并在37 °C下继续孵育2–3小时。</li>
		<li>用PBS清洗样品，然后将其放入含8% w/v十二烷基硫酸钠和1.25% w/v硼酸的溶液中。于37 °C孵育至组织完全透明。所需时间取决于样品厚度，可能需要数小时。透明完成后取出样品，置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中1天。</li>
		<li>将40 g非离子密度梯度介质（见材料表）溶于30 mL 0.02 M磷酸缓冲液（PB）、0.1% Tween-20和0.01%叠氮化钠中，配制折射率匹配溶液。用氢氧化钠调节溶液pH至7.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将透明化处理后的样品置于折射率为1.46–1.48并含有1%琼脂糖的RIMS溶液中。将样品插入硼硅酸盐玻璃管中，并在室温（23 °C）下使琼脂糖凝固。</li>
	<li>将三维电动平移台连接至硼硅酸盐玻璃管，以控制样品在3D打印ABS腔室内的移动与方向（见补充图1）。</li>
</ol>
4. 成人心脏成像
<ol>
	<li>将含有心脏特异性肌钙蛋白T启动子（cTnT）和绿色荧光蛋白（GFP）的腺相关病毒载体9型（AAV9）病毒8.7 × 1012个，以100 μL体积注射至2月龄野生型（C57BL/6）小鼠尾静脉中。 
	注意：AAV9的构建依据Yuan et al.13所述技术进行。该操作可使GFP与肾外髓钾通道（ROMK）结合，从而产生AAV9-cTnT-ROMK-GFP（参见材料表）。</li>
	<li>按照美国国家心肺血液研究所（NHLBI）11所述方法，在7.5月龄时解剖成年小鼠心脏。使用步骤3.1–3.3制备样品。</li>
	<li>将电机控制器连接至电机执行器。将执行器固定于硼硅酸盐玻璃管上，以控制样品在3D打印的ABS腔室内的移动和方向。</li>
	<li>调整样品位置，使其位于双光源系统产生的高斯光束中心。使用sCMOS相机以100 fps的速率采集图像。</li>
	<li>通过电机控制器，沿轴向移动样品1 mm，并使用sCMOS相机在每个1 mm增量处采集图像。持续操作直至完成整个样品的成像。 
	注意：系统由自主开发的仪器控制软件进行控制。</li>
	<li>使用可视化软件对采集的图像进行堆叠（参见材料表）。利用这些图像堆栈和可视化软件生成三维图像14。将步骤2.6中获得的点扩散函数（PSF）与图像堆栈进行去卷积处理。设定像素强度阈值以观察心脏轮廓，并根据灰度强度为图像添加伪彩色。</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的光片荧光显微镜（LSFM）系统与技术采用双侧照明光束结合光学透明化方法，对小鼠出生后及成年阶段的心脏进行成像。传统的单侧照明光束在穿透较厚或较大的组织样本时，易受到光子散射和吸收的影响1,3。双侧照明光束可实现对样本更均匀的照明，从而最大限度地减少因单侧照明所导致的条纹状伪影及其他成像伪迹。该技术还可通过调节双高斯光束的位置，增加可成像样本的尺寸8。当双光束达到最大间距时，能够对尺寸达数毫米的组织样本进行成像，例如成年小鼠心脏；而单侧照明则仅限于对较小的心脏（如斑马鱼和Drosophila的心脏）进行成像。
在光学不透明的组织中进行荧光成像更具挑战性，因为光散射在组织样本中的分布可能并不均匀。这限制了样本可成像的深度以及荧光成像的效果。因此，通常会使用斑马鱼等天然具有光学透明组织的生物模型5。然而，对于皮肤本身不具备光学透明性的生物，已有多种光...

光片荧光显微镜是一种最早于1903年开发的技术，如今被用于研究基因表达，以及构建组织样本的三维（3-D）或四维（4-D）模型1,2,3。该成像方法利用一束薄层光线照射样本的单一层平面，使探测器仅捕获该平面的图像。随后可通过沿轴向移动样本，逐层采集每一断面的图像，并在对所获取图像进行后期处理后重建出三维模型4。然而，由于光子的吸收和散射效应，光片荧光显微镜的应用目前仅限于厚度为数微米或光学透明的样本1。
光片荧光显微镜（LSFM）的局限性促使研究人员广泛选择组织光学透明的生物体进行研究，例如斑马鱼。由于人类与斑马鱼之间存在保守的基因，涉及心脏发育和分化的研究通常以斑马鱼为模型5,6。尽管这些研究推动了与心肌病相关的心脏研究进展6,7，但仍需在哺乳动物等更高等的生物体上开展类似研究。
由于哺乳动物心脏组织较厚且不透明，红细胞中的血红蛋白会造成光吸收，同时在传统的光片显微镜（LSFM）方法下单侧照明会导致条纹伪影，因此成像具有挑战性1,8。为克服这些局限性，我们提出采用双侧照明，并结合简化版的CLARITY技术9与折射率匹配溶液（RIMS）。因此，该系统能够对体积超过10 × 10 × 10 mm3的样本进行成像，同时在轴向和侧向平面上保持良好的分辨率8。
首先使用排列在玻璃管内不同构型的荧光微球对该系统进行校准。随后，利用该系统对新生期和成年小鼠心脏进行成像。首先，在出生后7天（P7）对新生小鼠心脏进行成像，以显示心室腔、心室壁厚度、瓣膜结构以及小梁的存在情况。其次，通过使用出生后1天（P1）携带Cre标记的心肌细胞和黄色荧光蛋白（YFP）的新生小鼠心脏，开展研究以鉴定将分化为心肌细胞的细胞。最后，对7.5个月大的成年小鼠进行成像，以观察基因治疗后肾外髓钾（ROMK）通道的存在情况8。

<table><tbody><tr><td>连续波激光器</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>用于激发荧光染料</td></tr><tr><td>中性密度滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>控制进入系统的光量</td></tr><tr><td>消色差光束扩束器</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>扩展光束</td></tr><tr><td>机械狭缝</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>控制光束宽度</td></tr><tr><td>分束器</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>形成双照明光束</td></tr><tr><td>配备1X物镜的体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>用于样品观察</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT sCMOS相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>用于图像采集</td></tr><tr><td>丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>用于3D打印样品支架的材料</td></tr><tr><td>荧光聚苯乙烯微球</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>用于成像系统校准</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>用于样品包埋的管材</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>样品腔填充介质</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>小鼠心脏冲洗溶液</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>RT-15700</td><td>第一次孵育溶液</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>与2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐混合，作为小鼠心脏的第二次孵育溶液</td></tr><tr><td>2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>与丙烯酰胺混合，作为小鼠心脏的第二次孵育溶液</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>与硼酸混合，作为小鼠心脏的第三次孵育溶液</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>与十二烷基硫酸钠混合，作为小鼠心脏的第三次孵育溶液</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>与PB、Tween-20和叠氮化钠混合，作为折射率匹配溶液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>与Sigma D2158、PB和叠氮化钠混合，作为折射率匹配溶液</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>与Sigma D2158、PB和Tween-20混合，作为折射率匹配溶液</td></tr><tr><td>携带心肌特异性肌钙蛋白T启动子并标记GFP的腺相关病毒载体9</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>与ROMK结合时表达GFP</td></tr><tr><td>直流伺服电机执行器</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>用于样品在光片中轴向移动</td></tr><tr><td>K-Cube直流伺服电机控制器</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>连接电机执行器并控制其运动</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>用于生成二维和三维图像的可视化软件</td></tr></tbody></table>

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

光片荧光显微镜已广泛用于在微米至毫米尺度上快速获取具有高轴向分辨率的图像。传统的光片技术采用单束照明光垂直照射样品组织。使用单束照明光对大尺寸样品成像时，由于组织对光的散射和吸收，图像中会出现条纹或伪影，并导致分辨率降低。本研究采用双侧照明光束结合简化的CLARITY光学透明技术，对小鼠心脏进行处理。这些技术通过清除心脏中的脂质，实现更深层的成像，并获得超过10 × 10 × 10 mm3的大视野成像范围。因此，该策略使我们能够定量分析心室尺寸，追踪心肌细胞谱系，并在从出生后到成年小鼠心脏中，以足够的对比度和分辨率定位心脏特异性蛋白和离子通道的空间分布。

本文所述技术采用双侧照明光束结合小鼠心脏组织样本的光学透明化处理，以实现更深层的成像深度和更大的成像体积，同时保持足够的成像分辨率（图1）。为校准系统，将荧光微珠置于玻璃管内并放入成像系统中。随后在 x-y 平面、y-z 平面和 x-z 平面成像并可视化微珠，以获取系统的点扩散函数（PSF）8。当使用甘油作为包埋介质时，系统校准结果显示横向分辨率为 dlateral ≈ 2.8 µm，轴向分辨率在 XZ 方向为 dXZ ≈ 17.4 µm，在 YZ 方向为 dYZ ≈ 17.9 µm8。
使用荧光微珠完成校准后，成像系统用于采集出生后1天和7天小鼠心脏的图像（图2）<sup ...

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。

光片荧光显微镜已广泛用于以高轴向分辨率对微米至毫米尺度的样本进行快速成像。

该技术的主要优势在于能够快速成像小鼠心脏，并可用于观察基因治疗后气道的存在情况。尽管该方法可为发育心脏病学研究提供见解，但也同样适用于其他系统，如神经学和肺病学。通常，人们在使用该技术时会遇到困难，因为成年小鼠心脏的成像制片较为复杂，且该技术不同于共聚焦显微镜和倒置显微镜等其他传统技术。放置一个具有 405 纳米、473 纳米和 532 纳米三种波长的连续波激光器。然后，安装第一面反射镜，并将其与光束呈 45 度角对准镜面平面。这将使激光射向形成双侧照明装置的分束器。接下来，让光束依次通过直径为50毫米的中性密度滤光片、扩束器和直径为25毫米的针孔，这些元件彼此相距150毫米。再将光束通过一个位于针孔150毫米处的50-50分束器。接下来，将第二面反射镜放置在距离分束器 150 毫米处，与前向光束成 90 度角，并进行调整，使反射镜平面与光束成 45 度角。然后，将第三面反射镜放置在距离第二面反射镜 100 毫米处，并调整其反射镜平面，使其与从第二面反射镜反射的光束成 45 度角。利用该反射光束形成双照明光片的一侧。在分光镜的远端，放置第五面反射镜，使其镜面与向前发射的光束成45度角。利用第五面反射镜反射出的光束形成双侧照明光片的第二侧。接下来，以系统化的方式搭建双侧照明系统。将第二个柱面透镜放置在双照明装置另一侧的第三反射镜后150毫米处，再将另一个相同的柱面透镜放置在第五反射镜后150毫米处。接下来，在两个柱面透镜的同一直线上分别放置两面反射镜，距离均为50毫米，用于将光束以90度角反射。在光片的两侧，各由一对透镜组成一个消色差双合透镜，其中第一片透镜位于前一面反射镜后100毫米处，直径为1英寸，焦距为100毫米。第二个透镜应放置在距离第一个透镜160毫米的位置，其直径为1英寸，焦距为60毫米。然后，将照明物镜一和照明物镜二放置在距离前一个消色差双合透镜150毫米处，使其与光束对齐。物镜发出的光束形成用于样本成像的光片。首先，通过将0.53微米的微球溶液在预热的折射率匹配溶液中按1:150,000稀释，并加入1%低熔点琼脂糖，制备荧光微球样品。接着，取一段长度为30毫米、内径为12毫米、外径为18毫米的硼硅酸盐玻璃管。将微球琼脂糖溶液用移液器加入硼硅酸盐玻璃管中，并在室温下静置，使琼脂糖完全凝固。现在，用99.5%的甘油溶液填充一个3D打印的ABS腔室。将含有微珠的硼硅酸盐玻璃管放入腔室内。将一个三维电动平移台连接到硼硅酸盐玻璃管上，以控制样品在ABS腔室内的移动和方向。然后，使用定制设计的软件控制sCMOS相机，以每秒30帧的速率采集图像。通过电机控制器，将样品在横向方向上移动一毫米，并在每一毫米增量位置采集图像，直至完成整个样品的成像。使用可视化软件将采集的图像进行堆叠，并利用这些微珠图像测量系统的点扩散函数。使用折射率匹配溶液（pH 为 7.5），并将 1% 琼脂糖溶解于该匹配溶液中。将已透明化的成年小鼠心脏样本放入含有 1% 溶解琼脂糖的折射率匹配溶液中。随后，将样本插入硼硅酸盐玻璃管中，并在室温下使琼脂糖凝固。将三维电动平移台连接到硼硅酸盐玻璃管上，以控制样品在三维打印的ABS腔室内的移动和取向。调整样品位置，使其位于双光源系统产生的高斯光束中心。然后，将sCMOS相机的采集速率设置为每秒30帧。现在，使用电机控制器将样品沿轴向移动一毫米，并在每一毫米的增量处采集图像。持续进行，直至完成整个样品的成像。使用可视化软件将采集到的图像进行堆叠。使用这些图像堆栈生成三维图像。为此，需对先前确定的点扩散函数进行去卷积处理，并将其应用于所获取的图像堆栈。最后，设定像素强度阈值以观察心脏的轮廓，并根据该灰度强度为图像添加伪彩色。出生后第一天，可以观察到瓣膜、心房、心室、梳状肌和小梁等结构。出生后第七天，这些结构更加清晰，心房、心室、心室腔尺寸以及心室壁厚度均明显可见。为了研究心脏内的心肌细胞分化，使用杂合敲入小鼠进行 cre 标记以显示心肌细胞。此处展示了在各个平面方向上的标记细胞。将三个平面合并，生成心脏的三维重建图像。插图中红色圆圈区域显示了经过CLARITY技术处理并插入硼硅酸盐玻璃管中的两个半透明小鼠心脏。除了可用于研究出生后小鼠外，该成像系统还可用于研究成年小鼠心脏。此处展示了7.5个月大时GFP标记的ROMK通道。这些主要存在于心室壁中。掌握该技术后，可在一到两分钟内完成操作。进行此操作时，重要的是要清除试管中样品周围的所有气泡。其他方法，例如图像堆栈的自动分割，可用于回答与心血管损伤和再生相关的其他问题。该技术在建立后，已被研究人员用于研究小鼠出生后及成年发育阶段的心脏结构。

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光片荧光显微术在小鼠心脏研究中的应用

在心脏中，分子事件协调着器官的电活动和收缩功能。本文介绍了一系列局部场荧光显微技术，可用于在完整心脏中记录细胞水平的变量。明确调控心脏功能的机制，对于理解心脏在病理状态下的工作方式至关重要。...

局部场荧光显微技术：在完整心脏中成像细胞信号

本文介绍了一种光片显微镜方法，用于在无菌性暴发性心肌炎小鼠模型中可视化心脏 CD45+ 白细胞浸润，该模型通过向 CD11c.DTR...

通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。...

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

我们介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具 体内...

斑马鱼胚胎中心脏快速动态的光片显微成像

我们报告了一种通过结合组织转化和染色技术的新进展与轴向扫描光片显微镜的开发，实现小鼠全心脏介观重建的方法。...

小鼠全心介观光学成像

本方案展示了在显微镜引导下分离小鼠肺静脉并进行免疫荧光染色的方法。我们制备包含左心房、肺静脉及相应肺组织的样本，并对心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43进行染色。...

小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

该方案利用先进的光片显微镜技术，结合改良的组织透明化方法，用于研究啮齿类动物心脏中复杂的结构，在理解心脏形态发生及重塑过程方面具有重要意义。...

光片成像揭示啮齿类动物心脏结构

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中心脏损伤的三维（3D）重建可实现对相关疾病影响模式的精确量化与共定位。本文提供了一种可自动化的光片引导成像方法，用于同时测量心脏损伤、风险区域以及免疫细胞反应。...

利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW...

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

本文描述了一种从患者心脏几何结构的活体图像中估算心室纤维取向的方法，用于个性化建模。通过对正常和衰竭的犬心进行方法学验证，结果表明，在临床可观察水平上，估算得到的纤维取向与实际获取的纤维取向之间无显著差异。...

基于患者的个性化心脏建模：心室纤维取向的估计

学习光片荧光显微术结合光学透明化技术对小鼠心脏进行快速成像的方法。该技术可观察基因治疗后心脏结构变化，适用于发育心脏病学及神经学等多领域研究。

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

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