Name: 原发性细胞衰老的诱导与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习使用阿霉素诱导原代成纤维细胞衰老并检测衰老相关标志物的方法。该方案操作简便、重复性高，无需昂贵设备，可在至少50%细胞群中诱导衰老表型，适用于衰老与癌症生物学研究。

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我们感谢Demaria实验室成员富有成效的讨论，以及Thijmen van Vliet分享关于紫外线诱导衰老的数据和实验方案。

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
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<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
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<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

本文所述方案已针对人原代成纤维细胞（尤其是BJ和WI-38细胞）进行了优化。在本实验室中，复制性衰老、电离辐射和阿霉素处理的方案已成功应用于其他类型的成纤维细胞（HCA2和IMR90）以及其他细胞类型（即新生儿黑素细胞和角质形成细胞，或诱导多能干细胞分化的心肌细胞）。然而，针对其他细胞类型的方案可通过调整某些细节进行优化，例如接种细胞数量、帮助细胞贴壁/脱离塑料培养基质的方法和化学试剂，以及处理剂量以避免毒性。
即使是使用原代成纤维细胞也存在诸多挑战。衰老细胞通常比增殖细胞更难解离，且对胰酶消化或其他任何解离方法往往更为敏感，这意味着解离后的细胞活力略低于增殖细胞。针对不同诱导衰老方法选择合适的对照组十分困难。例如，对于以药物处理诱导衰老的方法（如阿霉素处理），我们建议对照组采用溶剂短时间处理：即在对照样本中使用磷酸盐缓冲液（PBS）处理24小时，随后立即进行收获或后续处理。有人可能会认为，诱导进入衰老状态的细胞在处理后经历了更长的培养时间（如阿霉素处理细胞额外培养6天），因此对照组细胞在去除PBS后也应培养相同的时间。然而，如此长时间的培养将导致细胞进一步分裂，可能达到过度融合状...

1961年，Hayflick和Moorhead报道，培养中的原代成纤维细胞在连续传代后会失去增殖潜能1。该过程是由于每次细胞分裂后端粒逐步缩短所致。当端粒缩短至临界长度时，DNA损伤应答（DDR）系统会识别这一状态，并触发不可逆的增殖停滞——即复制性衰老。目前，复制性衰老是已知可诱导细胞进入永久性细胞周期停滞状态的多种刺激因素之一，使细胞对有丝分裂原和凋亡信号均不敏感2,3。衰老细胞程序通常还表现出其他特征，包括溶酶体活性升高、线粒体功能障碍、核形态改变、染色质重排、内质网应激、DNA损伤以及衰老相关分泌表型（SASP）3,4。衰老细胞在体内具有多种功能，如参与发育过程、伤口愈合及肿瘤抑制2。同时，它们也被证实与衰老过程以及肿瘤进展（具有一定的矛盾性）密切相关5。衰老所引起的负面效应及部分矛盾性作用，通常归因于SASP6。
最近研究表明，从小鼠体内清除衰老细胞可延长其寿命，并消除多种衰老特征7,8,9,10,11,12。基于相同原理，目前已开发出多种药物，旨在清除衰老细胞（即衰老细胞裂解剂，senolytics）或靶向作用于SASP13,14。抗衰老治疗潜力最近引起了该领域越来越多的关注。
细胞衰老相关机制的研究以及针对衰老细胞的药物干预筛选在很大程度上依赖于ex vivo模型，尤其是人原代成纤维细胞。尽管多种衰老诱导因素会激活一些共同的特征，但衰老表型仍表现出高度异质性，其差异取决于细胞类型、刺激因素和时间点等多种因素3,15,16,17。因此，在研究和靶向衰老细胞时，必须充分考虑这种异质性。本实验方案旨在提供一系列通过不同处理方式诱导原代成纤维细胞发生衰老的方法。如后文所述，这些方法可轻松适用于其他细胞类型。
除了复制性衰老外，我们还描述了另外五种诱导衰老的处理方法：电离辐射、紫外线（UV）辐射、阿霉素（doxorubicin）、氧化应激以及表观遗传学改变（即促进组蛋白乙酰化或DNA去甲基化）。电离辐射和紫外线辐射均可直接造成DNA损伤，并在适当剂量下触发细胞衰老18,19。阿霉素主要通过插入DNA双链之间造成DNA损伤，干扰拓扑异构酶II的功能，从而阻断DNA修复机制，诱导细胞衰老20。通常情况下，组蛋白乙酰化和DNA甲基化调控着对衰老至关重要的基因表达。因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（例如，丁酸钠和SAHA）以及DNA去甲基化试剂（例如，5-aza）可在原本正常的细胞中诱导衰老21,22。
最后，将介绍与衰老细胞相关的四种最常见标志物：衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的活性、通过EdU掺入法检测的DNA合成速率、细胞周期调控因子及周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16和p21的过表达，以及SASP成分的过表达与分泌。

<table><tbody><tr><td>DMEM培养基 - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（P/S；10,000 U/ml）</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水（非DEPC处理）</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>T75培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA溶液</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS片剂</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;15 mL 离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>13 mm 圆形盖玻片</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip滤器</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>铯-137源</td><td></td><td></td><td>IBL 637 铯-137&amp;gamma;射线照射仪</td></tr><tr><td>紫外辐射室</td><td></td><td></td><td>Opsytec, Dr. G&amp;ouml;bel BS-02</td></tr><tr><td>盐酸多柔比星&amp;nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-氮杂-2&amp;rsquo;-脱氧胞苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃糖苷）</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>一水柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>亚铁氰化钾&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Chemicals</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛（w/v）</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU（5-乙炔基-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷）</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>磺基-Cyanine3 叠氮化物（Sulfo-Cy3-Azide）</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>五水硫酸铜（Cu(II)SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS碱</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 384孔白色多孔板&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 密封膜&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL探针文库</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>人IL-6 DuoSet ELISA试剂盒</td><td>R&amp;D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>干燥培养箱</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' 实验室封口膜</td><td>Bemis&amp;nbsp;</td><td>#PM992</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

细胞衰老是一种在应对不同损伤刺激时被激活的永久性细胞周期阻滞状态。细胞衰老的激活是多种病理生理过程的标志性特征，包括肿瘤抑制、组织重塑和衰老。细胞衰老的诱导因素 体内 特征仍不明确。然而，可利用多种刺激来诱导细胞衰老 离体其中最常见的诱导衰老的因素包括复制性耗竭、电离与非电离辐射、基因毒性药物、氧化应激以及去甲基化和乙酰化试剂。本文将详细介绍如何利用这些刺激因素诱导成纤维细胞进入衰老状态。该方案可轻松适用于多种类型的原代细胞和细胞系，包括癌细胞。我们还描述了用于验证细胞衰老的不同方法，重点关注溶酶体酶衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的检测、通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入法测定DNA合成速率、细胞周期抑制因子p16和p21的表达水平，以及衰老相关分泌表型（SASP）相关分子的表达与分泌情况。最后，我们提供了示例结果，并讨论了这些方案的进一步应用。

衰老成纤维细胞中SA-β-gal染色的富集
&#914;-半乳糖苷酶（&#946;-半乳糖苷酶) 是一种溶酶体酶，在所有细胞中均有表达，其最适pH值为4.025,26然而，在细胞衰老过程中，溶酶体体积增大，因此衰老细胞会积聚 &#946;-半乳糖苷酶。该酶含量的增加使其在非最适pH 6.0条件下仍可检测到其活性。25,27. 图1A 显示SA-的代表性图像&#946;增殖性与衰老性原代成纤维细胞中的-gal染色。细胞也呈现体积增大及不规则的细胞形态。如前所述，单独观察时难以区分单个细胞，因此使用DAPI共染色有助于细胞的可视化观察与计数<strong class="x...

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。

细胞衰老是一种在应对不同损伤刺激时被激活的永久性细胞周期停滞状态。细胞衰老的激活是……

该方法有助于回答衰老与癌症研究领域中的关键问题，例如如何实施常用技术来诱导细胞衰老，以及如何评估衰老表型。该技术的主要优势在于操作简便、可重复性高、无需任何特殊或昂贵的设备，且能够使至少50%的细胞群体进入衰老状态。本实验操作将由本实验室的研究生Alejandra Hernandez-Segura进行演示。首先，在含有10毫升D10培养基的T75培养瓶中接种7×10⁵个低群体倍增数（Population Doubling，PD）的活性原代成纤维细胞。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳和5%氧气的细胞培养孵箱中过夜培养。将11微升1,000倍浓度的阿霉素储备液加入11毫升D10培养基中稀释，终浓度为250纳摩尔。然后吸去细胞中的培养基，并加入10毫升含阿霉素的D10培养基。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气的细胞培养孵箱中，精确孵育24小时。随后吸去培养基，使用10毫升D10培养基小心洗涤细胞一次。将细胞在10毫升D10培养基中继续孵育六天，每隔约三天定期更换培养基。为了进行β-半乳糖苷酶染色，每个样本接种1 × 10⁴个细胞至至少一个24孔板孔中，每孔含500 µL D10培养基，使细胞分布稀疏。将细胞在37°C、5% CO₂和5% O₂条件下孵育过夜。次日，用 500 µL PBS 洗涤细胞两次。然后每孔加入 500 µL 含 2%甲醛和 0.2%戊二醛的 PBS 溶液，室温孵育 3 至 5 分钟以固定细胞。随后用 500 µL PBS 洗涤细胞两次。接下来，在配制新鲜的染色液后，每孔加入500 µL，并用封口膜密封培养板，以防止蒸发导致结晶形成。将细胞置于37 °C干燥培养箱中避光孵育12至16小时，培养箱内不充二氧化碳。然后用500 µL PBS洗涤细胞两次。在普通光学显微镜下观察细胞以评估结果，阳性细胞将呈现蓝色的核周染色。为便于观察和定量单个细胞，可使用 DAPI 作为复染剂。随后使用荧光显微镜，通过拍摄同一样本的多张图像，统计至少 100 个单细胞，计算阳性细胞占总细胞数的百分比。对于每个样本或条件，将一个盖玻片放入24孔板的每个孔中。每孔加入500微升D10培养基，接种1×10⁴个细胞，使细胞分布稀疏。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳和5%氧气的环境中过夜培养。配制足够量的20 µM EdU溶液和D10培养基，确保每个样品可加入250 µL。移除待处理孔中一半的培养基，并替换为EdU D10溶液。最终EdU浓度为10 µM。将样品置于37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下孵育18至24小时。对照细胞和衰老细胞使用相同的孵育时间。孵育结束后，用500微升PBS洗涤细胞两次。然后加入500 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，孵育细胞10分钟以进行固定。固定完成后，向样品中加入500 µL 100 mmol/L Tris（pH 7.6）溶液，孵育5分钟。接着，向细胞中加入500 µL含0.1% Triton X-100的PBS溶液，透化处理10分钟。然后用 PBS 清洗样品三次。为每张盖玻片准备 50 微升标记混合液，按以下顺序加入组分：44.45 微升 PBS、0.5 微升硫酸铜(II)、0.05 微升磺基-cy3-叠氮化物和 5 微升抗坏血酸钠。用移液器将 50 微升标记混合液滴加到一片石蜡膜上。然后使用镊子和针头将盖玻片抬起，并使其细胞面朝下放置在标记混合液上。确保无气泡产生，且盖玻片整个表面均与标记混合液接触。将样品在避光条件下孵育30分钟。将细胞放回24孔板的孔中，用PBS洗涤三次。然后使用含DAPI的封片剂封片，并过夜干燥。首先，接种七次10的5次方个低群体倍增次数的存活原代成纤维细胞。每种条件下至少拍摄100个细胞的图像。最后，使用以下公式定量计算掺入EdU的细胞百分比。按照文本方案进行基因和蛋白表达研究。图中显示了增殖期与衰老期原代成纤维细胞中 SA-β-半乳糖苷酶染色的代表性图像。衰老细胞在正常细胞体中显得增大。如前所述，可能难以区分单个细胞。因此，使用 DAPI 共染色有助于可视化观察和细胞计数。在本实验中，采用磺化 Cy3-叠氮化物对细胞群体进行铜催化的叠氮-炔烃环加成反应。如果叠氮与炔烃成功发生偶联，细胞将在 Cy3 滤光片下显示荧光，从而区分增殖细胞与非增殖细胞。一旦掌握，该技术若操作得当，可在36小时内完成。在进行此操作时，需注意在培养箱外处理细胞应尽可能迅速，因为氧气浓度的波动可能会影响实验结果。在完成该操作后，还可采用其他方法，如细胞因子阵列或蛋白质印迹（Western blot），以进一步回答其他问题，例如分泌蛋白的水平或特定信号通路的机制研究。该技术问世后，为衰老与癌症领域的研究人员探索衰老细胞在哺乳动物生理与病理条件下的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握在原代细胞中可重复地诱导衰老的方法，以及如何评估细胞的衰老状态。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

原发性细胞衰老的诱导与鉴定

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。...

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。...

诱导与定量细胞衰老的技术

在此，我们提供了一种详细的实验方案，用于在诱导骨骼肌损伤后同时检测衰老细胞和多能干细胞 体内 重编程。该方法适用于评估细胞衰老在组织再生与重编程过程中的作用 体内.

损伤诱导的衰老评估 在体 内 骨骼肌中的重编程

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。...

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

本方案介绍了利用反射光共聚焦显微镜对从人脂肪组织中分离的基质血管组分进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的客观、单细胞水平检测。该方法可与免疫细胞化学染色兼容，包含pH对照以实现定量评估，并且相较于传统的SA-β-gal染色，具有更高的灵敏度和更低的主观性。...

使用反射光检测脂肪基质血管组分中的衰老现象

采用tBHP诱导HNM细胞早衰的标准化方案，以及分析关键衰老标志物（包括生长停滞、SA-β-半乳糖苷酶活性和SASP因子）的标准化检测方法。...

一种使用叔丁基过氧化氢诱导原代人黑素细胞产生应激诱导性早衰的标准化方案

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。...

利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

该方法研究衰老的皮肤成纤维细胞如何影响健康的成纤维细胞。通过UVB照射诱导细胞衰老，然后将条件培养基施加于正常成纤维细胞。该方法有助于评估靶向皮肤老化过程中异常细胞间通讯的生物活性化合物。...

一种新型抗氧化剂组合用于恢复细胞间健康通讯 体外 使用衰老细胞条件培养基的模型

学习使用阿霉素诱导原代成纤维细胞衰老并检测衰老相关标志物的方法。该方案操作简便、重复性高，无需昂贵设备，可在至少50%细胞群中诱导衰老表型，适用于衰老与癌症生物学研究。

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

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