Name: 局部钙离子梯度对大泡囊膜重塑的响应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 探索利用局部钙离子梯度对巨型脂质囊泡进行无接触操控的技术，通过荧光显微镜直接观察膜管状突起的形成过程。该方法为研究细胞膜重塑机制提供了创新途径，可应用于生物膜动力学研究领域。

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1. 小脂质体的制备
<ol>
	<li>配制 SPE/DOPS/ATTO488-DOPE 脂质的氯仿溶液，质量混合比例为 79/20/1。氯仿中脂质的终浓度为 1 mg/mL，总脂质质量为 0.6 mg（通常小于 1 mg）。配制脂质溶液时使用一次性圆底玻璃小瓶（圆底玻璃管，10 × 75 mm），无需预先清洗。
	<ol>
		<li>使用前，用氯仿至少冲洗玻璃注射器（25 µL）5 次。为完成至少 5 次的填充与冲洗，3–4 mL 氯仿已足够。 
		注意：操作氯仿时，必须使用玻璃注射器，并始终在通风橱内进行所有操作，同时佩戴合适的手套和护目用具。禁止使用任何塑料烧瓶、注射器或移液器接触氯仿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用金属箔包裹盛有脂质混合物的玻璃小瓶，以避免光照，然后在旋转蒸发仪中蒸发溶剂 3 小时以彻底去除氯仿，蒸发条件为压力达到 7 kPa 真空、转速 80 rpm。蒸发完成后，玻璃小瓶底部形成一层干燥的脂质膜（图 2A）。 
	注意：若放大数倍制备或使用更多量的脂质，可能需要延长旋转蒸发时间，以确保氯仿完全去除。</li>
	<li>在干燥的脂质膜上方缓慢加入 600 µL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液（pH 7.8，无需稀释）。加入缓冲液后，再轻轻加入 6 µL 甘油，以防止样品在 GUV-MLV 形成过程中完全脱水（最终甘油浓度为 1 wt%）36。用封口膜密封玻璃小瓶，并用金属箔包裹以避光。于 4 °C 冰箱中过夜保存。 
	注意：PBS 缓冲液的配方为：在 250 mL 纯化水中加入 0.151 g Trizma 碱、1.592 g K3PO4、1.021 g KH2PO4、0.062 g MgSO4·7H2O 和 0.0465 g EDTA。溶液储存于 4 °C，使用前恢复至室温。可使用等摩尔浓度的 10 mM HEPES 缓冲液替代 PBS 溶液。HEPES 缓冲液通过将 1 M HEPES 储存液用纯化水稀释制得。</li>
	<li>次日，在室温下将含有溶液的玻璃小瓶置于超声水浴中处理 1 分钟。移除封口膜后进行吹打，直至形成外观均匀的小脂质囊泡溶液（图 2B）。将所得的小脂质囊泡溶液每份 30 µL 分装至独立的 0.5 mL 塑料&#160;管中。将这些储备分装液在 -18 °C 保存，最长不超过 6 个月。 
	注意：若小脂质囊泡溶液外观不均匀，可使用涡旋混合器在最大转速下每次涡旋 1–2 秒，重复 4 次。</li>
</ol>
2. GUV-MLV 复合物的制备
<ol>
	<li>将含有冷冻小脂质囊泡分装液的塑料&#160;管置于室温下解冻。使用旋涡混合器在最大转速下旋涡振荡4次，每次1–2秒。</li>
	<li>取5 µL小脂质囊泡悬浮液滴加到玻璃盖玻片（24 × 60 mm）表面，形成一个小的圆形液滴。使用未经任何预清洁处理的玻璃盖玻片。</li>
	<li>将玻璃盖玻片放入真空干燥器中（&#60;100 kPa 真空）处理20分钟。</li>
	<li>将干燥的脂质膜在室温下静置4分钟，然后缓慢用移液器加入50 µL 10 mM HEPES缓冲液覆盖干燥脂质膜，以进行再水合。静置5分钟，使GUV-MLV复合物初步形成（图2C）。</li>
	<li>将玻璃盖玻片居中放置于显微镜载物台上，然后在其表面加入300 µL HEPES缓冲液，并将液滴中心对准物镜位置（图3B）。</li>
	<li>将50 µL初步形成的GUV-MLV溶液转移至HEPES溶液（300 µL）中。静置25分钟，使稀疏形成的GUV-MLV复合物牢固地黏附在玻璃盖玻片表面（图2D）。 
	注意：有时GUV-MLV复合物未能在玻璃盖玻片上形成，反而观察到脂质斑块或仅存在MLV。这可能是由于在步骤2.4或2.6期间样品意外震荡，或小囊泡悬浮液经历了多次冻融循环所致。此时应重复步骤2.1–2.6，或使用新配制的脂质储备溶液（步骤1.1）以获得GUV-MLV复合物。</li>
</ol>
3. 微量移液器准备与显微注射
<ol>
	<li>将硼硅酸盐玻璃毛细管的管端轻轻放入蜡烛火焰中，使边缘圆滑，以防止在将微移液管安装到微移液管夹持器时发生断裂。</li>
	<li>使用自动激光拉制仪，按照以下程序设置至少拉制3根玻璃毛细管：加热温度 = 400，拉力 = 4，速度 = 50，延迟 = 225，拉力 = ；加热温度 = 400，拉力 = 4，速度 = 60，延迟 = 150，拉力 = 120。程序设置中第一个“拉力”值应留空。使用内径（I.D.）1.00 mm、外径（O.D.）0.78 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管，可制得尖端开口直径约为0.3 µm的微移液管。</li>
	<li>使用微量移液器加载头（microloader）将8 µL含5 mM CaCl2的HEPES缓冲液（10 mM）从后端填充至每根微移液管中。使用0.2–0.5 µm的一次性注射器滤器在使用前过滤CaCl2溶液，以避免堵塞移液管尖端。 
	注意：确保CaCl2完全溶解于HEPES缓冲液中，该缓冲液也用于步骤2.4–2.6。</li>
	<li>将微移液管夹持器连接至显微操作器。将微移液管牢固地安装至微移液管夹持器中。使用供液管连接注射泵与毛细管夹持器。</li>
	<li>启动注射泵。将注射泵参数设置为20 hPa（注射压力），并设置5 hPa的补偿压力，工作模式为自动。在微移液管准备就绪进行显微注射前，暂停注射泵运行。</li>
	<li>将显微镜设置为明场模式，并配置为微分干涉差（DIC）成像。使用63X或100X高数值孔径（NA = 1.3）物镜，以获得最佳的膜边缘分辨率。</li>
	<li>使用粗调显微操作器将微移液管定位在含有GUV-MLV复合物的液滴上方。将微移液管尖端置于物镜视野上方。</li>
	<li>将显微镜聚焦于GUV-MLV复合物的中点，然后重新对焦至GUV上方约50 µm处。使用显微操作器的粗调模式，轻柔地将微移液管移入焦点范围内。</li>
	<li>将显微操作器切换至微调模式。在缓慢向下移动微移液管尖端的同时保持其处于焦点中，逐渐重新对焦至GUV表面。将微移液管尖端定位在距离GUV表面约20 µm的位置。若因意外接触玻璃盖玻片导致微移液管尖端断裂（示例见图5B），应立即更换，以避免钙离子不必要的释放进入样品本体溶液中。</li>
</ol>
4. 使用钙离子源形成和翻译MTP
<ol>
	<li>将显微镜设置为荧光模式。设置二向色镜以488 nm激发，并在505-550 nm范围内检测发射光。</li>
	<li>开启注射泵并开始钙离子注射。使用显微操作器的精细模式，缓慢将微移液管尖端靠近GUV。在从微移液管注入CaCl2溶液的同时，将微移液管尖端定位在距膜表面3 µm的位置，以促使MTP形成（图4）。</li>
	<li>为使MTP沿GUV表面移动，使用精细显微操作器缓慢移动微移液管尖端（速度为0.1–0.3 µm/s），使其绕GUV表面移动（图6）。在持续注入钙离子的同时，保持微移液管尖端与GUV表面之间的距离大致恒定（约3 µm）。 
	注意：当微移液管尖端移动速度较高（超过0.7 µm/s）时，MTP将无法与微移液管同步迁移，而是发生分散和缩短，同时在微移液管尖端的新位置处形成新的MTP（图7）。</li>
	<li>停止显微注射时，关闭注射泵并将微移液管移离GUV表面。</li>
</ol>

<ol><li>Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+cancer%3A+Targeting+Ca2%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).</li>
<li>Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+store%3A+A+view+from+the+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen.</a> Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).</li>
<li>Bygrave, F. L., Benedetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+concentration+of+calcium+ions+in+the+endoplasmic+reticulum%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum?</a> Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).</li>
<li>Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+cytosolic+Ca2%2B+signals%3A+Ca2%2B+reuptake+into+intracellular+stores+is+regulated+by+the+free+Ca2%2B+concentration+in+the+store+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen.</a> The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).</li>
<li>SantoDomingo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+bovine+adrenal+medulla+chromaffin+cell+secretory+granules%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules.</a> European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).</li>
<li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+catecholamine-containing+secretory+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles.</a> Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).</li>
<li>Bulenda, D., Gratzl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+free+Ca2%2B+in+isolated+chromaffin+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles.</a> Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin-cell+stimulation+triggers+fast+millimolar+mitochondrial+Ca2%2B+transients+that+modulate+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).</li>
<li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+Ca2%2B+among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).</li>
<li>Brown, E. M., Hofer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+calcium+sensing+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular calcium sensing and signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).</li>
<li>Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+inhibits+and+calcium+promotes+model+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion.</a> Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).</li>
<li>Boettcher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+view+of+calcium-induced+clustering+of+phosphatidylserine+in+mixed+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers.</a> Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).</li>
<li>Binder, H., Zschörnig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+metal+cations+on+the+phase+behavior+and+hydration+characteristics+of+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).</li>
<li>Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0927775705007351">Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).</li>
<li>Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+properties+of+charged+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).</li>
<li>Melcrova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+nature+of+calcium+cation+interactions+with+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers.</a> Scientific Reports. 6, 38035(2016).</li>
<li>Roux, M., Bloom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2C+Mg2%2B%2C+Li%2B%2C+Na%2B%2C+and+K%2B+distributions+in+the+headgroup+region+of+binary+membranes+of+phosphatidylcholine+and+phosphatidylserine+as+seen+by+deuterium+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR.</a> Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).</li>
<li>Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+of+divalent+cations+in+unstained+symmetric+and+asymmetric+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Act%22%5BJournal%5D)">Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).</li>
<li>Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+dynamics+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).</li>
<li>Vernier, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+formation+and+phosphatidylserine+externalization+in+a+phospholipid+bilayer+at+high+transmembrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Preparation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+Transmembrane+Protein%2C+the+Voltage-gated+Ion+Channel%2C+KvAP%2C+into+Giant+Unilamellar+Vesicles+for+Microscopy+and+Patch+Clamp+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52281(2015).</li>
<li>Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+deformation+under+local+pH+gradient%3A+mimicking+mitochondrial+cristae+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics.</a> Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).</li>
<li>Ali Doosti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Tubulation+in+Lipid+Vesicles+Triggered+by+the+Local+Application+of+Calcium+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions.</a> Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).</li>
<li>Barber, M. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/pdf/30071878.pdf">A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).</li>
<li>Taylor, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accurately+controllable+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An accurately controllable micropipette.</a> Science. 1329, 617-618 (1920).</li>
<li>Jesorka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+phospholipid+vesicle-nanotube+networks+and+transport+of+molecules+therein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein.</a> Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).</li>
<li>Lobovkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tweezer+action+by+self-tightening+knots+in+surfactant+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).</li>
<li>Karlsson, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35051656">Networks of nanotubes and containers.</a> Nature. 409 (6817), 150(2001).</li>
<li>Wegrzyn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protrusion+coarsening+and+nanotubulation+within+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).</li>
<li>Mellander, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+exocytosis+in+an+artificial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Two modes of exocytosis in an artificial cell.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li>
<li>Cans, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Cells%3A+Unique+Insights+into+Exocytosis+Using+Liposomes+and+Lipid+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).</li>
<li>Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+calcium+in+phosphatidylserine+exposure+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis.</a> FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).</li>
<li>Criado, M., Keller, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+fusion+strategy+for+single-channel+recordings+of+membranes+usually+non-accessible+to+patch-clamp+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes.</a> FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).</li>
<li>Duzgunes, N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/bookseries/methods-in-enzymology/vol/464/suppl/C">Methods in Enzymology. Liposomes Part F.</a> Elsevier Science. , (2009).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Orwar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-Clamp+Detection+of+Neurotransmitters+in+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis.</a> Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).</li>
<li>Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulling+Membrane+Nanotubes+from+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56086(2017).</li>
<li>Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+induce+shape+remodeling+of+negatively+charged+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).</li>
<li>Pezeshkian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Shiga+Toxin+Clustering+on+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes.</a> ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).</li>
<li>Angelova, M. I., Tsoneva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+DNA+with+giant+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Interactions of DNA with giant liposomes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).</li>
<li>Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Flexible+Nanotubes+Formed+by+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes.</a> ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).</li>
<li>Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Sizing+of+Lipid+Nanotubes+Using+Membrane+Displacement+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis.</a> Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).</li>
<li>Billerit, C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm05444a#!divAbstract">Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles.</a> Soft Matter. (20), (2011).</li>
<li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li>
<li>Garten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/114/2/328">Whole-GUV patch-clamping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).</li>
<li>Messina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+Quantifying+the+Passive+Transport+of+Molecules+Through+Patch-Clamp+Suspended+Real+and+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256(2014).</li>
</ol>

仿生细胞系统可用于研究膜在离子、蛋白质或纳米颗粒等外部刺激下的行为变化。作为此类模型，GUVs 能够通过改变其形态来响应化学环境的变化，这一过程通常涉及管状结构和内陷的形成24,41,42,43。
本文提供了一种通过在GUV表面局部注射钙离子来重塑GUV表面，从而以非接触方式生成膜管状突起（MTP）的方法。该方案描述了GUV-MLV复合体的制备过程，该复合体可模拟细胞质膜，同时还介绍了如何采用显微注射技术在GUV表面附近建立钙离子梯度以诱导MTP的形成。以往大多数研究钙离子与膜相互作用的实验研究均是将脂质囊泡暴露于整体钙离子浓度环境中14,17。根据实验条件的不同，这种整体暴露可能导致不同的膜响应，且不会形成管状突起25。
GUV-MLV 复合物的形成过程较为直接，仅需使用标准实验室设备，例如旋转蒸发仪、超声水浴和真空干燥器。然而，在囊泡制备过程中仍需注意若干关键步骤。必须确保囊泡的脱水过程完全（即方案中第 2.3 步），在玻璃盖玻片表面形成一层干燥的环状脂质膜，且其中仅含有少量盐晶体。实验过程中，谨慎操作囊泡溶液，使用新鲜的氯仿脂质储备液以及新鲜的 HEPES 缓冲液，对于成功制备 GUV-MLV 复合物至关重要。此外，GUV-MLV 复合物牢固地附着在玻璃盖玻片表面，是进行显微操作和显微注射的关键。为确认 GUV-MLV 复合物是否充分黏附，可使用微移液管（不施加注射流）轻轻推动 GUV 表面。若囊泡牢固黏附，则在直接物理接触下不会在表面滑动。由于实验是在开放的缓冲液滴中进行，且可能持续数小时，因此必须考虑蒸发问题。缓冲液滴的蒸发会改变渗透条件，进而影响并破坏囊泡的稳定性。为恢复渗透平衡，需定期向样品中添加纯水以恢复原始体积，从而使系统重新达到稳态。
在修饰脂质膜组成时，囊泡必须以GUV-MLV复合体的形式制备，因为MLV可在膜重塑过程中将脂质材料转移至GUV。先前的研究表明，用纯脂质替换SPE混合物中的组分，或添加5–30%的胆固醇，也能实现GUV-MLV复合体的形成28,44。所制备的GUV大多数为单层膜结构45。
此外，在测试其他二价阳离子（如镁离子）时，MTPs 的形成在很大程度上依赖于脂质混合物中带负电荷的 DOPS 的存在。若无 DOPS，本实验方案中所述的囊泡内不会形成 MTPs。同时，即使在含有 DOPS 的囊泡中，单价阳离子（如钾离子和钠离子）也不会导致 MTPs 的形成25。
除了在GUV的制备与操作过程中需要注意的关键步骤外，微注射操作中还需考虑多个重要因素。钙离子的成功微注射在很大程度上依赖于功能正常的玻璃微移液管，这些微移液管需在实验当天制备。多种因素可能导致微移液管功能异常，常见原因之一是尖端开口堵塞。在囊泡制备过程中产生的微小脂质颗粒作为副产物分散于溶液中，容易附着在微移液管尖端，从而造成堵塞。清洁尖端的最佳方法是将微移液管从囊泡溶液中提起，再重新放置到GUV表面附近。应避免使用微注射泵的吹出功能，因为它会导致大量钙离子被注入体相溶液中。此外，微移液管内部截留的小气泡也会阻碍正常微注射，此时应更换新的微移液管。通过将实验装置置于减振台上以减少尖端振荡，可显著降低尖端断裂的风险。
此外，在选择观察方案时需格外注意，以在获得最佳时间分辨图像的同时尽量减少光漂白。本实验方案采用了宽场激光诱导荧光显微镜，因其能够在物镜限制的探测深度下实现相对较高的图像采集速率。此外，倒置显微镜的使用可同时实现对脂质囊泡和微管蛋白结构（MTPs）的显微注射与观察。
该方法的主要局限性之一是需要大量手动操作以及具备足够的显微操作技能。由于复合体是通过自发溶胀过程形成的，因此无法控制GUVs和MLVs的尺寸。此外，本方案无法调控所制备GUV-MLV复合体的膜张力，而这种调控可能对于获取有关膜重塑的更多细节是必要的。GUVs与MLVs相连，后者为MTPs的显著生长提供了脂质材料，其生长程度仅靠GUVs自身膜材料无法实现。MLVs还有助于降低GUV-MLV复合体内部任何横向表面张力的不均匀性44，否则将使利用微管吸吮技术控制囊泡张力的尝试变得复杂。基于GUV-MLV的模型确实提供了较低的膜张力，更接近于细胞膜结构中与膜储备库（如膜折叠和内陷）相关的真实张力状态46。与此同时，微管吸吮技术可成功应用于调控单个GUVs的膜张力。例如，Graber et al. 的研究详细描述了在不同张力条件下，钙离子在体相环境中结合膜后诱导单个GUVs形成膜管状内陷的过程40。最后，要比较钙离子在局部和体相暴露下对膜行为的影响，还需进一步优化膜与表面之间的黏附控制，这已超出本方案的范围。
综上所述，该方法能够在局部钙离子刺激下实现无接触的膜重塑及微管状突起（MTP）的形成。该技术未来的应用重点在于从合成囊泡系统向天然生物膜（如细胞膜泡）的转化。该方法可与其他单细胞检测技术相结合，例如膜片钳或微电极安培法，也可与局部加热策略联用31,47,48。测试其他离子或分子的作用十分简便，只需将钙离子替换为目标分子即可。此外，通过跨膜蛋白对膜进行功能化修饰，可构建复杂的合成脂质囊泡，从而加深我们对细胞形态重塑及细胞膜动力学（特别是对局部化学梯度感知相关过程）的生物物理学机制的理解。最后但同样重要的是，脂质膜的无接触刺激还可拓展至聚合物软物质系统，为开发新型无接触操控平台奠定基础。

钙离子在生物过程中的作用，特别是其在信号传导、细胞分裂和膜融合中的参与，是许多机制研究的重点1。细胞内胞质中的钙离子浓度约为100 nM，而在细胞器（如内质网、分泌囊泡和线粒体）中，钙离子浓度可高达数十毫摩尔。这在细胞内膜两侧形成了跨越多个数量级的陡峭钙离子浓度梯度2,3,4,5,6,7,8,9。细胞外钙离子水平约为2 mM，因此钙离子浓度的变化同时发生在细胞外和细胞内水平。此外，最近的研究表明，细胞内钙离子信号事件和神经元活动可在细胞外钙离子浓度局部波动的条件下发生，提示细胞内与细胞外钙离子变化的同步性具有重要意义10。
为了理解钙离子与生物膜之间的相互作用，研究人员已成功采用一种合成方法，即用脂质双层囊泡替代天然细胞膜。将囊泡暴露于钙离子溶液中，会导致脂质头部基团和烃链排列发生变化、膜张力增加、囊泡聚集，以及脂质分相和膜相变11,12,13,14,15,16。针对脂质膜在接触钙离子后的性质变化，已有研究采用X射线、1H-NMR以及光谱学或热力学方法进行了探讨11,16,17,18。在这些研究中，膜的组成通常被调节为接近天然细胞膜，包含磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰丝氨酸（PS）等生理相关脂质。其中，PS在人工囊泡制备中尤为重要，因为它是多种细胞过程的关键组分，包括细胞内膜运输、胞吐作用和细胞凋亡19,20。
合成脂质囊泡的尺寸通常在纳米级至数微米之间。在各类囊泡制备方法中，直径为数微米至数十微米的巨大单层囊泡（GUVs）因其尺寸相对较大，接近单个细胞的尺度，具有特别重要的意义21,22,23。GUVs 提供了足够的表面积，可用于研究局部化学梯度对膜生物物理性质的影响。通过仅对膜表面的一部分施加外部刺激，可以更深入地探究膜的动力学行为。例如，已有研究表明，对 GUVs 表面局部施加化学梯度或 pH 梯度会引发管状突起的形成，而整体暴露条件下则未观察到该现象24,25。膜行为的这些差异表明，有必要进一步发展针对单个囊泡的检测方法，以深入理解细胞膜重塑的机制。
在20世纪初显微注射和显微操作技术的基础上26,27，结合2000年代以来单囊泡操控技术的最新进展23,28，本文介绍了一种通过局部施加钙离子诱导大单层囊泡（GUV）膜发生膜重塑并形成膜管状突起（MTPs）的方法。
我们的方法采用一种囊泡复合体，该复合体由一个与多层囊泡（MLV）相连的巨大单层囊泡（GUV）组成，作为仿生膜模型系统（图&#160;1A）。在暴露于钙离子梯度时，MLV 作为脂质储库，为复合体向 GUV 提供脂质材料。这种连接使复合体能够在 GUV 膜发生诱导重塑和形态转变期间，补偿膜张力的增加，并为膜管状突起（MTP）的生长提供脂质。此外，由于 MLV 的质量大于 GUV，因此有助于实现表面固定化。此前，固定在固体基底上的 GUV-MLV 复合体已被用于构建纳米管-囊泡网络、研究聚合物与膜的相互作用，以及模拟胞吐作用的晚期阶段29,30,31,32,33。
先前的实验方案采用大豆极性脂质提取物（SPE）来制备GUV-MLV复合物28。SPE由多种磷脂组成，包括磷脂酰胆碱（PC，45.7%）、磷脂酰乙醇胺（PE，22.1%）、磷脂酰肌醇（PI，18.4%）、磷脂酸（PA，6.9%）以及其它脂质的混合物（6.9%）。在本方案中，SPE混合物中掺入了20%的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（钠盐）（DOPS），以模拟细胞质膜内小叶的组成。此外，添加1%的ATTO 488标记的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（ATTO488-DOPE）用于染色脂双层，从而可通过荧光显微镜监测膜重塑过程。GUV的脂双层具有对称的脂质组成，并在局部暴露于5 mM氯化钙（CaCl2）的环境中。这种实验条件，特别是在钙离子浓度升高的情况下，也模拟了凋亡细胞外膜小叶中磷脂丝氨酸（PS）分子的暴露状态34。GUV-MLV复合物的形成需采用一种经改进的再水化-脱水方法，该方法最初由Criado和Keller建立35。囊泡制备流程包括首先形成干燥脂质层，随后将其用于在溶液中形成小型囊泡。接着对该溶液进行脱水和再水化处理，以最终形成GUV-MLV复合物。图&#160;2A-D展示了典型GUV-MLV复合物制备的主要步骤。
在囊泡制备完成后，且囊泡复合物已固定于玻璃基底上时，通过敞口玻璃微毛细管采用显微注射技术，将少量钙离子递送至GUV的外层脂质双分子层。钙溶液从毛细管尖端流出，在GUV膜表面形成局部的钙离子浓度梯度，从而引发膜重塑并生成膜管状突起（MTPs）。这些MTPs的生长方向背离钙离子源，并向GUV内部延伸。该MTP形成过程可通过荧光显微镜直接观察，并使用数码相机进行记录。图&#160;3展示了用于诱导膜重塑的实验装置。本实验方案中MTPs的形成（图2E和图4）与在整体溶液环境中进行的钙离子暴露实验结果形成鲜明对比。在整体溶液条件下，GUV会发生破裂，形成可观察到附着于玻璃表面的膜碎片25。
本文详细阐述了GUV-MLV复合物的形成过程，以及进行钙离子显微注射的操作步骤。这些实验方案主要聚焦于钙离子的显微注射；然而，该方法可轻松改造，用于研究膜对其他离子或蛋白质局部暴露所引发的响应。此外，可通过调节囊泡的组成，以分离并明确脂质组分在膜重塑过程中的作用。本方案无需使用任何复杂设备即可制备GUV-MLV复合物，且具有高度的可重复性。

<table><tbody><tr><td>大豆极性脂质提取物</td><td>Avanti&lt;br/&gt; Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>541602C</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（钠盐）DOPS</td><td>Avanti&lt;br/&gt; Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>840035C</td><td>1×25 mg</td></tr><tr><td>ATTO 488-1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）</td><td>ATTO-TEC (德国)</td><td>AD 488-31</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Hamilton&amp;nbsp;注射器，700系列，固定针头，702N，容积25&amp;nbsp;&amp;mu;L，针头规格22s ga（斜面尖端），针头长度51&amp;nbsp;mm（2&amp;nbsp;英寸）</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>20735&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex试管，培养用，一次性，无边，10×75 mm，硼硅酸盐玻璃，250个/包</td><td>Corning Incorporated (康宁, 纽约 14831)</td><td>99445-10</td><td></td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;CHROMASOLV&amp;nbsp;Plus，用于高效液相色谱，&amp;ge;99.9%，含戊烯作为稳定剂</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>650498-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>B&amp;uuml;chi Rotavapor R-144 瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙，纯度≥95%，中等颗粒，5-10 mm</td><td>KEBO lab (瑞典)</td><td>MA00360500</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁，试剂级，符合ACS和ISO标准</td><td>Sharlau Chemie S.A. (西班牙)</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾，SigmaUltra级，纯度≥99.0%</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，SigmaUltra级，纯度≥99.5%</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>甘油，分子生物学级，纯度≥99%</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>T-1503 2050 g</td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>P5629-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸三钾（K3PO4）</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck (美国)</td><td>34549-100 g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>H0887 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES溶液 1&amp;nbsp;M，pH 7.0–7.6，经无菌过滤，BioReagent级，适用于细胞培养</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>Z260282-1PAK</td><td>24×60 mm</td></tr><tr><td>Acrodisc&amp;nbsp;注射器滤器，&amp;nbsp;PVDF膜，直径13&amp;nbsp;mm，孔径0.2&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Sigma Aldrich (密苏里州, 美国)</td><td>631-1339&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Gl&amp;auml;ser #1 玻璃盖玻片</td><td>VWR (美国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于干燥器的隔膜真空泵</td><td>Vacuubrand (德国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Bandelin Sonolex (德国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VX-100 实验室涡旋振荡器</td><td>Labnet International (美国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm 激光线&amp;nbsp;</td><td>Cobolt MLD-488 nm (索尔纳, 瑞典)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;显微镜浸油</td><td>Leica (德国)</td><td>12847995&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微成像系统&amp;nbsp;</td><td>Leica DM IRB (韦茨拉尔, 德国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机（Prosilica Ex 1920, Allied Vision）</td><td>Technologies GmbH (图林根, 德国)</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar 微操纵器</td><td>Scientifica (乌克菲尔德, 英国)</td><td>612-7933</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管，GC100TF-10，&amp;nbsp; 外径1.00 mm × 内径0.78 mm&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus U.K</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量移液器吸头（移液枪头）</td><td>VWR (美国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-2000 CO2激光拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments (诺瓦托, 美国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>飞升级自动注射泵，Eppendorf Femtojet</td><td>Eppendorf (德国)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

响应局部钙离子梯度的巨型囊泡膜重塑

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

在多种基本细胞过程中，例如膜运输和细胞凋亡，细胞膜形态的转变与局部钙离子浓度的变化同时发生。这些过程中的主要分子组分已被鉴定；然而，钙离子梯度与细胞膜内脂质之间具体的相互作用仍知之甚少，这主要归因于生物细胞的复杂性以及观测手段的困难。为弥补这一空白，已成功采用一种合成方法，以揭示钙离子对细胞膜模拟体系的局部效应。构建一个能够模拟细胞内环境的模型面临多重挑战。首先，需要一个具有适当尺寸和膜组成的合适仿生模型，以再现细胞的物理特性。其次，需要一套微操作装置，将少量钙离子递送至膜的特定位置。最后，需要一种观测方案，以检测并记录脂质膜对外部刺激的响应。本文提供了一种详细的仿生方法，用于研究钙离子与膜之间的相互作用：通过显微注射系统形成局部钙离子梯度，并作用于由巨大单层囊泡（GUV）与多层囊泡（MLV）连接构成的脂质囊泡体系。利用荧光显微镜观察离子对膜的影响动力学，并以视频帧率进行记录。在膜受到刺激后，GUV内部形成了远离膜表面的高曲率膜管状突起（MTPs）。该方法以完全非接触且可控的方式诱导了脂质膜的重塑及膜管状突起的生成。此方法为深入探究钙离子与膜相互作用的细节提供了新途径，有助于进一步研究细胞膜重塑的机制。

在本研究中，我们展示了GUV-MLV复合体的构建方法，以及如何利用这些复合体阐明钙离子梯度对细胞膜动力学的影响。为了通过微注射建立离子梯度，同时保持一个固定的、类似细胞大小的模拟体系，实验中需要使用固定在表面的GUV-MLV复合体。GUV膜会响应局部钙离子浓度，形成远离钙离子源的膜管突起（MTPs）。此外，通过移动微移液管尖端在膜表面周围的位置，可以以非接触方式引导这些膜管突起在GUV周围移动。
GUV-MLV 制备过程的示意图如图2所示。尽管在本方案的第2.4步中，GUV-MLV 复合物已经预先形成（图2C），但将囊泡溶液转移至另一滴300 µL缓冲液中（方案第2.6步）可使少量形成的GUV-MLV复合物充分黏附于玻璃基底上。通过这种方式，可获得适合进行显微操作和显微注射的合适复合物（图2D）。有时，GUV内部会包裹一个或多个脂质囊泡，但这并不影响MTP的形成，如图4A所示。这些GUV仍可形成MTP，但如果包裹的囊泡较大，则可能妨碍成像。大多数制备得到的GUV（高达75%）呈半球形，并与MLV相连，如图1A所示。这些囊泡是本方案的主要关注对象，适用于显微注射操作。其余约25%的GUV呈现波动状（图1B），表明其膜张力处于较低水平。这些波动状囊泡也能形成管状突起，但其动力学行为及所形成的MTP形态有所不同，相关内容不在本方案讨论范围内25。所制备囊泡的典型直径范围为：MLV为2至15 µm，GUV为2至40 µm。进行钙离子处理时，GUV的最佳尺寸为5 µm或更大。
微移液管已在单细胞检测方案以及需要操控合成 giant unilamellar vesicles（GUVs）的实验程序中使用了数十年37,38大多数这些应用涉及微移液管与细胞或囊泡表面的直接物理接触。例如膜片钳技术，或从GUV膜上拉出膜栓，以及构建纳米管-囊泡网络。23,28,39最近，微移液管也被用于在GUV周围产生局部的离子和分子梯度，以重建异质性的细胞微环境24,25在本方案中，一支正常工作的微量移液器（图 5A）是通过释放囊泡内部溶液在GUV表面建立钙离子梯度的关键因素。将微移液管准确定位于GUV表面并避免接触脂质膜，对于成功实施显微注射至关重要。微移液管尖端应保持与表面约 3 µm 从GUV表面出发，该距离是模拟细胞膜附近钙离子浓度变化并生成MTP的最优距离。如果微移液管尖端意外断裂（图 5B），需要进行替换。先前测试的CaCl浓度范围2 微移液管内的浓度在2至5 mM之间，可促进MTP的形成25，这对应于细胞外钙离子浓度。在较低的 CaCl2 浓度 即，1 mM，未观察到MTPs。
钙微注射后MTPs的形成始于小的膜内陷，这些内陷在暴露部位逐渐生长为MTPs图 4B）。只要GUV膜持续暴露于钙离子，MTPs就会继续生长。它们会发生波动，并指向远离钙离子源的方向。图 4C, 补充视频 1当钙离子供应终止后，MTPs 会在 GUV 表面分散，难以判断 MTPs 是仍然存在还是最终消失。
MTP 的形成可归因于钙离子局部结合到 GUV 膜外层脂质单层并引发自发曲率（m），该曲率直接导致自发张力的产生 σ = 2κm2（其中 κ 为弯曲刚度），从而诱导膜弯曲并形成向内的 MTP。先前的研究表明，膜的形变可通过钙离子结合至膜后带负电荷脂质的凝聚和/或聚集来解释，从而产生负的自发曲率40。另一种解释是，Ca2+ 与带负电荷双分子层表面的强结合中和了暴露的脂质双分子层单层的表面电荷密度，导致双分子层两侧电荷密度差异，从而产生非零的自发曲率，足以诱导膜弯曲25。
观察到的膜管状结构（MTP）的形成表明脂质膜对钙离子具有敏感性，并提供了一种新颖的非接触式方法来制备膜管状结构。阐明这种膜管化现象的起源，对于理解细胞在执行多种功能及细胞重塑过程中膜形态转变的动力学机制具有重要意义，同时也有助于深入认识细胞膜内脂质的组织方式。
观察到的膜管状突起（MTP）总是在膜上暴露于钙离子的位点处生成。因此，通过选择微移液管尖端的位置，可以确定GUV表面突起生长的区域。接下来，如果在保持与膜之间距离不变的情况下，缓慢（0.1–0.3 µm/s）移动微移液管沿GUV表面移动，则MTP会随着微移液管同步迁移。图6 及相应的补充视频2展示了MTP在GUV表面的此类迁移过程。该过程可能伴随着持续注入钙离子时新MTP的形成25。在较高的迁移速率下（超过0.7 µm/s），MTP无法跟随微移液管尖端移动；相反，在微移液管尖端的新位置处会形成新的突起（图7）。
在GUV表面观察到的钙离子引导MTP无接触移动现象，有助于加深我们对细胞内膜管状结构动力学驱动力的理解。此外，该方法提供了一种利用化学梯度在软物质系统中实现物质传输的新型无接触控制模式。
<img alt="显示囊泡融合过程的GUV与MLV相互作用示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：固定在玻璃盖玻片表面的GUV-MLV复合物的代表性荧光显微图像。 （A）球形GUV的示例。GUV以半球形附着在MLV上。（B）波动状GUV的示例。黑色箭头指示膜的变形区域。图像经过增强和反相处理，以改善荧光标记GUV膜的可视化效果。比例尺为5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="囊泡形成过程；超声处理、再水化；GUV-MLV复合物示意图；微移液管钙离子释放。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：GUV-MLV制备及微注射方案的示意图。 （A）通过旋转蒸发从脂质溶液中去除氯仿后，在玻璃小瓶底部形成一层干燥的脂质膜。（B）将再水化的脂质膜进行超声处理，形成小脂质囊泡。（C）取少量囊泡溶液（5 µL）滴加在玻璃盖玻片表面，并转移至干燥器中脱水20分钟，以形成干燥脂质膜（此步骤未显示）。用50 µL缓冲液再水化该干燥脂质膜，即可生成预先形成的GUV-MLV复合物。（D）将预先形成的复合物转移至较大体积的缓冲液中，可形成稀疏分布并附着于玻璃盖玻片表面的GUV-MLV。（E）将微移液管置于GUV表面附近并释放钙离子，可触发MTPs的形成。图中所示示意图未按比例绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于细胞分析的带有显微操作器和显微注射系统的光学荧光显微镜装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：钙离子显微注射实验装置。 （A）在GUV中生成MTP所需的实验装置组件。（B）显微注射装置的细节。放置在显微镜载物台上的载玻片，其上含有GUV-MLV复合物溶液。微移液管与玻璃盖玻片表面之间的角度为30°（以白色标记）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GUV-MLV 相互作用序列；显微镜实验；膜融合观察；时间推移。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：在 GUV 表面微注射钙离子后 MTPs 的形成。 （A）暴露于钙离子梯度前的 GUV-MLV 复合物。箭头指示被包裹在 GUV 内部的一个脂质囊泡，该囊泡不影响对 MTPs 的观察。（B）在微注射钙离子后形成小型 MTPs（微移液管中 CaCl2 浓度为 5 mM）。（C）持续暴露于钙离子条件下 MTPs 的生长。荧光图像经过增强和反相处理以增强可视化效果。比例尺为 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示流体流动模式的微量移液器图像；通过显微镜实验观察毛细作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：用于钙离子显微注射的玻璃微量移液器。 （A）功能正常的微量移液器示例。（B）尖端断裂的微量移液器示例（损伤区域以黑色箭头指示）。两幅图像均经过增强和反相处理，以实现更佳的可视化效果。比例尺代表 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GUV 和 MLV 融合过程、时间推移显微镜、脂质相互作用、膜动力学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图 6：钙离子引导 MTPs 在 GUV 表面的移动。 （A）在显微注射 5 mM CaCl2 溶液后，MTPs 在 GUV 表面形成。（B-C）微移液管尖端（0.2–0.3 μm/s）沿膜表面移动，会触发 MTPs 向钙离子源方向移动。黑色箭头标示微移液管的移动方向。图像经过增强和反相处理，以提高膜结构的可视性。比例尺为 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="巨单层囊泡（GUVs）中膜融合的延时显微镜序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：微移液管尖端高速平移时的膜接触点（MTPs）。 （A）在向GUV表面微注射5 mM CaCl2溶液后（白线），在GUV表面形成MTPs。（B-C）微移液管在GUV表面周围以高速平移（1 μm/s）时，会在微移液管尖端的新位置（品红线）形成新的MTPs，同时先前形成的MTPs发生弥散（白线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡阴影效应示意图，展示光吸收模式和光激发过程。" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 1"> 
补充视频 1： 在局部暴露于 Ca2+ 梯度时 GUV 中 MTPs 的形成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_1.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="静态平衡，ΣFx=0，示意图显示受力分布，力学物理概念分析。" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 2"> 
补充视频 2： 钙离子引导MTP沿GUV表面迁移。  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_2.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

我们介绍一种利用局部钙离子梯度对囊泡进行非接触式微操作的技术。通过在巨型脂质囊泡附近微注射钙离子溶液，可重塑脂质膜，从而形成膜管状突起。

在多种基本细胞过程中，如膜运输和细胞凋亡，细胞膜形态的转变与局部……同时发生

我们介绍了一种利用局部钙离子梯度操控巨型囊泡的技术。该技术的主要优势在于能够以完全非接触的方式刺激囊泡表面，并直接观察钙离子与脂质膜相互作用时所引发的膜结构重塑。我们的方法为研究钙离子与膜相互作用的细节提供了手段，开辟了在细胞微环境发生变化时探究细胞膜形态重塑机制的新途径。开始此实验步骤时，需在氯仿中配制脂质溶液。脂质在氯仿中的终浓度为每毫升一毫克，终质量为0.6毫克。用金属箔包裹盛有脂质混合物的玻璃小瓶，以避免内容物暴露于环境光线下。将包裹有金属箔的样品瓶放入玻璃烧杯中。为去除氯仿，在旋转蒸发仪中蒸发溶剂3小时，压力降至7千帕真空，转速为80 rpm。蒸发结束后，玻璃瓶底部会形成一层干燥的脂质膜。在干燥的脂质膜上缓慢加入 600 微升磷酸盐缓冲液。加入缓冲液后，轻轻加入 6 微升甘油，以防止在形成与多层囊泡相连的巨大单层囊泡（GUV-MLV）过程中样品完全脱水。使用 Parafilm 密封玻璃小瓶。用金属箔覆盖以避光。将小瓶在 4°C 下过夜保存。次日，在室温下使用超声水浴对装有溶液的玻璃小瓶超声处理一分钟。移除封口膜，用移液器吹打直至形成外观均匀的小脂质体溶液。取30微升上述小脂质体溶液，分装至各个0.5毫升的塑料管中。将装有小脂质体冷冻悬液分装样品的塑料管在室温下解冻。使用涡旋振荡器在最高速度下将试管涡旋四次，每次一到两秒。取五微升小脂质体悬液滴加到玻璃盖玻片表面，形成一个微小的圆形液滴。使用未经任何预清洁处理的玻璃盖玻片。现在，将玻璃盖玻片放入真空干燥器中处理 20 分钟。将干燥的脂质膜在室温下保存 4 分钟。然后，缓慢用移液器将 50 微升 10 毫摩尔 HEPES 缓冲液滴加到干燥的脂质膜表面，以进行水化。等待五分钟以形成GUV-MLV复合物。将玻璃盖玻片置于显微镜载物台中央。然后，用移液器吸取300微升HEPES缓冲液滴加到盖玻片上，并将液滴中心对准物镜下方。将50微升预先形成的GUV-MLV溶液转移至HEPES溶液中。静置25分钟，使稀疏形成的GUV-MLV复合物牢固地黏附在玻璃盖玻片表面。通过将硼硅酸盐玻璃毛细管末端轻轻放入蜡烛火焰中，使其边缘圆滑，以防止在将微移液管安装到微移液管固定器时发生断裂。使用自动激光拉制仪至少拉制三根玻璃毛细管。采用文中提及的硼硅酸盐玻璃毛细管，以制备尖端开口直径约为0.3微米的微电极。为避免堵塞电极尖端，使用前需用孔径为0.2至0.5微米的注射器滤器过滤HEPES缓冲液中的5毫摩尔氯化钙溶液。然后，使用 Microloader 将八微升氯化钙溶液回填至每个微量移液管中。将微量移液管 holder 连接到显微操作器上。将微量移液管牢固地安装到微量移液管 holder 中。然后使用供液管将注射泵与毛细管支架连接。启动注射泵后，将注射泵的设置调整为20百帕的注射压力，同时设定5百帕的补偿压力。将显微镜设置为明场模式。将其配置为微分干涉差模式。使用粗调微操纵器将微移液管定位在含有GUV-MLV复合物的液滴上方。将微量移液器尖端移至物镜上方，使用粗调显微操作器将移液器下移至液滴处。将显微镜设置为荧光模式。在从微量移液器注入氯化钙溶液的同时，将微量移液器尖端定位在距膜表面三微米的距离，以促使MTPs形成。为了沿GUV表面平移MTPS，使用精细显微操作器缓慢移动移液管尖端在GUV表面周围移动。在持续注入钙离子的同时，保持GUV表面与微移液管尖端之间大致相同的距离。要停止显微注射，请关闭注射泵。此处展示的是固定在玻璃盖玻片表面的GUV-MLV复合体的代表性荧光显微图像。在这些图像中，可以观察到在GUV表面局部注入钙离子后产生的膜管状突起。如箭头所示，微移液管尖端在膜表面移动时，会触发膜管状突起朝向钙离子源方向移动。综上所述，我们提出了一种可实现无接触膜重塑的技术，该技术通过局部钙离子刺激，诱导巨型脂质囊泡形成膜管状突起。该方法的未来应用包括从合成脂质囊泡转向天然生物膜，或将此方法应用于聚合物体系，以开发无接触微操作平台。

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科研

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Chemistry

化学

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