Name: 快速, 可伸缩的组装和负载的生物活性蛋白和免疫增强剂到不同的合成 Nanocarriers 通过闪光 Nanoprecipitation (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学习使用快速纳米沉淀技术制备纳米载体药物递送系统。该方法可在无菌条件下高效负载生物活性分子，帮助缺乏化学或工程背景的研究人员独立构建先进的治疗递送平台。

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我们感谢西北大学结构生物学设施的工作人员和仪器支持。感谢西北大学罗伯特·H·卢里综合癌症中心和西北大学结构生物学设施提供的支持。Gatan K2 直接电子探测器的购置资金来自芝加哥生物医学联盟，并得到芝加哥社区信托基金的Searle基金支持。我们还感谢西北大学以下设施：凯克跨学科表面科学设施、结构生物学设施、生物成像设施、先进分子成像中心以及分析生物纳米技术设备核心。本研究得到了美国国家科学基金会资助项目（编号1453576）、美国国立卫生研究院院长新创新者奖（1DP2HL132390-01）、再生纳米医学中心催化剂奖以及2014年麦考密克催化剂奖的支持。SDA 部分得到了美国国立卫生研究院博士前生物技术培训基金 T32GM008449 的支持。

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<li>Karabin, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+micellar+delivery+via+inducible+transitions+in+nanostructure+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology.</a> Nature Communications. 9 (1), 624(2018).</li>
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<li>Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+block+copolymer+stabilized+nanoparticles%3A+simultaneous+encapsulation+of+organic+actives+and+inorganic+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures.</a> Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们提供了利用PEG快速制备聚合物囊泡的详细操作步骤17-bl聚苯乙烯磺酸盐35-SH 作为二嵌段共聚物。在此亲水性 PEG 与疏水性 PPS 嵌段分子量比例下，主要形成的聚集体形态为囊泡状的聚合物囊泡（polymersomes）。经多次冲击后，其直径和多分散性与通过 200 nm 膜挤出后形成的聚合物囊泡相当。 通过 薄膜水化法。因此，该方案在制备单分散聚合物囊泡纳米载体时无需额外的挤出步骤。所形成的聚合物囊泡 通过 FNP 可同时负载亲水性和疏水性货物，并在制剂过程中保持这些分子的生物活性11. 必要时可采用额外的无菌操作方案，以确保无内毒素的多泡体（polymersome）制剂的制备，从而适用于生物化学与免疫学检测，并确保可安全用于给药 体内手动操作的CIJ混合器结构简单，易于用户使用，但由于操作者之间的差异性，可能引入质量控制问题。为了保持流体流动的一致性，我们致力于开发一种能够达到并可重复维持相近流速的仪器。重要的是，在上述指定的通道尺寸下，商用注射泵由于配备低速步...

纳米载体可实现对小分子和大分子货物的可控递送，包括一些活性物质——若不进行包封，这些物质会极易降解和/或疏水性过强而无法在体内给药。in vivo。在常规制备的纳米载体形态中，与脂质体类似的聚合物囊泡（也称为聚合物囊泡，polymersomes）能够同时负载亲水性和疏水性货物1,2。尽管具有诸多潜在优势，聚合物囊泡在临床应用中仍较为罕见，部分原因在于其制备过程中存在若干关键挑战。用于临床的聚合物囊泡制剂需要能够大规模、无菌且批次稳定地生产。
有多种技术可用于由两亲性嵌段共聚物（如聚乙二醇-嵌段-聚丙硫醚，PEG-bl-PPS）制备聚合物囊泡（polymersomes），包括溶剂分散法3、薄膜再水化法1,4、微流控技术5,6以及直接水化法7。溶剂分散法需要在有机溶剂中长时间孵育，可能导致某些生物活性载药分子（如蛋白质）变性。薄膜再水化法无法控制所形成聚合物囊泡的多分散性，通常需要昂贵且耗时的挤出工艺以获得理想的单一分散性。此外，微流控法和直接水化法在放大至大规模生产时均存在困难。在各类纳米载体制造方法中，快速纳米沉淀法（FNP）具备实现大规模、可重复制备配方的能力8,9,10。尽管FNP此前主要用于实心核纳米颗粒的制备，但本实验室近期已将其应用拓展至稳定生成多种PEG-bl-PPS纳米结构形貌11,12，包括聚合物囊泡11和双连续型纳米球12。我们发现，FNP能够在无需挤出步骤的情况下形成单一分散性的聚合物囊泡制剂，其多分散性指数显著优于通过薄膜再水化法和溶剂分散法制备的非挤出型聚合物囊泡11。而具有较大疏水区域的双连续型纳米球，尽管可在多种FNP溶剂条件下成功形成，却无法通过薄膜再水化法制备12。
此处，我们提供了PEG合成的详细描述bl-用于多泡囊形成的PPS嵌段共聚物，用于FNP的受限撞击射流（CIJ）混合器，FNP操作流程本身，以及实现自动化系统以减少操作者间差异的方法。内容还包括如何对系统进行充分灭菌以制备无内毒素制剂的信息 体内，以及关于FNP形成的聚合物囊泡表征的代表性数据。通过这些信息，对利用聚合物囊泡进行研究感兴趣的读者可 体外 和 在体内 具备相关经验的科研人员将能够利用该方法制备出无菌且单分散的制剂。熟悉纳米载体配方及聚合物合成的研究者可快速采用快速纳米沉淀法（FNP）测试其自研的聚合物体系，作为现有制剂技术的潜在替代方案。此外，本文所述实验方案亦可作为纳米技术实验课程中纳米载体配方教学的教育工具。

<table><tbody><tr><td>CanaKit Raspberry Pi 3 终极入门套件 - 32 GB 版本</td><td>CanaKit</td><td>UPC 682710991511</td><td></td></tr><tr><td>线性轴承平台（小型）- 8 mm 直径</td><td>Adafruit</td><td>1179</td><td></td></tr><tr><td>线性运动轴，8 mm 直径，330 mm 长度，镀铬，表面硬化，公制</td><td>VXB</td><td>kit11868</td><td></td></tr><tr><td>线性导轨轴支撑/导引件 - 8 mm 直径</td><td>Adafruit</td><td>1182</td><td></td></tr><tr><td>手动定位精密滑台，4.5&quot; 行程，15 lb 负载能力</td><td>McMaster-Carr</td><td>5236A16</td><td></td></tr><tr><td>MTPM-P10-1JK43 Iron Horse 直流电机</td><td>Iron Horse</td><td>MTPM-P10-1JK43</td><td></td></tr><tr><td>官方 Raspberry Pi 基金会 7&quot; 触摸屏 LCD 显示器</td><td>Raspberry Pi</td><td>B0153R2A9I (ASIN)</td><td></td></tr><tr><td>PicoBorg Reverse - 用于 Raspberry Pi 的高级电机控制器</td><td>PiBorg</td><td>BURN-0011</td><td></td></tr><tr><td>Pololu 载板，含 Sharp GP2Y0D810Z0F 数字距离传感器，10 cm</td><td>Pololu</td><td>1134</td><td></td></tr><tr><td>Ruland PSR16-5-4-A 内六角螺钉梁式联轴器，抛光铝材质，英制，A 孔径 5/16&quot;，B 孔径 1/4&quot;，外径 1&quot;，长度 1-1/4&quot;，额定扭矩 44 lb-in</td><td>Ruland</td><td>PSR16-5-4-A</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇单甲醚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202495</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酰氯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471259</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>无水甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545（硅藻土）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺，无水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>791776</td><td></td></tr><tr><td>硫代乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360589</td><td></td></tr><tr><td>氧化铝，中性，活化，Brockmann I 级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>199974</td><td></td></tr><tr><td>甲醇钠溶液，0.5 M 甲醇溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>403067</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙硫烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P53209</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液，1.0 N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素水</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>纸质 pH 试纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-508</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素 Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-012</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃闪烁小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 全塑料注射器</td><td>Thermo Scientific</td><td>S75101</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-6B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL6B200</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱柱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4169</td><td></td></tr><tr><td>CIJ 混合器，HDPE 材质</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Blue hTLR4</td><td>InvivoGen</td><td>hkb-htlr4</td><td></td></tr><tr><td>RAW-Blue 细胞</td><td>InvivoGen</td><td>raw-sp</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>PYROGENT 凝胶法 LAL 检测试剂盒</td><td>Lonza</td><td>N183-125</td><td></td></tr></tbody></table>

通过闪速纳米沉淀法快速、可放大的生物活性蛋白和免疫刺激剂组装与装载至多种合成纳米载体

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

纳米材料为治疗和成像应用中单个或联合分子载荷的可控递送提供了多种定制选择。这种增强的特异性可能具有重要的临床意义，包括减少副作用、降低剂量并提高药效。此外， 原位 靶向并精确调控特定细胞亚群可增强 体外 和 体内 对基本生物现象的研究以及对细胞功能的探究。然而，由于纳米科学、化学和工程学领域所需的专业知识较为复杂，缺乏相关经验的实验室往往难以自行制备和定制纳米材料，从而限制了其将纳米材料作为研究工具或治疗策略载体的应用。本文提供了合成一种多功能、无毒嵌段共聚物体系并实现其可扩展组装的实验方案，该体系易于形成并负载纳米级载体，适用于生物医学应用。闪速纳米沉淀法（Flash nanoprecipitation）被介绍为一种快速制备多种纳米载体的方法，所用材料为聚乙二醇-bl-聚（丙烯硫醚）共聚物。这些方案将使具备不同专业水平和资源条件的实验室能够简便、可重复地制备适用于其研究应用的先进纳米载体递送系统。本文描述了一种自动化仪器的设计与构建，该仪器采用高速注射泵以促进闪速纳米沉淀过程，并实现对聚合物囊泡纳米载体的均一性、尺寸、形貌及载药性能的更精确控制。

在此，我们介绍了一种简单的纳米载体配制方案，该载体可同时负载亲水性和疏水性货物，且具有良好的生物安全性 体内 小鼠与非人灵长类动物给药11,13我们还提供了用于代表性结果的聚合物合成的详细方案，以及用于CIJ混合器中机械控制溶液撞击的定制仪器的制作方法描述。 图1 概述了用于制备聚乙二醇（PEG）的合成步骤17-bl-PPS35-SH，用于自组装聚合物囊泡纳米载体的二嵌段共聚物。PEG-b-PPS 聚合物囊泡负载治疗剂和/或成像剂的 FNP 制备流程示意图如下所示 图2聚合物在CIJ混合器中发生撞击（示意图如所示） 图3a，最初描述于 10）以形成单一分...

纳米材料为生命科学基础研究和转化应用中的可控治疗递送提供了多种机制，但其制备通常需要大多数生物医学实验室所不具备的专业技术。本文介绍了利用闪速纳米沉淀法规模化制备多种自组装纳米载体并实现治疗药物负载的实验方案。

纳米材料为单种及多种分子载荷的可控递送提供了广泛的选择，可用于治疗和成像……

我们认为，利用闪速纳米沉淀法组装复杂纳米结构，将使那些在化学、工程学或纳米材料科学领域经验有限的研究人员能够独立制备适用于自身特定应用和需求的先进药物递送系统。该技术的主要优势在于可在无菌条件下大量生成种类多样的纳米结构，具有高浓度、低多分散性，并可负载包括小分子药物和蛋白质在内的多种生物活性分子。通常，初涉聚合物合成的研究人员可能会遇到困难，因为聚丙硫醚组分对空气暴露引起的氧化反应极为敏感。该方法的可视化演示至关重要，因为多步撞击操作难以掌握，需要连续快速地完成。为对封闭撞击射流装置（即CIJ混合器）进行灭菌，请在生物安全柜内将拆解后的各部件完全浸入0.1 M氢氧化钠溶液中过夜。随后重新组装CIJ混合器，使用鲁尔锁紧式注射器将无内毒素水通过混合器，并检测水流的pH值，持续通水直至pH值显示为中性。配制撞击溶液一：首先，将20毫克合成的聚合物称量至1.5毫升离心管中。然后加入疏水性染料、药物或其他货物。最后，向聚合物和货物中加入500微升100%四氢呋喃，剧烈涡旋以充分溶解。为了配制撞击溶液二，将要装载到聚合物囊泡内的亲水性货物溶解于500微升的水相缓冲液中。向适当大小的储液器中加入2.5毫升所选的水相缓冲液。然后，将储液器置于CIJ混合器下方，使混合器的流出液直接进入储液器。将撞击溶液分别装入1毫升塑料一次性注射器中，然后将注射器插入CIJ混合器顶部的鲁尔锁接头，使溶液相互撞击，从而同时形成纳米结构。以单一、平稳且快速的动作，同时以相等的力度压下两个注射器。如果需要进行多次撞击，必须尽可能快速地完成，以减少挥发性有机溶剂的损失。为进行多次撞击，将新生的纳米结构溶液分装至两个注射器中，并重复此步骤最多四次。将流出液收集到装有水相缓冲液的储液池中，并轻轻搅拌以确保充分混合。有多种方法可用于去除未负载的货物和有机溶剂。可通过切除排除或脱盐柱、切向流过滤系统、真空干燥或透析去除纳米载体制剂，此处以透析为例进行说明。使用与冲击过程相同的水相缓冲液和储液器对纳米载体制剂进行透析。选择适当分子量截留值的透析管，透析时间至少为24小时，并至少更换两次缓冲液。将未载药的货物从有机溶剂中移除后，按照制造商的说明，使用离心浓缩系统对纳米载体制剂进行浓缩。纳米载体可在4摄氏度下保存数周至数月。储存后使用前，应将纳米载体制剂短暂涡旋混匀。按照文本方案中的描述进行高速注射泵的制作。要使用自动运行模式，请从主菜单中选择自动运行。系统将提示用户允许电机自动将注射器推注平台定位到精密滑轨的起始位置。操作前请确保金属板前后路径畅通。将CIJ混合器装入后部排出滑块的矩形开口中。然后，像之前一样装入1毫升塑料注射器，并将注射器安装到CIJ混合器的雌性接头连接口上。在运行仪器之前，按照文本方案中所述设置所需的电机转速，并检查系统是否畅通。在软件界面中按下运行按钮，将反应物从注射器推出并注入CIJ混

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

快速, 可伸缩的组装和负载的生物活性蛋白和免疫增强剂到不同的合成 Nanocarriers 通过闪光 Nanoprecipitation

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纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

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碳纳米管稳定的内源性自组装脂质颗粒的简便制备

采用简单的均质化方法制备新型高密度、模拟高密度脂蛋白的纳米颗粒，用于包载神经生长因子。本文详细阐述了纳米颗粒制备过程中的挑战及具体实验方案， 体外 表征，以及 体内 本文描述了相关研究。...

新型高密度脂蛋白模拟纳米颗粒的制备及表征用于包载神经生长因子

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用于在聚合物纳米颗粒中包载疏水性和亲水性化合物的闪速纳米沉淀法

在有机相与水相溶剂的界面处，经设计的两亲性弹性蛋白样蛋白会响应环境参数，自组装形成囊泡、纤维和凝聚体等复杂的超分子结构。所述组装方案可制备具有可调控特性的蛋白膜基区室（PMBCs），实现多种货物分子的包封。...

弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外...

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

纳米凝胶是一种用于递送生物制剂的优良且多功能的纳米颗粒平台。采用一步交联共纳米聚合策略，在水相条件下合成了能够包载基于蛋白质的有效成分的响应性聚乙二醇基聚合物纳米凝胶。本文介绍了这些新型纳米颗粒的最佳制备方法及其表征过程。...

使用一步水相交联共纳米聚合方法合成刺激响应性纳米凝胶

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。...

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

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