人视网膜色素上皮细胞的分化、维持与分析：用于 BEST1 突变的“培养皿中疾病”模型

该方法有助于解答视网膜离子通道相关疾病领域中关于 BEST1 突变的分子机制及 bestrophinopathy 病理学的关键问题。该技术的主要优势在于避免了直接从人体获取视网膜色素上皮（RPE）细胞的困难。该技术的应用前景可拓展至 bestrophinopathy 的治疗，包括 Best 病，因为 RPE 细胞既可用于科学研究，也可用于细胞替代治疗。

当hPSC培养物达到汇合状态时，将培养基更换为六孔板每孔4毫升的分化培养基。培养两周后，在分化培养基中添加100纳克/毫升的人激活素A，每周更换三次添加因子的培养基，持续额外14天。在第29天，转换为不含添加因子的分化培养基，继续培养8至10周，直至出现色素化的RPE细胞簇。

为了分离色素化的视网膜色素上皮（RPE）细胞，首先将单个九英寸的玻璃巴斯德吸管水平置于本生灯火焰上方，位置大约在吸管细部长度的三分之二处。当加热的玻璃变软后，迅速将两端拉开，使吸管新端形成类似显微刮刀的尖端。用70%乙醇喷洒拉制好的吸管，并在细胞培养罩内静置晾干。

当移液管准备就绪后，用 PBS 清洗分化培养板的每个孔，并向每孔加入 1 毫升含 1 单位/微升胶原酶的 0.05% 胰蛋白酶溶液。在 37 摄氏度孵育 20 至 30 分钟后，每孔加入 2 毫升 37 摄氏度的 RPE 培养基以终止消化，并将培养板置于显微镜载物台上。使用拉制的移液管轻轻敲击色素化的 RPE 细胞簇。

一旦细胞从孔底脱落，立即使用20微升移液器将解离的细胞转移至含有RPE培养基的新细胞培养板的各个孔中。当每个12孔板孔中加入约5,000个RPE细胞后，用新鲜RPE培养基补足终体积至2毫升，并将分离的hPSC-RPE细胞继续培养6至8周，直至观察到形成单层、具有色素且呈鹅卵石状的成熟RPE细胞。在进行膜片钳实验前24至72小时，用2毫升PBS洗涤色素化的单层细胞，随后吸除PBS，向12孔板每孔中的细胞加入1毫升含0.05%胰蛋白酶和1单位/微升胶原酶的溶液，在37摄氏度下孵育8分钟。

当细胞开始脱落时，使用1毫升微量移液器轻轻将细胞从孔底冲洗下来，并将细胞悬液收集至一个15毫升锥形管中。向孔中加入1毫升37摄氏度的胰蛋白酶-胶原酶溶液，于37摄氏度继续孵育8分钟，然后将孔底残留的细胞冲洗下来，并将细胞悬液合并至同一支15毫升锥形管中。

将细胞置于37°C干浴中孵育8分钟，然后使用1毫升微量移液器轻柔吹打细胞10至15次。重复孵育和吹打操作两次后，向单细胞悬液中加入5毫升37°C的RPE培养基，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于适当体积的培养基中，以10%至20%融合度接种至预先包被并放置盖玻片的培养板中，随后按照标准方案进行全细胞膜片钳记录。

成功分离后，零代细胞群体中应有超过90%的细胞成熟并呈现出典型的视网膜色素上皮（RPE）细胞形态。利用基于人多能干细胞-RPE的“培养皿中疾病”模型，可针对每种患者特异性的BEST1突变，全面表征其蛋白表达、膜转运及离子通道功能，从而获得阐明RPE病理机制的关键信息。需要注意的是，某些BEST1突变可能影响其蛋白表达，因此还应检测其他已确立的RPE标志物。

人多能干细胞分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞需要三到六个月，具体时间取决于人多能干细胞系和突变类型；若操作得当，分化后的人多能干细胞分离可在两小时内完成。在尝试将细胞用于膜片钳实验进行分装时，务必注意极其轻柔地吹打细胞，以避免细胞过度死亡。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如三维RPE细胞培养）来探究BEST1突变如何影响RPE细胞顶膜和基底膜上的离子转运等更多科学问题。

该技术建立后，为视网膜变性疾病领域的研究人员探索患者来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞的生理表型及病理机制提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，以及如何为全细胞膜片钳实验制备RPE细胞。