Name: 人视网膜色素上皮细胞的分化、维持和分析: 一种BEST1突变的碟形模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学习从人多能干细胞分化视网膜色素上皮细胞的方法，用于研究BEST1突变和bestrophinopathies疾病的分子机制。该技术可解决获取原代人RPE细胞的困难，为视网膜退行性疾病的治疗策略提供重要模型。

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本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为 EY025290、GM127652，以及罗切斯特大学启动资金支持。

1. 人多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化
<ol>
	<li>按照先前所述方法维持和传代hPSCs18。 
	注：所有细胞（包括hPSCs和hPSC-RPEs）在整个生长和分化方案期间均在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>分化前，将汇合的hPSCs分种至预先包被的6孔板中。
	<ol>
		<li>包被板时，将基底膜基质置于冰上解冻约1小时，用4 °C的DMEM培养基以1:50比例稀释液化的基质，每孔加入800 µL包被液，37 °C孵育至少1小时。</li>
		<li>包被完成后，吸除包被液，并立即向每孔中加入1.5–2 mL培养基。</li>
		<li>从原培养板中消化hPSCs时，将细胞在室温下用含0.5 mM EDTA的PBS孵育5分钟，吸除溶液后，用培养基将细胞重悬为小细胞团块。</li>
		<li>以约20%汇合度将细胞接种至新板中。 
		注：基底膜基质应分装为100 µL每份，于-20 °C保存，每份用于包被一个6孔板。包被时间可延长至37 °C下4小时，或室温过夜。重要的是，hPSCs应以3–5个细胞组成的小团块形式进行悬浮和接种，而非单细胞状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞生长至完全汇合时，更换为分化培养基（每孔4 mL）（表1，不含activin-A）。培养14天，每周更换培养基（每孔4 mL）3次。 
	注：hPSC的板上密度约每24小时翻倍一次。分化程序开始后预期会出现明显的细胞死亡。在换液过程中可肉眼观察到孔中存在死亡细胞聚集体和碎片。</li>
	<li>从第15天至第28天，在分化培养基中添加100 ng/mL人activin-A（表1，含人activin-A）。每孔4 mL培养基，每周更换3次。</li>
	<li>从第29天起停止添加activin-A（表1，不含人activin-A）。继续在分化培养基中培养细胞8–10周，直至出现色素化的hPSC-RPE细胞簇（图1A-B）。 
	注：色素化细胞簇在细胞培养板上可肉眼观察为微小的深色斑点（图1A-B，上图）。在20倍显微镜下可观察到具有典型鹅卵石样形态的单个色素化细胞（图1A-B，下图）。</li>
</ol>
2. 分化RPE细胞的分离与培养
<ol>
	<li>移除分化培养基，用 PBS 洗涤一次，每孔加入 1 mL 含 1 U/µL 胶原酶的 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C 培养 20–30 分钟。吸除胰蛋白酶/胶原酶溶液，每孔轻轻加入 2 mL 预热的 RPE 培养基（表 2）。 
	注意：使用倒置显微镜观察 hPSC-RPE 细胞的形态，胰蛋白酶/胶原酶处理前细胞呈多边形，充分消化后变为圆形。</li>
	<li>使用本生灯拉制玻璃巴斯德吸管。
	<ol>
		<li>双手握住一根长（9 英寸）巴斯德吸管的两端，使其保持水平，并将吸管细部长度约 2/3 处置于本生灯火焰上方。</li>
		<li>当玻璃在火焰中变软后，迅速将两端拉开，使吸管新端形成类似微型刮刀的尖端（图 2）。</li>
		<li>重复多次以制备多个 &#34;细胞刮刀&#34;。用 70% 乙醇喷洒拉制好的吸管进行消毒，并在细胞培养超净台中晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下，使用微型 &#34;细胞刮刀&#34;轻轻将色素化的 hPSC-RPE 细胞团从培养板上解离。
	<ol>
		<li>轻轻敲击（切勿刮擦）色素化细胞区域，细胞解离后会漂浮进入培养基中。</li>
		<li>立即使用 20 µL 微量移液器轻轻吸取解离的 hPSC-RPE 细胞，并转移至预先包被的含 RPE 培养基的 6 孔板中24。</li>
		<li>根据需要重复步骤 2.3.1–2.3.2 多次，每孔预包被的 12 孔板中收集约 5&#160;× 103 个细胞（在 20X 显微镜下观察约为 10% 汇合度）。最终培养基体积补至 2&#160;mL。 
		注意：为防止解离的 hPSC-RPE 细胞漂走，解离过程中应避免移动培养板，使细胞虽漂浮于培养基中但仍保持局部浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将新分离的 hPSC-RPE 细胞（P0）在 12 孔板中用 RPE 培养基继续培养 6–8 周，使其形成色素化的单层细胞（图 1C）。</li>
	<li>每周换液 3 次。换液时，每孔保留约 1/3 体积的旧培养基，并加入 2/3 体积新鲜预热的 RPE 培养基。此阶段，12 孔板每孔使用 2 mL RPE 培养基（即每次更换 1.3&#160;mL 培养基）。 
	注意：P0&#160;hPSC-RPE&#160;细胞形成的单层可能出现穹顶状结构，提示细胞正在主动转运液体，并通过紧密连接锚定25。因此，穹顶形成是 RPE 细胞成熟状态的指标。</li>
</ol>
3. 通过免疫印迹验证RPE命运
<ol>
	<li>使用添加了蛋白酶抑制剂混合物的哺乳动物蛋白提取缓冲液制备hPSC-RPE细胞裂解液。将细胞裂解液在冰上孵育30分钟，然后在4 °C下以13,000 × g 离心15分钟，以去除未溶解的细胞碎片。测定裂解液的总蛋白浓度。</li>
	<li>在75 °C下，用Laemmli SDS上样缓冲液变性40 µg总蛋白10分钟。在10% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶中，先以90 V恒定电压电泳15分钟，然后以150 V继续电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
	<li>在预冷的含10%甲醇的Tris-甘氨酸转移缓冲液中，以100 V电压将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，持续1小时。</li>
	<li>用含0.1%非离子型去污剂（TBST）和5%脱脂奶粉的缓冲液在室温下封闭膜1小时。</li>
	<li>将膜与用封闭缓冲液稀释的一抗在4 °C孵育过夜。针对RPE特异性标志蛋白的一抗稀释比例如下：RPE65为1:1,000；CRALBP为1:1,000；BEST1为1:1,000。抗β-actin抗体按1:10,000稀释，用于检测作为上样对照的β-actin。</li>
	<li>用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
	<li>将膜与用封闭缓冲液按1:10,000稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗在室温下孵育1小时。</li>
	<li>用TBST洗涤膜4次，每次10分钟。</li>
	<li>使用红外成像系统检测蛋白（图3）。</li>
</ol>
4. 通过免疫染色检测 BEST1 的亚细胞定位
<ol>
	<li>用 2 mL PBS 清洗 hPSC-RPE 细胞一次，然后在 2 mL 4% 多聚甲醛中室温固定 45 分钟。</li>
	<li>用 2 mL PBS 清洗两次，再将细胞在含 0.1% 非离子型表面活性剂和 2% 驴血清的 2 mL PBS 中孵育 45 分钟，以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>加入 BEST1 抗体（1:200 稀释），室温孵育细胞 2 小时。</li>
	<li>用 2 mL PBS 清洗细胞 3 次，然后加入荧光标记的二抗 IgG（1:1,000 稀释），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 2 mL PBS 清洗 3 次，以去除未结合的二抗。</li>
	<li>通过共聚焦显微镜观察染色后的细胞（图 4）。</li>
</ol>
5. 采用全细胞膜片钳技术记录 hPSC-RPE 中依赖 Ca2+ 的 Cl- 电流
<ol>
	<li>在进行膜片钳实验前 24–72 小时，将 12 孔板中已完全融合的成熟 P0 hPSC-RPE 细胞（呈鹅卵石状且有色素）进行传代。吸除培养基，用 PBS 洗涤一次，然后向孔中加入 1 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 1 U/µL 胶原酶的混合液。 
	注意：使用前将胰蛋白酶/胶原酶预热至 37 °C。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 8 分钟。 
	注意：此步骤后，hPSC-RPE 细胞仍贴壁并相互连接。</li>
	<li>用 1 mL 移液器轻轻冲洗细胞，将消化液中的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。再用 1 mL 预热的胰蛋白酶/胶原酶洗涤孔板，收集残留细胞，并合并至 15 mL 圆锥形离心管中。 
	注意：此时 hPSC-RPE 细胞仍以较大团块形式存在。切勿通过剧烈吹打来打散细胞团块。部分团块可能粘附在 1 mL 吸头内壁上。</li>
	<li>将离心管置于 37 °C 干浴中孵育 8 分钟。</li>
	<li>用 1 mL 移液器对消化液轻柔吹打 10–15 次。 
	注意：细胞团块明显变小但仍可见。避免剧烈吹打。</li>
	<li>重复前两个步骤。 
	注意：吹打后大多数细胞应呈单细胞悬液状态。可能存在少量微小团块，可接受。可选：将离心管在 37 °C 下额外孵育 5 分钟，随后轻柔吹打。细胞在 37 °C 胰蛋白酶/胶原酶中的总处理时间不应超过 30 分钟（8 + 8 + 8 + 5 = 29）。</li>
	<li>向含有消化后细胞的 15 mL 圆锥形离心管中加入 5 mL 预热的 RPE 培养基。在 200 x g 下离心 5 分钟以收集细胞。重悬细胞后接种于预先包被的 35 mm 培养皿中，接种密度为 10–20% 融合度（例如，将 12 孔板中一个 100% 融合的孔接种至五个 35 mm 培养皿，即为 10% 融合度）。 
	注意：全程避免剧烈吹打，否则可能导致明显细胞死亡，表现为离心后上清液中出现大量深色细胞碎片。良好的单细胞分离接种对膜片钳记录至关重要。</li>
	<li>按照先前所述方法进行全细胞膜片钳记录18,26,27,28,29,30,31。从一系列阶跃电压（从 0 mV 钳制电位下 -100 至 +100 mV）获取电流轨迹（图 5）。 
	注意：内液和外液的配方分别见 表 3 和 表 4。</li>
</ol>

<ol><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Boon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+ocular+phenotypes+caused+by+mutations+in+the+BEST1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).</li>
<li>Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+bestrophins+in+ocular+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Functional roles of bestrophins in ocular epithelia.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).</li>
<li>Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+toad+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium.</a> Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DIDS+on+the+chick+retinal+pigment+epithelium.+II.+Mechanism+of+the+light+peak+and+other+responses+originating+at+the+basal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane.</a> J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium%3A+the+light+peak+and+fast+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li>
<li>Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+Biopsy+and+Patient-Specific+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines.</a> Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).</li>
<li>Milenkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin+1+is+indispensable+for+volume+regulation+in+human+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).</li>
<li>Moshfegh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BESTROPHIN1+mutations+cause+defective+chloride+conductance+in+patient+stem+cell-derived+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE.</a> Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+%28best-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).</li>
<li>Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+some+organizational+characteristics+of+the+mouse+central+retina+and+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula.</a> PLoS One. 10 (4), e0125631(2015).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Idelson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Induced+Stem-Cell-Derived+Retinal+Cells+for+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+scalable+process+for+the+differentiation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

采用“在培养皿中模拟疾病”方法时，最关键的步骤是将携带致病突变的人多能干细胞（hPSCs）分化为正确的细胞谱系，对于BEST1基因而言，该谱系即为视网膜色素上皮（RPE）。因此，在每次分化实验后，应通过RPE特异性的形态特征和蛋白标志物，对获得的hPSC-RPE细胞进行严格验证，以确认其成熟状态16,17,18。为尽量减少克隆变异带来的干扰，应尽可能使用来自同一患者的多个hiPSC克隆，或携带相同突变的多个hESC克隆。
hiPSC 和 hESC 细胞系均可使用相同的方案分化为视网膜色素上皮细胞（RPE）。携带或不携带 BEST1 基因突变的 hiPSC 可分别从 BEST1 患者或健康供体的皮肤成纤维细胞重编程获得。携带 BEST1 基因突变的 hESC 可通过对具有野生型（WT）BEST1 的亲本 hESC 细胞系进行基因工程改造而获得。hiPSC-RPE ...

已有文献记载，至少五种视网膜变性疾病由BEST1基因的遗传突变引起1,2,3,4,5,6,7,8，目前已报道的突变数量已超过200种，且仍在持续增加。这些与BEST1相关的疾病也被称为bestrophinopathies，会导致进行性视力下降甚至失明，目前尚无有效的治疗方法。由BEST1基因编码的蛋白质产物即BESTROPHIN1（BEST1），是一种在眼部视网膜色素上皮（RPE）中特异性表达的Ca2+激活的Cl-通道（CaCC）5,6,8,9。重要的是，BEST1相关疾病的临床表型之一是对光刺激的视觉反应减弱，这种现象称为光峰（light peak, LP），可在眼电图中检测到10,11；据信LP是由RPE中的CaCC介导的12,13,14。为了更深入理解BEST1突变的病理机制，并推动潜在疗法的研发，研究在人RPE细胞中内源性表达的突变型BEST1通道至关重要。
然而，直接从活体患者获取视网膜色素上皮（RPE）细胞极不现实。尽管可从人类尸体及胎儿的活检组织中获取原代RPE细胞，但这些来源难以获得，严重限制了科学研究。因此，迫切需要除人眼以外的其他RPE细胞来源。近年来干细胞技术的进步为此提供了答案，功能性RPE细胞现已可由人类多能干细胞分化而来&#160;多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（hiPSCs），后者通过重编程供体的原代皮肤成纤维细胞获得16,17,18重要的是，hPSCs 的自我更新能力和多能性可确保为生成视网膜色素上皮细胞（RPEs）提供可靠的细胞来源，而hiPSCs具有患者特异性，hESCs则具备基因组修饰潜力例如，通过CRISPR技术）为所需疾病提供了一种多功能的“疾病在培养皿中”模型 BEST1 突变。
hPSC-RPE 相较于小鼠 RPE 模型具有多个优势：1）BEST1 基因敲除小鼠并未表现出任何视网膜异常19，提示 BEST1 在小鼠与人类 RPE 中可能存在不同的遗传学需求；2）人类 RPE 细胞中仅有 3% 为双核细胞，而小鼠中则高达 35%20；3）hiPSC-RPE 在视网膜疾病临床治疗中具备自体移植的潜力21。然而，动物模型对于在活体系统中研究 RPE 的生理与病理过程仍然不可或缺，且 hiPSC 的致瘤潜能不容忽视&#160;。
本实验方案介绍了一种有用且相对简单的将人多能干细胞（hPSC）分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方法，可用于科研和临床研究。该方案利用烟酰胺（维生素B3）促进hPSC向神经组织分化，并通过激活素A（activin-A）处理进一步诱导其向RPE细胞分化。已有研究表明，烟酰胺处理可增加色素化细胞的数量（表明向RPE分化的标志），可能通过抑制分化过程中细胞的凋亡活性来实现22。所获得的hPSC-RPE细胞表现出与天然人RPE细胞相同的关键标志物、鹅卵石样形态以及细胞功能22。因此，在科研应用中，这些hPSC-RPE细胞适用于后续的功能分析实验，包括免疫印迹、免疫染色和全细胞膜片钳记录，本文也提供了这些实验的详细操作步骤。在临床方面，干细胞来源的RPE细胞在动物实验和人体临床试验中均显示出治疗黄斑变性的巨大潜力23。

<table><tbody><tr><td>敲除型DMEM培养基 (KO DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>敲除血清替代物 (KO serum replacement)</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 (Nonessential amino acids)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺 (Glutamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (Penicillin-streptomycin)</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺 (Nicotinamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>人激活素A (Human activin-A)</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM（改良型）(MEM (a modification))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (Fetal Bovine Serum)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1添加剂 (N1 supplement)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺-青霉素-链霉素混合液 (Glutamine-penicillin-streptomycin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 (Nonessential amino acids)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸 (Taurine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松 (Hydrocortisone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸 (Triiodo-thyronin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1培养基 (mTeSR-1 medium)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel基质胶 (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 (Collagenase)</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 (Trypsin)</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 (M-PER mammalian protein extraction reagent)</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物 (proteinase inhibitor cocktail)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65抗体 (RPE65 antibody)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP抗体 (CRALBP antibody)</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1抗体 (BEST1 antibody)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>β-肌动蛋白抗体 (Beta Actin antibody)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG (Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG (Goat anti-mouse IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG (Goat anti-Rabbit IgG)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342染料 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10膜片钳放大器 (HEKA EPC10 patch clamp amplifier)</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster软件 (Patchmaster)</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

人视网膜色素上皮细胞的分化、维持与分析：用于 best1 突变的“培养皿中疾病”模型

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

尽管已发现200多种人类BEST1基因的遗传突变，并将其与视网膜变性疾病相关联，但由于缺乏合适的体内模型来在生理条件下研究BEST1及其突变，其致病机制仍不明确。BEST1编码一种离子通道，即BESTROPHIN1（BEST1），其在视网膜色素上皮（RPE）中发挥作用；然而，原代人类RPE细胞极难获取，这为科学研究带来了重大挑战。本方案描述了如何通过诱导人类多能干细胞（hPSCs）分化，生成携带BEST1致病突变的人类RPE细胞。由于hPSC具有自我更新能力，该方法可为研究人员提供稳定来源的hPSC-RPE细胞，用于多种实验分析，如免疫印迹、免疫荧光和膜片钳技术，从而为BEST1相关视网膜疾病提供一个强大的“培养皿中的疾病”模型。值得注意的是，该策略还可用于研究RPE的（病理）生理学以及其他在RPE中天然表达的感兴趣基因。

技术上最具挑战性的步骤是手动分离，其目标是获得高纯度的分化 P0 hPSC-RPE 细胞群体。成功分离后， &gt;P中的90%细胞0 细胞群将生长并成熟，表现出典型的RPE形态特征（图1C）。在P中存在少量非RPE细胞或未成熟RPE细胞0 种群几乎不可避免，但只要色素化且呈鹅卵石状的hPSC-RPE细胞占绝对多数，就不会影响后续实验。
采用人多能干细胞来源的视网膜色素上皮（hPSC-RPE）疾病体外模型方法，针对每位患者的特异性 BEST1 突变可被全面表征 体内 用于其蛋白质表达（免疫印迹， 图3），膜运输（免疫染色， 图4），以及离子通道功能（全细胞膜片钳， <stro...

本文介绍了一种从携带患者来源突变的人多能干细胞分化获得视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方案。这些突变细胞系可用于包括免疫印迹、免疫荧光和膜片钳在内的功能分析。这种“在培养皿中建模疾病”的方法克服了获取天然人源RPE细胞的困难。

人视网膜色素上皮细胞的分化、维持与分析：用于 BEST1 突变的“培养皿中疾病”模型

尽管已发现200多种人类BEST1基因的遗传突变与视网膜变性疾病相关，但其致病机制……

该方法有助于解答视网膜离子通道相关疾病领域中关于 BEST1 突变的分子机制及 bestrophinopathy 病理学的关键问题。该技术的主要优势在于避免了直接从人体获取视网膜色素上皮（RPE）细胞的困难。该技术的应用前景可拓展至 bestrophinopathy 的治疗，包括 Best 病，因为 RPE 细胞既可用于科学研究，也可用于细胞替代治疗。当hPSC培养物达到汇合状态时，将培养基更换为六孔板每孔4毫升的分化培养基。培养两周后，在分化培养基中添加100纳克/毫升的人激活素A，每周更换三次添加因子的培养基，持续额外14天。在第29天，转换为不含添加因子的分化培养基，继续培养8至10周，直至出现色素化的RPE细胞簇。为了分离色素化的视网膜色素上皮（RPE）细胞，首先将单个九英寸的玻璃巴斯德吸管水平置于本生灯火焰上方，位置大约在吸管细部长度的三分之二处。当加热的玻璃变软后，迅速将两端拉开，使吸管新端形成类似显微刮刀的尖端。用70%乙醇喷洒拉制好的吸管，并在细胞培养罩内静置晾干。当移液管准备就绪后，用 PBS 清洗分化培养板的每个孔，并向每孔加入 1 毫升含 1 单位/微升胶原酶的 0.05% 胰蛋白酶溶液。在 37 摄氏度孵育 20 至 30 分钟后，每孔加入 2 毫升 37 摄氏度的 RPE 培养基以终止消化，并将培养板置于显微镜载物台上。使用拉制的移液管轻轻敲击色素化的 RPE 细胞簇。一旦细胞从孔底脱落，立即使用20微升移液器将解离的细胞转移至含有RPE培养基的新细胞培养板的各个孔中。当每个12孔板孔中加入约5,000个RPE细胞后，用新鲜RPE培养基补足终体积至2毫升，并将分离的hPSC-RPE细胞继续培养6至8周，直至观察到形成单层、具有色素且呈鹅卵石状的成熟RPE细胞。在进行膜片钳实验前24至72小时，用2毫升PBS洗涤色素化的单层细胞，随后吸除PBS，向12孔板每孔中的细胞加入1毫升含0.05%胰蛋白酶和1单位/微升胶原酶的溶液，在37摄氏度下孵育8分钟。当细胞开始脱落时，使用1毫升微量移液器轻轻将细胞从孔底冲洗下来，并将细胞悬液收集至一个15毫升锥形管中。向孔中加入1毫升37摄氏度的胰蛋白酶-胶原酶溶液，于37摄氏度继续孵育8分钟，然后将孔底残留的细胞冲洗下来，并将细胞悬液合并至同一支15毫升锥形管中。将细胞置于37°C干浴中孵育8分钟，然后使用1毫升微量移液器轻柔吹打细胞10至15次。重复孵育和吹打操作两次后，向单细胞悬液中加入5毫升37°C的RPE培养基，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于适当体积的培养基中，以10%至20%融合度接种至预先包被并放置盖玻片的培养板中，随后按照标准方案进行全细胞膜片钳记录。成功分离后，零代细胞群体中应有超过90%的细胞成熟并呈现出典型的视网膜色素上皮（RPE）细胞形态。利用基于人多能干细胞-RPE的“培养皿中疾病”模型，可针对每种患者特异性的BEST1突变，全面表征其蛋白表达、膜转运及离子通道功能，从而获得阐明RPE病理机制的关键信息。需要注意的是，某些BEST1突变可能影响其蛋白表达，因此还应检测其他已确立的RPE标志物。人多能干细胞分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞需要三到六个月，具体时间取决于人多能干细胞系和突变类型；若操作得当，分化后的人多能干细胞分离可在两小时内完成。在尝试将细胞用于膜片钳实验进行分装时，务必注意极其轻柔地吹打细胞，以避免细胞过度死亡。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如三维RPE细胞培养）来探究BEST1突变如何影响RPE细胞顶膜和基底膜上的离子转运等更多科学问题。该技术建立后，为视网膜变性疾病领域的研究人员探索患者来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞的生理表型及病理机制提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，以及如何为全细胞膜片钳实验制备RPE细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

人视网膜色素上皮细胞的分化、维持和分析: 一种BEST1突变的碟形模型

我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。...

研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本方案描述了如何从多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮细胞（RPE）。该方法通过联合使用生长因子和小分子化合物，在14天内将干细胞定向分化为未成熟RPE，并在三个月后获得成熟且具有功能的RPE细胞。...

人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

本实验方案的目的是演示在老化和/或病变的人类布鲁赫膜上培养视网膜色素上皮（RPE）细胞。该方法适用于研究RPE细胞在受损的细胞外基质上的行为。...

视网膜色素上皮细胞在一种基质上的培养 离体 老化人眼布鲁赫膜模型

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。...

退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。...

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

小鼠模型可用于研究视网膜色素上皮（RPE）的生物学特性。已有研究表明，小鼠可产生多种RPE病理改变。本文介绍一种表型分析方案，通过光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠RPE的病理变化进行阐明和定量分析。...

评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

本文介绍了在生理氧浓度条件下分析结合mRNA...

生理氧条件下人细胞中帽结合蛋白的分析

学习从人多能干细胞分化视网膜色素上皮细胞的方法，用于研究BEST1突变和bestrophinopathies疾病的分子机制。该技术可解决获取原代人RPE细胞的困难，为视网膜退行性疾病的治疗策略提供重要模型。

人视网膜色素上皮细胞的分化、维持与分析：用于 BEST1 突变的“培养皿中疾病”模型

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