Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

该亚硫酸氢盐测序方案和生物信息学管道的总体目标是实现线粒体 DNA 甲基化的准确定量。这种方法可以帮助回答有丝分裂表观遗传学领域的关键问题，例如线粒体 DNA 甲基化会改变人类疾病吗？该技术的主要优点是它允许准确定量线粒体 DNA 甲基化。

研究线粒体 DNA 甲基化的关键步骤是在用亚硫酸氢钠处理之前通过 BamH1 消化线性化线粒体 DNA。BamH1 限制性内切酶位点显示在人类线粒体基因组图谱中。还显示了线粒体基因组的五个区域，这些区域将通过亚硫酸氢盐测序进行研究。

置换环、tRNA 苯丙氨酸和 12S 核糖体、16S 核糖体、NADH 脱氢酶 5、细胞色素 B mRNA 编码基因。在设计用于亚硫酸氢盐测序的引物后，使用文本协议中描述的在线工具，使用 BiSearch 验证引物对线粒体基因组的特异性。引物序列被添加到 BiSearch 函数引物搜索中。

选中亚硫酸氢盐框并选择参考基因组。搜索结果将显示正义链和反义链上产生的潜在 PCR 产物。为了从亚硫酸氢盐转化的线粒体基因组中扩增感兴趣的区域，请使用热启动 Taq 聚合酶进行 PCR。

如果单独使用引物，则以 7.5 个单位/反应混合 100 ng 转化的 DNA、500 微摩尔的正义和反义引物、1 微升 dNTP 混合物和聚合酶，总体积为 50 μL。在以下条件下进行 PCR：在 95 摄氏度下运行 5 分钟，在 94 摄氏度下运行 1 分钟，在 55 摄氏度下运行 1 分钟，在 72 摄氏度下运行 1 分钟，持续 35 个周期，然后在 72 摄氏度下运行 10 分钟。对于多重引物，在以下循环条件下使用 200 ng 转化的 DNA：95 摄氏度下 5 分钟，94 摄氏度下 1 分钟，55 摄氏度下 1.5 分钟，72 摄氏度下 1.5 分钟，共 35 个循环，然后在 72 摄氏度下 10 分钟。

PCR 完成后，使用 100 伏电压的 2% 琼脂糖对 PCR 产物进行凝胶电泳。从琼脂糖凝胶中提取 PCR 产物时，必须尽量减少紫外线照射和 DNA 损伤风险。在紫外线下拍摄凝胶的照片。

然后，非常迅速地用手术刀在 PCR 产物周围做标记并关闭紫外线。接下来，在不暴露在紫外线下的情况下缓慢切割 PCR 产物。将凝胶切片放入微量离心管中，并按照文本方案中的说明使用凝胶纯化纯化 PCR 产物。

使用荧光法定量纯化的 DNA。将样品储存在 20 摄氏度，如果不立即进行亚硫酸氢盐测序文库制备。通过使用高达 100 ng 的 PCR 产物进行末端修复，开始亚硫酸氢盐转化的 PCR 产物的文库构建。

向每管 0.2 mL 中加入 55.5 μL PCR 产物、3 μL 末端制备酶和 6.5 μL 10X 末端修复反应缓冲液。将试管在热循环仪中以 20 摄氏度孵育 30 分钟，然后在 65 摄氏度下孵育 30 分钟。接下来，通过将末端修复的 DNA 与 15 μL Blunt/TA 连接酶混合物、2.5 μL 接头和 1 μL 连接增强子混合来连接测序接头。

将混合物放入热循环仪中，在 20 摄氏度下孵育 15 分钟。暂停热循环仪，向每个试管中加入 3 微升 USER 酶。混合并将试管放回热循环仪中，在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。

使用固相可逆固定或 SPRI 对接头蛋白连接的 DNA 进行大小选择。向接头蛋白连接的 DNA 中加入 13.5 μL 水和 55 μL 重悬的 SPRI 珠子。在室温下孵育 5 分钟。

将试管放在磁力架上。当溶液澄清后，将含有接头蛋白连接的 DNA 的上清液转移到新试管中，并丢弃含有磁珠的试管。向上清液中加入 25 微升重悬的 SPRI 珠子;混合并在室温下孵育 5 分钟。

将试管放在磁力架上，当溶液澄清时，弃去上清液。接头蛋白连接的 DNA 现在已结合到磁珠上。当试管放在磁力架上时，向每个试管中加入 200 微升新鲜制备的 80% 乙醇，并孵育 30 秒以洗涤磁珠。

取出并丢弃上清液。重复此乙醇洗涤步骤，总共洗涤两次。从第二次洗涤中取出乙醇，将试管放在磁力架上，打开盖子，风干珠子 5 分钟。

5 分钟后，从磁力架上取下试管，向磁珠中加入 23 μL DNA 洗脱缓冲液并混合。在室温下孵育 2 分钟。将试管放在磁力架上，直到溶液澄清。

然后，将 2 微升溶液转移到 96 孔 PCR 板中，用于 PCR 前扩增。在小心避开磁珠的同时，将剩余的溶液转移到新的 0.2 mL 试管中进行 PCR 扩增。通过 RT-qPCR 进行 PCR 前扩增，以估计扩增接头蛋白连接的 DNA 所需的循环数。

每个反应使用以下预混液。0.4 μL 指数引物、0.4 μL 通用 PCR 引物、7.2 μL 水和 10 μL RT-qPCR 预混液。然后，混合预混液，并将 18 μL 预混液添加到 96 孔 PCR 板中的 2 μL DNA 中。

将板放入实时荧光定量 PCR 机中，在以下条件下进行扩增：98 摄氏度下 30 秒、98 摄氏度下 10 秒和 65 摄氏度下 75 秒，共 20 个循环，然后在 65 摄氏度下 5 分钟。按照文本方案中的说明，估计每个样品所需的扩增循环数后，扩增接头蛋白连接的 DNA。对于每个样品，混合 21 μL DNA、25 μL PCR 预混液、1 μL 指数引物、1 μL 通用 PCR 引物和 2 μL 水。

在热循环仪中，将每个样品置于以下条件下：计算出的循环次数为 98 摄氏度 30 秒、98 摄氏度下 10 秒和 65 摄氏度下 75 秒，然后在 65 摄氏度下为 5 分钟。如前所述，使用 SPRI 珠子纯化扩增的 DNA，并在 22 μL 洗脱缓冲液中洗脱。使用 Bioanalyzer 控制文库质量。

查找正确的磁带库峰值大小。通过弥散条带分析估计文库产品的平均碱基对大小。在 Advanced Global Settings （高级全局设置） 的 Smear Analysis （涂抹分析） 下，双击 Table （表）。

找到从 100 到 1000 个碱基对的区域，然后单击 OK。在 Region Table 下，将显示定义的区域，并计算库的平均大小。通过荧光法定量文库。将文库储存在 20 摄氏度，直到准备好进行下一代测序和计算分析。

通过亚硫酸氢盐测序，在线粒体基因组的五个不同区域的人类骨骼肌细胞的未消化和消化的总 DNA 中研究了线粒体 DNA 甲基化。一个完整的方块代表胞嘧啶鸟嘌二核苷酸位点。空心方块代表非胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸位点。

对于未消化的线粒体 DNA，所有研究区域的甲基化水平范围为 0-15.1%。然而，当 DNA 在亚硫酸氢盐转化之前被消化时，所有区域的解脱率下降到最高 1%。这说明了在亚硫酸氢盐转化之前消化 BamH1 以避免高估线粒体 DNA 甲基化水平的重要性。

看完这个视频，你应该对如何进行线粒体亚硫酸氢盐测序有了很好的了解，通过遵循我们的生物信息学管道，你可以实现线粒体DNA甲基化的准确定量。