Name: 单分子荧光原位杂交 (smFISH) 在发芽酵母营养生长和减数分裂中的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习单分子荧光原位杂交技术，用于检测和定量发芽酵母营养生长及减数分裂期间的RNA分子。该方法可揭示基因表达的细胞间变异性和亚细胞定位，为研究基因调控提供有力工具。

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我们感谢Anne Dodson和Stephanie Heinrich在优化smFISH实验方案方面的建议，感谢Xavier Darzacq在分析平台使用方面的帮助，以及Haiyan Huang在统计分析方面的建议。本研究得到了March of Dimes基金（5-FY15-99）、Pew慈善信托基金（00027344）、Damon Runyon癌症研究基金会（35-15）和Glenn基金会对EÜ的资助，以及美国国家科学基金会研究生研究基金（DGE-1106400）对JC的资助。

注意：本方案中使用的所有缓冲液和培养基均列于表1中。试剂的供应商信息见材料表。
第1天/第1-2天：
注意：对于营养生长期培养，将细胞培养至 OD600 0.4 到 0.6 之间的优选培养基中。对于减数分裂培养，使用优选方法诱导细胞进入减数分裂（通常是在&#160;OD600 1.85。
1. 样品固定与消化
<ol>
	<li>用 3% 多聚甲醛固定总共约 3.5 OD600 的细胞。
	<ol>
		<li>对于营养期培养物，将 5.52 mL 培养物加入含 480 µL 37% 多聚甲醛的 15 mL 圆锥管中。</li>
		<li>对于减数分裂期培养物，将 1840 µL 培养物加入含 160 µL 37% 多聚甲醛的 2 mL 微量离心管中，轻轻倒置约 5 次以混匀。 
		警告：多聚甲醛具有毒性，操作和废弃时应遵循所在机构的相关规定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将管子置于室温下的滚轴混合仪上孵育 20 分钟。对于减数分裂期样品，在室温固定 20 分钟后，继续在 4 ˚C 下旋转过夜固定。 
	注意：过夜固定可提高减数分裂期样品 smFISH 数据的可重复性和质量。&#160;固定时间应进行优化。</li>
	<li>在样品固定期间，将 200 mM 钒核糖核苷复合物（VRC）在 65 ˚C 下解冻至少 10 分钟。</li>
	<li>在 15 mL 管中配制消化主混合液：对于 1 个样品，将 425 µL Buffer B 与 40 µL 已预热至 65 ˚C 的 200 mM VRC 混合；&#160;对于 5 个样品，将 2125 µL Buffer B 与 200 µL 已预热至 65 ˚C 的 200 mM VRC 混合。加入主混合液前，涡旋约 5 秒以充分重悬 VRC，加入 VRC 后混合液呈浅棕绿色。 
	注意：在消化过程中加入 VRC 可提高 smFISH 结果的一致性，可能通过抑制由酵解酶混合物引入的核酸酶污染（该酶由粗提物纯化而来）。此步骤所需的 VRC 用量应进行优化。</li>
	<li>对于营养期样品，在约 1057 × g 下离心 3 分钟。对于减数分裂期样品（过夜固定后），在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。弃去上清液至多聚甲醛废液容器中。 
	注意：所有离心步骤均在室温下进行。</li>
	<li>通过吹打或倒置并轻弹管壁，用 1.5 mL 冷 Buffer B 重悬细胞。重悬后将营养期样品转移至 2 mL 管中。</li>
	<li>在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。通过真空抽吸或移液去除大部分液体，残留约 100 µL。</li>
	<li>用 1.5 mL 冷 Buffer B 重悬细胞。</li>
	<li>在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。通过真空抽吸或移液去除大部分液体，残留约 100 µL。</li>
	<li>用 1.5 mL 冷 Buffer B 重悬细胞，在 21,000 × g 下离心 1.5 分钟。通过真空或移液完全吸除液体。</li>
	<li>用 425 µL 消化主混合液重悬细胞，并短暂涡旋以混匀。向每管中加入 5 µL 10 mg/mL 的 100T 酵解酶。 
	注意：每次加入前均需涡旋酵解酶。应逐管单独加入酵解酶，而非加入主混合液中。由于酵解酶易快速沉淀，这两个步骤有助于维持各管间消化的一致性。</li>
	<li>涡旋 2–3 秒以混匀。将管子置于滚轴混合仪上，在 30 ˚C 下消化 15–30 分钟。营养期细胞和减数分裂早期通常需约 15 分钟，减数分裂前期和减数分裂过程通常需约 30 分钟。 
	注意：消化 15 分钟后，每隔 5 分钟在显微镜下检查一次，当约 80% 的细胞呈现不透明且无折光性时停止消化。自此步骤起，细胞极为脆弱，操作应轻柔，避免使用真空抽吸或涡旋。</li>
	<li>在约 376 × g 下离心 3 分钟。通过移液完全去除液体。</li>
	<li>用 1 mL Buffer B 轻柔吹打 1–2 次以重悬细胞。</li>
	<li>在约 376 × g 下离心 3 分钟。通过移液去除 Buffer B。用 1 mL 70% 乙醇（用无 RNase 水稀释）轻柔重悬细胞。</li>
	<li>在室温下孵育 3.5–4 小时。</li>
</ol>
2. 杂交
<ol>
	<li>将甲酰胺置于室温下（50 mL 分装样品在水浴中约需 30 分钟）。 
	注意：在甲酰胺瓶达到室温前请勿打开，以避免甲酰胺氧化。 
	警告：甲酰胺具有毒性。请根据机构规定进行操作和处置。</li>
	<li>在 15 mL 圆锥管中配制 10% 甲酰胺洗涤缓冲液。</li>
	<li>以约 376 × g 离心 3 分钟。用移液器移除 500 µL 70% 乙醇。轻轻吹打重悬剩余细胞，然后将细胞转移至低吸附性离心管中。 
	注意：使用低吸附性离心管可显著减少后续洗涤过程中的细胞损失。</li>
	<li>再次以约 376 × g 离心 3 分钟。用移液器吸除全部乙醇。</li>
	<li>加入 1 mL 10% 甲酰胺洗涤缓冲液，轻轻吹打 2–3 次以重悬细胞。</li>
	<li>在配制杂交溶液的同时，将细胞于室温下静置约 20 分钟。对于 1 个样品，混合&#160;50 µL 杂交缓冲液（室温）、5 µL 200 mM VRC（预热至 65 ˚C）以及每种探针各 1 µL（终浓度为 200 nM）。对于 5 个样品，混合 250 µL 杂交缓冲液（室温）、25 µL 200 mM VRC（预热至 65 ˚C）以及每种探针各 5 µL（终浓度为 200 nM）。
	<ol>
		<li>在打开管子前，先将杂交缓冲液（-20 ˚C 冻存）解冻至室温，以防止甲酰胺氧化。</li>
		<li>加入 200 mM VRC 后，涡旋振荡 5–10 秒，再加入探针。探针为商业设计和购买，按制造商说明进行复溶。</li>
		<li>若同时孵育两种探针，则分别加入 1 µL 探针 #1 原液的 1:10 稀释液和 1 µL 探针 #2 原液的 1:10 稀释液，使每种&#160;探针的终稀释度约为 1:500。最佳信噪比所需的探针浓度需进行优化（详见讨论部分）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以约 376 × g 离心样品 3 分钟。用移液器将上清液移至有害废物容器中。</li>
	<li>向每根管中加入至少 50 µL&#160;杂交溶液。轻弹管壁以混匀。</li>
	<li>在黑暗条件下，于 30 ˚C 滚动摇床中孵育至少 16 小时。</li>
</ol>
第2天/第3天
3. 清洗与成像
<ol>
	<li>将甲酰胺置于室温下。</li>
	<li>在15 mL锥形管中配制10%甲酰胺洗涤缓冲液（FWB）。</li>
	<li>从滚轴摇床上取下试管，放入用铝箔包裹的盒子中以避光。&#160;</li>
	<li>将样品在约 376 x g 条件下离心 3 分钟。&#160;用移液器将上清液移至有害废物容器中。</li>
	<li>用移液器轻柔地吹打2-3次，将沉淀重悬于1 mL 10% FWB中。</li>
	<li>30 ˚C 下孵育 30 分钟（不旋转）&#160;覆箔盒</li>
	<li>以约 376 × g 离心样品 3 分钟。用移液器将上清液移除至有害废物容器中，保留约 50 µL。</li>
	<li>同时，在15 mL锥形管中配制DAPI/FWB：对于&#160;1个样品，将1000 µL 10%甲酰胺洗涤缓冲液与1 µL 5 mg/mL DAPI混合；10个样品，则将10 mL 10%甲酰胺洗涤缓冲液与10 µL 5 mg/mL DAPI混合。用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于1 mL DAPI/FWB中&#160;2-3 次</li>
	<li>30 ˚C 下孵育 30 分钟（不旋转）&#160;覆箔盒</li>
	<li>将抗淬灭试剂在冰上解冻。</li>
	<li>将样品在约 376 x g 条件下离心 3 分钟。用移液器彻底移除上清液。如有需要，可再次离心以去除残留的上清液。</li>
	<li>对于不立即成像的样品，将沉淀重悬于50 µL GLOX缓冲液中 无 酶。上下吹打3-4次以混匀。
	<ol>
		<li>将所有未成像的样品置于锡箔包裹的盒子中，于 4 ˚C 保存，直至准备成像。准备成像时，将样品在约 376 x g 离心 2 分钟，然后用移液器完全去除上清液。按如下方法用含酶的 GLOX 缓冲液重悬样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于需立即成像的样品，加入15–20 µL含酶的GLOX缓冲液。&#160;轻轻吹打混匀。 
	注意：所加入的体积可以&#160;变化&#160;根据细胞沉淀的大小而定。建议将沉淀重悬于15 µL含酶的GLOX缓冲液中，并在显微镜下检查细胞密度。若细胞过于密集（细胞成团堆积），可添加额外的含酶GLOX缓冲液；若细胞过于稀疏，可离心样品并去除约5 µL缓冲液。</li>
	<li>将5 µL样品移液至盖玻片（18 mm × 18 mm，1号）上，然后将盖玻片置于载玻片上。</li>
	<li>在盖玻片放置位置的载玻片上方覆盖一张实验室擦拭纸。轻轻按压擦拭纸，使载玻片固定（应观察到液体从盖玻片的四个边缘渗出）。</li>
	<li>将载玻片放入用铝箔覆盖的盒子中，转移至显微镜室。</li>
	<li>使用高倍率（60-100X）和高数值孔径的宽场荧光显微镜进行成像。 
	注意：为了收集smFISH探针发射的尽可能多的光子，不建议使用共聚焦显微镜，因其会显著限制可收集的光量。本实验中，数据采集所用显微镜配备100倍、1.4数值孔径（NA）物镜，滤光片设置如下：CY5（激发波长632/22，发射波长679/34），曝光时间1.3秒，透射率100%；TRITC（激发波长542/27，发射波长597/45），曝光时间1.3秒，透射率100%；DAPI（激发波长390/18，发射波长435/48），曝光时间0.05–0.1秒，透射率32%–50%。同时应采集明场参考图像。为确保所有RNA信号点均被检测到，需从视野焦平面以下完全到底部至以上完全到顶部，以0.1–0.2 µm的步长采集15–25个光学切片。</li>
</ol>
4. 图像分析
<ol>
	<li>根据实验的具体需求，使用已发表的smFISH分析工具（如FISH-quant17&#160;和StarSearch2）或自行编写的程序分析smFISH数据。 
	注意：一个良好的分析流程应允许用户设定阈值，以区分真实的RNA信号点与背景信号，并输出各项统计信息，例如每个信号点的X、Y和Z（可选）坐标及其强度、每个细胞中的信号点数量，以及可能的拟合参数，用于过滤假阳性检测结果。</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li>
<li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+in+numbers%3A+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li>
<li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li>
<li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506(2011).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
<li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li>
<li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li>
<li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li>
<li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li>
<li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORSEN%2C+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements%3A+mRNA-mitochondria+distance%2C+from+single-cell+to+population+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417(2017).</li>
<li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-quant%3A+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li>
<li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007(2015).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li>
<li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案基于其他已发表的单分子荧光原位杂交（smFISH）方案2,3,21,22,23，并针对酵母菌株背景SK1进行了专门优化。优化的参数包括细胞数量、固定时间、离心速度与时间、消化时间、消化缓冲液、探针浓度和杂交缓冲液。其他参数，如杂交温度和时间，未进行优化。在本节中，我们提供一些注意事项，以帮助将该方案适配至任何酵母菌株背景及感兴趣的生长条件。
出芽酵母的细胞壁是获得高质量单分子荧光原位杂交（smFISH）图像的主要障碍之一，因为细胞壁会阻碍探针的渗透。若使用蜗牛酶（zymolyase）对细胞壁的消化不完全，会导致探针杂交效率低下，并引起细胞间信号的高度变异性。然而，过度消化会使&#160;细胞过于脆弱，从而在洗涤步骤中造成大量细胞丢失，或在制片成像过程中发生细胞破裂。因此，优化消化时间至关重要。我们建议通过 pilot 实验，对同一样本设置不同的消化时间进行测试。在我们的实验中，当约80%的细胞失去折光性时终止消化，可获得最佳的smFISH数据。通常情况下，在相同培养条件下，不同遗传突变株的消化时间相似。然而，在不同培养条件或出芽酵母减数分裂的不同阶段之间，所需的消化时间会有所差异。一旦确定了最佳时间，smFISH实验的质量即可稳定重现。需要注意的是，对于细胞壁合成和/或组分存在缺陷的突变株，消化过程可能在15分钟内即已完成。不同批次的蜗牛酶也可能轻微影响消化所需的时间。
最佳探针浓度对于实现高信噪比至关重要。我们自行设计并商业定制合成了smFISH探针。优质的探针（通常为20聚体）其GC含量百分比应处于适宜范围&#160;从35%到45%，探针之间至少间隔2个碱基对，并具有较低的交叉反应性。我们使用生产商提供的基于网页的探针设计工具生成探针列表；若可选探针数量充足，则利用酿酒酵母基因组数据库（Saccharomyces Genome Database）中的BLAST算法，剔除与其他基因组区域重叠超过17个碱基对的探针。对于退火至唯一基因组区域的探针组，我们选择光稳定性更高的荧光染料（CAL Fluor 590） NDC80luti （CF 590），因为在该探针组中，满足上述所有标准的探针数量（20个）低于制造商推荐的最低数量（约25个）。按照制造商说明书重悬探针溶液后，将原液进行1:10稀释，并将稀释后的溶液以5 µL分装保存于-20 ˚C。每份分装仅使用一次。为优化实验条件，应从1:10稀释液开始进行系列稀释，测试何种浓度可获得最佳信噪比。我们建议从原始原液制备1:250、1:500、1:1000和1:2000的稀释系列。在本实验中，对于CF 590和Q 670探针组，1:500的稀释比例均获得了最佳的信噪比。
对于芽殖酵母的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验，最佳固定时间也至关重要。我们发现，与室温下固定20分钟相比，4 ˚C条件下过夜固定显著提高了减数分裂样品smFISH结果的一致性和质量。尽管我们尚未测试过夜固定对营养生长阶段样品的影响，但在该生长条件下，室温固定效果良好。因此，为了针对新的菌株或生长条件优化smFISH实验方案，我们建议从室温下较短的固定时间开始，若遇到信号变异较大的情况，可逐步延长固定时间。
与其他已发表的方案3,22,23相比，本方案在消化过程中使用&#160;RNase抑制剂VRC，并在杂交过程中采用&#160;更高浓度的VRC。在这两个步骤中添加VRC可提高smFISH结果的一致性，原因可能是更有效地保护RNA分子免受核酸酶活性的影响，而这种核酸酶可能来源于溶壁酶混合物（该酶由粗提物纯化而来，可能含有RNase污染物）。因此，我们建议采用本方案中列出的VRC用量，或使用更高浓度的VRC进行优化。
在缓冲液B和甲酰胺洗涤缓冲液的洗涤步骤中，可能会损失大量细胞。为减少细胞损失，可提高离心速度。在本实验中，使用高速（21,000 × g）离心以沉淀样品，显著减少了&#160;细胞丢失。然而，zymolyase 消化后的细胞非常脆弱，因此不建议改变离心速度。我们建议使用 USA Scientific 的低吸附性离心管，这能在甲酰胺洗涤缓冲液的洗涤过程中显著帮助细胞形成沉淀。总体而言，我们的方案能够稳定地获得足够密集的单层细胞，适用于高效成像。通常情况下，7 个视野即可获得 &#62;130 个适用于定量分析的细胞。
最后，确定图像分析所需的最优参数及输出结果非常重要。为了检测单分子FISH信号点，已发表的分析程序通常使用高斯核对原始图像进行滤波，以去除背景信号，并要求用户为每组图像设定信噪比2,17。然而，目前尚无统一的标准用于确定合适的参数，因此有必要对不同设置进行一些经验性测试。为了设定每个步骤所需的参数，需要迭代输入不同的参数组合，并检查每组参数所得结果与在少数代表性细胞中手动计数结果的吻合程度。一旦确定了一组合适的参数，即使在不同生长条件和遗传背景下获得的图像，大多数情况下也可使用该组参数进行分析。
此外，可以测试是否能在定量之前对smFISH图像进行最大强度投影22。该步骤可简化斑点检测算法，并显著缩短成像时间，但可能会损失一些关于单个斑点的潜在有用信息，例如其亚细胞定位。在我们的实验中，NDC80 基因产生的mRNA分子数量足够少，经过该处理后斑点分离良好（这在芽殖酵母的转录本中并不罕见3,7）。当共定位分析至关重要时，分析流程需要确定每个通道中每个smFISH斑点的位置，以评估共定位情况。根据具体研究问题的不同，可能还需要从分析流程中提取其他信息，例如每个斑点的强度，用于进一步分析。优化实验方案和图像分析流程中的关键步骤，对于获得高质量的smFISH数据以研究目标问题至关重要。

基因表达的动态调控驱动生物体的发育过程，以及其对环境胁迫、感染和代谢变化的响应。专注于转录调控的研究依赖于测量RNA丰度的技术。其中一种方法称为单分子荧光原位杂交（single molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH），可用于在单个细胞中检测单个RNA分子1,2。该方法能够&#160;测量基因表达在细胞间的变异性，并确定RNA在细胞内的定位。
在最常用的单分子荧光原位杂交（smFISH）技术中，检测单个RNA分子需要多个短DNA探针（通常约为48个20碱基长的探针），这些探针与目标RNA序列互补&#160;，并共价连接相同的荧光染料。单个荧光探针结合产生的信号较弱，但所有探针信号的集合则非常强。这一特性显著提高了信噪比，因为尽管单个探针可能发生非特异性结合，但其信号强度远低于目标RNA分子的信号3。在检测误差允许范围内，可以对不同生长条件或不同突变体之间的RNA分子数量进行计数和比较。
自首次开发以来，smFISH 已被应用于研究基因表达的多个方面4，例如转录延伸1,2，剪接5,6转录爆发7,8,9细胞内等位基因表达10,11,12，以及RNA定位13,14,15最近，我们已采用该方法研究同一基因的两种转录本异构体的表达，其中短转录本异构体（NDC80开放阅读框）与其长亚型（NDC80luti)16为了特异性识别两种mRNA异构体，我们使用了两组探针：其中一组探针对应于独特序列 NDC80luti，另一组探针则与两种同工型的共有区域结合，并标记另一种荧光染料。&#160;NDC80luti RNA 被识别为具有两种荧光信号的共定位斑点，而 NDC80开放阅读框 RNA 是仅包含共有探针集信号的那一个。由于共有探针集的数量 NDC80开放阅读框 转录本的表达量由以下方法计算： &#34;减法&#34; 为了可靠地识别smFISH信号点并减少误差传播，需要具有高探针杂交效率和高信噪比的方法。
本文介绍了一种在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中进行单分子荧光原位杂交（smFISH）的优化实验方案。该方案针对处于营养生长或减数分裂状态的S. cerevisiae SK1菌株背景，对细胞数量、固定时间、消化时间、消化缓冲液、探针浓度以及杂交缓冲液等smFISH实验条件进行了优化。此外，本文还说明了：（1）图像采集后评估smFISH数据质量的方法；（2）本实验方案中可能需要根据不同菌株背景和生长条件进一步优化的步骤。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白，无RNase（50 mg/mL）</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>短期保存于 4 &amp;deg;C。使用前涡旋混匀。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>用水重悬后于 -20 &amp;deg;C 保存。避光。</td></tr><tr><td>50% 硫酸葡聚糖</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>室温保存。黏度很高，为黏稠液体，操作需耐心。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>用水重悬后分装，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>乙醇（100%，200 proof）</td><td>多种</td><td></td><td>易燃。</td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>室温保存。有毒。使用和处置时需谨慎。</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存。待温度升至室温后再开启，以防氧化。有毒。使用和处置时需谨慎。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>多种</td><td></td><td>溶解于无核酸酶水中后，于 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>用 50 mM NaOAc（pH 5.0）重悬后分装，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>磷酸钾（单碱基和双碱基）</td><td>多种</td><td></td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>探针文库，稀释于 TE 缓冲液（pH 8.0）中&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>按照生产商说明，用 TE 缓冲液（pH 8.0）重悬后分装（5 &amp;micro;L），于 -20 &amp;deg;C 保存。避光。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>多种</td><td></td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>TE 缓冲液，pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>1 M Tris，pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>200 mM 钒酰核糖核苷复合物（VRC）</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>按生产商说明重悬后分装，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>用水重悬后分装，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>低吸附离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>室温保存。</td></tr></tbody></table>

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smfish）分析

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

单分子荧光 原位 杂交（smFISH）是一种研究单细胞基因表达的强有力技术，因其能够检测并计数单个RNA分子。与基于深度测序的方法互补，smFISH可提供有关转录本丰度的细胞间变异以及特定RNA亚细胞定位的信息。近期，我们已利用smFISH研究了基因的表达&#160;NDC80&#160;在酿酒酵母减数分裂过程中，存在两种转录本异构体，其中短转录本异构体的全部序列包含于长转录本异构体之中。为可靠地区分每种转录本异构体，我们优化了已知的单分子荧光原位杂交（smFISH）实验方案，并获得了在酿酒酵母减数分裂样品中高度一致且高质量的smFISH数据。本文描述了该优化后的实验流程、用于判断smFISH数据是否达到高质量的标准，以及实施该方案时的一些实用建议&#160;其他酵母菌株及培养条件

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

单分子荧光原位杂交（smFISH）是一种强大的技术，可用于在单细胞水平研究基因表达，因其能够检测……

本优化的单分子RNA原位杂交（smFISH）技术的总体目标是在芽殖酵母营养生长和减数分裂过程中，对单个细胞中的RNA分子进行检测和定量。该方法能够揭示基因表达在细胞间的异质性以及RNA在亚细胞水平的定位情况，因此是研究基因调控的一种强大技术。除了smFISH所能提供的独特信息外，该技术的主要优势在于，一旦完成优化，其实验结果稳定且高度可重复。本方案将以减数分裂培养物进行演示。将1840微升培养物加入含有160微升37%甲醛的2毫升微量离心管中，使终浓度为3%甲醛，用于固定培养物。颠倒混匀约5次。将离心管置于室温下的旋转滚筒上，孵育20分钟。20分钟后，于4摄氏度旋转条件下继续固定过夜。次日，开始消化前，先在65摄氏度下解冻200毫摩尔的钒酸核糖核苷复合物（VRC）至少10分钟。配制消化主混合液时，首先将2125微升缓冲液B移液至15毫升离心管中。然后将温热的VRC涡旋振荡5秒以充分重悬，并将200微升VRC加入15毫升离心管中。混合液应呈现浅棕绿色。将减数分裂样品在室温下以 21,000 × g 离心 1.5 分钟。小心吸除上清液，将真空吸头置于沉淀的对侧，避免扰动沉淀。用移液器反复吹打，将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。在 21,000 × g 条件下离心 1.5 分钟。用真空抽吸法除去大部分液体，留下约 100 微升。将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。离心样品，弃去上清液，再次将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。在21,000 × g下离心1.5分钟。用移液器完全吸除上清液。将细胞重悬于425 µL消化主混合液中，并短暂涡旋振荡。向离心管中加入 5 µL 溶壁酶，涡旋 2 至 3 秒以混匀。将离心管置于滚轴混合仪上，在 30 °C 条件下消化 15 至 30 分钟。消化 15 分钟后，每隔 5 分钟在显微镜下观察细胞，当约 80% 的细胞呈现不透明且无折射性时，停止消化。将离心管在376 × g下离心3分钟。完全去除上清液。用1毫升缓冲液B轻轻重悬细胞，上下吹打1至2次以混匀。将离心管离心并弃去上清液。在1毫升70%乙醇中轻柔重悬细胞，并在室温下孵育3.5至4小时。开始杂交步骤时，在376 × g下离心细胞悬液3分钟。从离心管中移除 500 微升 70% 乙醇。轻轻吹打重悬剩余细胞，并将细胞转移至低吸附离心管中。将样品转移至低吸附离心管对于防止后续甲酰胺洗涤过程中细胞过度丢失至关重要。将低吸附离心管离心并彻底去除乙醇。向管中加入1毫升10%甲酰胺洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀2至3次以重悬细胞。在按照文本方案准备杂交溶液的同时，将细胞于室温下静置约20分钟。将样品离心，并将上清液移至有害废物容器中。向管中加入至少50微升的每种杂交溶液，轻弹管壁混匀。在30摄氏度下于滚轴混合仪上避光孵育至少16小时。杂交完成后，将细胞管放入用铝箔包裹的盒子中以避光。在376 × g下离心3分钟。用移液器将上清液移至有害废物容器中。用1 mL 10%甲酰胺洗涤缓冲液重悬样品，轻轻吹打混匀2至3次。将细胞管放回用铝箔包裹的盒子中以避光，并在30°C下孵育30分钟。孵育结束后，离心样品。用移液器将上清液移除至有害废物容器中，残留约50微升。用1毫升DAPI溶液重悬样品，轻轻吹打2到3次。再次将细胞管放入锡箔包裹的盒子中，在30摄氏度下孵育30分钟。将样品离心，并用移液枪彻底去除上清液。对于不立即成像的样品，将沉淀重悬于50 µL不含酶的GLOX缓冲液中。上下吹打三至四次以混匀。避光置于4°C的盒子中，直至准备成像。对于需立即成像的样品，加入15至20微升含酶的GLOX缓冲液。用移液器吸取5微升滴加到盖玻片上，然后将盖玻片放置在载玻片上。在盖玻片放置位置的载玻片上方铺一张实验室擦拭纸。轻轻按压擦拭纸，以固定载玻片。将载玻片放入用铝箔包裹的盒子中，转移至显微镜室。本方案用于检测 NDC80 基因的表达，该基因表达两种 mRNA 亚型。长的未翻译转录本亚型相较于短亚型具有 400 个碱基对的 5' 端延伸序列。为此设计了两组探针。CF 590 探针组结合于长亚型独特的 5' 区域，而 Q 670 探针组结合于两种亚型的共有区域。在优化条件下，两种探针组均能清晰识别出明显的单分子FISH信号点。利用这两组探针研究了 NDC80 在营养生长和减数分裂过程中的表达情况。在营养细胞中，可检测到Q 670探针组的强信号，但无法检测到CF 590探针组的信号。相反，在减数分裂前期，两种探针组均检测到强信号，且大多数信号点表现为共定位。Northern印迹分析证实，长亚型特异性地在减数分裂中表达。发现营养细胞每细胞的短亚型转录本中位数为五个，而在减数分裂前期细胞中，每细胞转录本中位数显著下降至四个。在减数分裂前期，每细胞长亚型转录本的中位数为21，且100%的细胞均表达该转录本。一旦掌握，若操作得当，该技术可在72小时内完成。在进行该实验操作时，首先需要优化消化时间以及实现最佳信噪比所需的smFISH探针浓度。此外，务必在消化及过夜杂交过程中加入VRC，以防止核酸酶活性。该技术的发展为研究人员探索动态基因调控和亚细胞水平的RNA定位奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何在酿酒酵母减数分裂过程中进行单分子RNA FISH实验。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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一种快速可视化活体固定酵母细胞的技术

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本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们提供了一种可重复的基本方法，用于裂殖酵母有性生命周期的长期显微观察。通过文中所述的少量调整，该方案可使研究聚焦于生殖过程的不同阶段。...

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单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

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使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。...

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