单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂中的杂交（smFISH）分析

本优化的单分子RNA原位杂交（smFISH）技术的总体目标是在芽殖酵母营养生长和减数分裂过程中，对单个细胞中的RNA分子进行检测和定量。该方法能够揭示基因表达在细胞间的异质性以及亚细胞水平的RNA定位情况，因此是研究基因调控的一种强大技术。除了smFISH所能提供的独特信息外，该技术的主要优势在于，一旦完成优化，其实验结果稳定且高度可重复。

本实验方案将使用减数分裂培养物进行演示。将1840微升培养物加入含有160微升37%甲醛的2毫升微量离心管中，以3%甲醛固定培养物。颠倒混匀约5次。

将离心管置于室温下的旋转滚筒上，孵育20分钟。20分钟后，于4摄氏度旋转条件下继续固定过夜。次日，首先将200毫摩尔的钒酸核糖核苷复合物（VRC）在65摄氏度解冻至少10分钟，以准备进行消化处理。

配制消化主混合液时，首先用移液器将2125微升缓冲液B加入15毫升离心管中。然后将温热的VRC涡旋振荡5秒以充分重悬，并将200微升VRC加入15毫升离心管中。混合液应呈现浅棕绿色。

在室温下以 21,000 × g 离心减数分裂样品 1.5 分钟。小心吸除上清液，将真空管尖置于沉淀物的对侧，避免扰动沉淀。用移液器反复吹打，将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。

在 21,000 × g 条件下离心 1.5 分钟。用真空抽吸法去除大部分液体，留下约 100 微升。将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。离心样品，弃去上清液，再次将细胞重悬于 1.5 毫升预冷的缓冲液 B 中。

在 21,000 × g 条件下离心 1.5 分钟。用移液器完全吸除上清液。将细胞重悬于 425 µL 消化主混合液中，并短暂涡旋振荡。

向离心管中加入5 µL溶壁酶，涡旋混匀2至3秒。将离心管置于滚轴混合仪上，在30 °C条件下消化15至30分钟。消化15分钟后，每隔5分钟在显微镜下观察细胞，当约80%的细胞呈现不透明且无折射性时，停止消化反应。

将离心管在376 × g下离心3分钟。完全去除上清液。用1毫升缓冲液B轻轻重悬细胞，上下吹打1至2次以混匀。

离心试管并弃去上清液。用1毫升70%乙醇轻轻重悬细胞，在室温下孵育3.5至4小时。开始杂交步骤时，在376 × g下离心细胞悬液3分钟。

从离心管中移除 500 微升 70% 乙醇。轻轻吹打重悬剩余细胞，并将细胞转移至低吸附离心管中。将样品转移至低吸附离心管对于防止后续甲酰胺洗涤过程中细胞过度丢失至关重要。

将低吸附离心管离心并彻底去除乙醇。向管中加入1毫升10%甲酰胺洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀2至3次以重悬细胞。在按照文本方案准备杂交溶液的同时，将细胞于室温下静置约20分钟。

将样品离心，并将上清液移至有害废物容器中。向离心管中加入至少50 µL的每种杂交溶液，并轻轻弹击离心管以混匀。在避光条件下，于30 °C滚筒摇床中孵育至少16小时。

杂交完成后，将细胞管放入用铝箔包裹的盒子中以避光。在376 × g下离心样品3分钟。用移液器将上清液移至有害废物容器中。

用1 mL 10%甲酰胺洗涤缓冲液重悬样品，轻轻吹打混匀2至3次。将细胞管放回用铝箔包裹的盒子中，避光，于30°C孵育30分钟。30分钟后，离心样品。

用移液器将上清液移除至有害废物容器中，残留约50微升。用1毫升DAPI溶液重悬样品，轻轻吹打2至3次。再次将细胞管放入锡箔包裹的盒子中，在30摄氏度下孵育30分钟。

将样品离心，并用移液器彻底去除上清液。对于不立即成像的样品，用50 µL不含酶的GLOX缓冲液重悬沉淀。上下吹打三至四次以混匀。

避光置于4°C的盒子中，直至准备成像。对于需立即成像的样品，加入15至20微升含酶的GLOX缓冲液。用移液器吸取5微升滴加到盖玻片上，然后将盖玻片放置在载玻片上。

在盖玻片覆盖的载玻片上方放置一张实验室擦拭纸。轻轻按压擦拭纸，以固定载玻片。将载玻片放入用铝箔包裹的盒子中，转移至显微镜室。

本实验方案用于检测 NDC80 基因的表达，该基因表达两种 mRNA 异构体。长型未翻译转录本异构体相较于短型异构体具有 400 个碱基对的 5' 端延伸序列。为此设计了两组探针。

CF 590 探针组结合长亚型独特的5'端区域，Q 670 探针组结合两种亚型的共有区域。在优化条件下，两种探针组均能清晰识别出明显的单分子FISH信号点。利用这两种探针组研究了NDC80在营养生长和减数分裂过程中的表达情况。

在营养细胞中，可检测到Q 670探针组的强信号，但无法检测到CF 590探针组的信号。相反，在减数分裂前期，两个探针组均检测到强信号，且大多数信号点表现为共定位。Northern印迹分析证实，长亚型特异性地在减数分裂中表达。

营养细胞中每细胞短亚型转录本的中位数为5个，而在减数分裂前期细胞中，每细胞转录本中位数显著下降至4个。在减数分裂前期，每细胞长亚型转录本的中位数为21个，且100%的细胞均表达该转录本。一旦掌握，若操作得当，该技术可在72小时内完成。

在进行该实验操作时，首先需要优化消化时间以及实现最佳信噪比所需的smFISH探针浓度。此外，务必在消化和过夜杂交过程中加入VRC，以防止核酸酶活性。该技术的发展为研究人员探索动态基因调控和亚细胞水平的RNA定位奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何在酿酒酵母减数分裂过程中进行单分子RNA FISH实验。