Name: 光谱分析 TRPV1 的纯化与重构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习TRPV1离子通道的纯化与重构方法，利用电子顺磁共振和双电子共振光谱技术分析其多模态激活过程中的构象变化。该方案适用于研究哺乳动物TRP通道的结构与功能。

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我们非常感谢 H. Mchaourab 博士提供 EPR 和 DEER 波谱仪的使用权限，以及 T. Rosenbaum 博士提供全长无半胱氨酸 TRPV1 质粒。

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前用于表达和纯化哺乳动物膜蛋白的技术已能够获得足量的蛋白质，用于光谱学研究14,15,16,42。在此，我们已将这些技术应用于TRPV1蛋白的表达、纯化、重组以及光谱分析。
在本实验方案的关键步骤中，以下是我们针对TRPV1已进行故障排查、并可能需要根据其他蛋白质进行调整的步骤。应修改DNA序列以生成可产生0.5–1 mg/mL去垢剂纯化蛋白的模板；若模板产生的蛋白量低于0.5 mg/mL，则会带来困难，因为每种突变体需要培养超过6升的昆虫细胞培养物。蛋白必须浓缩至不低于2 mg/mL，且不含TCEP，以提高自旋标记效率。在低蛋白浓度下和/或存在TCEP残留的情况下进行标记将产生噪声较大的EPR谱图。尽管蛋白在纯化过程中保持在4 °C，但自旋标记必须在室温（RT）下进行，以提高效率。在纯化和标记过程中，甘油有助于提高蛋白稳定性...

随着单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）的最新进展，哺乳动物离子通道结构正以前所未有的速度被解析。特别是对多模态离子通道（如瞬时受体电位香草素1型通道，TRPV1）的结构研究，进一步加深了我们对其激活机制的理解1,2,3,4,5。然而，要理解离子通道的多模态门控机制及药物结合机制，还需获得其在膜环境中嵌入状态下的动态信息。
电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）波谱技术为离子通道提供了部分最明确的机制模型6,7,8,9,10,11,12,13。这些方法主要局限于原核和古菌离子通道的研究，这些通道在细菌中过表达时可获得大量经去垢剂纯化的蛋白质。随着真核膜蛋白在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达技术的发展，用于功能和结构表征14,15,16，目前已有可能获得足够生化量的去垢剂纯化蛋白用于波谱学研究。
EPR 和 DEER 信号来源于一个&#160;顺磁性自旋标记（SL）即，甲硫基磺酸盐）连接到蛋白质的单个半胱氨酸残基上。自旋标记可提供三类结构信息：运动性、可及性和距离。这些信息可用于判断在无配体状态和配体结合状态下，残基是埋藏于蛋白质内部，还是暴露于膜环境或水相环境中。13,17,18,19在高分辨率结构（若可获得）的背景下，EPR 和 DEER 数据提供了一系列约束条件，可用于在其天然环境中构建动态模型，同时监测可逆的门控转变过程。即，关闭态、开放态、致敏态和脱敏态）。此外，利用这些环境数据集还可确定蛋白质中的二级结构及其位置，包括那些通过X射线晶体学或冷冻电镜难以解析的柔性区域。20在脂质纳米盘中获得的冷冻电镜结构为离子通道的门控机制提供了重要信息3,21,22,23,24,25；然而，光谱学方法可以提供来自构象状态的动态信息（例如，这些热力学变化可能难以通过冷冻电镜（cryo-EM）确定。
实施电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）技术时必须克服诸多困难，包括去除所有半胱氨酸残基后蛋白质功能的丧失（尤其是在哺乳动物离子通道中半胱氨酸含量丰富）、蛋白质产量低、纯化过程及自旋标记后蛋白质不稳定，以及蛋白质在去垢剂或脂质体中发生聚集等问题。本文中，我们设计了一系列实验方案以克服这些关键障碍，并成功获得了哺乳动物感觉受体的DEER和EPR谱图信息。本文旨在描述一种功能性、最小化且不含半胱氨酸的大鼠TRPV1（eTRPV1）构建体的表达、纯化、标记及重组方法，用于光谱学分析。该方法适用于那些即使去除半胱氨酸残基后仍能保持功能的膜蛋白，或含有形成二硫键半胱氨酸的膜蛋白。这一系列实验方案可被调整用于其他哺乳动物离子通道的光谱学分析。

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning 定点突变试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>直链淀粉树脂</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>大豆卵磷脂</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>杆状病毒-杆状病毒表达系统</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 吸附剂&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃移液管（3.5&#039;&#039;（卵母细胞注射）</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃移液管（卵母细胞记录）</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂·2H₂O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>羧苄西林（二钠）</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin 试剂</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-麦芽糖一水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM（正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷）</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>高葡萄糖培养基（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 中等）</td><td>Sigma</td><td>D0572&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>一次性 PD-10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus 质粒DNA小量提取试剂盒</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR 纯化试剂盒</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（25 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧瓶 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-硫代-β-半乳糖苷）</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤，Miller</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>亮肽素半硫酸盐</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL（1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-3-基）甲基甲烷硫代磺酸酯</td><td>多伦多研究化学品公司</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>泊洛沙姆 F-127（20%）</td><td>PromoKine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>密封毛细管</td><td>VitroCom</td><td>特殊订单</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM（昆虫细胞培养基）</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9细胞（SFM适应性）</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>大豆极性脂质提取物</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>非洲爪蟾卵母细胞</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue 感受态细胞</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 免染预制胶</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 表达载体</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac感受态细胞</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal毛细管密封剂</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Model 3130XL 遗传分析仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

用于光谱分析的trpv1纯化与重组

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

多模态离子通道可将多种不同性质的刺激转化为变构变化；这些动态构象的确定具有挑战性，目前仍大多未知。随着单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的最新进展，多种离子通道的激动剂结合位点结构特征及其激活机制得以揭示，这为利用光谱学方法深入分析其门控机制奠定了基础。电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）等光谱技术此前主要局限于研究可大量纯化的原核离子通道。由于需要大量功能完整且稳定的膜蛋白，哺乳动物离子通道在这些方法中的应用受到限制。EPR 和 DEER 具有诸多优势，包括能够测定蛋白质可移动区域的结构与动态变化（尽管分辨率较低），而这些信息可能难以通过X射线晶体学或cryo-EM获得，同时还能监测可逆的门控行为转变（即关闭态、开放态、致敏态和脱敏态）。本文中，我们提供了获取毫克级功能性去垢剂溶解的瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）的实验方案，该蛋白可用于EPR和DEER光谱学的标记研究。

无半胱氨酸最小TRPV1构建体（eTRPV1）及单一半胱氨酸突变体的功能表征
进行光谱研究的第一步是设计并表征无半胱氨酸的功能性蛋白构建体（图2A），以获得可用于生化实验量的蛋白质。eTRPV1具有功能活性，这一点已通过Ca2+成像和双电极电压钳（TEVC）技术确认（图2B-C）。此外，eTRPV1能够提供足量经去垢剂纯化的蛋白，可用于电子顺磁共振（EPR）和双电子-电子共振（DEER）实验（每升Sf9细胞可获得0.5 - 1 mg蛋白）26。在特定蛋白区域引入单个半胱氨酸可能会影响其功能。图2B展示了eTRPV1上两个单半胱氨酸突变体（E651C和A702C）的示例，它们的功能...

本文描述了获取去垢剂溶解的TRPV1生化量以进行光谱分析的具体方法。这些联合方案提供了生物化学和生物物理工具，可经适当调整后用于在膜环境可控条件下开展哺乳动物离子通道的结构与功能研究。

用于光谱分析的TRPV1纯化与重组

多模态离子通道可将多种不同性质的刺激转化为变构变化；这些动态构象的确定具有挑战性……

在本实验室中，我们认为采用光谱学方法有助于回答瞬态受体电位离子通道家族中的关键科学问题，例如确定与多模态激活相关的动态信息变化。本方案的主要优势在于，能够获得毫克级纯度高且具有功能活性的剩余离子通道，适用于电子顺磁共振及双电子-电子共振波谱分析。该方法可用于研究与3B1的热和光非依赖性门控相容的构象变化。该方法也可应用于其他三聚体通道，例如3B2。首先使用在线工具设计定点突变引物。按照文本方案中的说明配制PCR反应体系，并离心混合物。将反应管放入热循环仪中，根据文本方案中列出的PCR参数进行PCR定点突变。然后向反应体系中加入2 µL DPN1酶，并混匀。将反应物在37摄氏度孵育30分钟。接着，向预冷的14毫升无菌管中加入75微升解冻的大肠杆菌感受态细胞和10微升经DPN1处理的PCR混合物，进行转化。轻轻混匀后，将反应物置于冰上孵育30分钟。将试管在42摄氏度下保持45秒，然后立即置于冰上冷却2分钟。将混合物涂布于含羧苄青霉素的LB琼脂平板上，于37摄氏度过夜培养。根据文本方案所述，挑取单菌落并制备过夜培养物后，以8000 × g离心10分钟收集菌体。然后，按照 commercially available mini preparation kits 的说明书提取 DNA。为构建重组杆状病毒基因组，将 7.5 纳克重组供体质粒转入 100 微升 DH10bac E. coli 感受态细胞中。这些质粒载体包含功能性的最小结构域、无半胱氨酸的野生型大鼠 TRPV1（缩写为 eTRPV1），以及单个半胱氨酸突变体。按照文本方案接种并培养细胞后，挑选直径为两毫米的白色菌落，因为蓝色菌落不含有目标插入片段。使用体视显微镜确认白色菌落中不含任何蓝色斑点。至少挑取三个单菌落，并将其转移至含有4毫升添加了相应成分的LB培养基的14毫升无菌试管中。将细胞在37摄氏度、250 RPM条件下过夜培养。取1.5毫升过夜培养物，分离重组杆状病毒DNA。为生成重组杆状病毒，将一百万个SF9细胞接种于两毫升昆虫细胞培养基中。让细胞贴壁至少45分钟。用一毫升新鲜培养基洗涤一次后，移除洗涤用培养基，并向细胞中加入DNA转染试剂混合物。将细胞在27°C下孵育5小时，期间不进行振荡。孵育后，移除转染混合物，并加入含有0.5%胎牛血清的2毫升昆虫细胞培养基。然后，将细胞在27°C下孵育5天。将细胞培养上清转移至15毫升离心管中。通过在 4 摄氏度下以 8000 × g 离心 15 分钟，分离第一代病毒原液。将上清液转移至一个新的 15 毫升离心管中，并立即在 4 摄氏度下保存。对于第二代病毒原液，用移液器将含有 2% FBS、浓度为每毫升一百万个 SF9 细胞的 25 毫升昆虫细胞培养液加入 125 毫升培养瓶中。向25毫升培养物中加入25微升P1病毒。然后在27摄氏度下培养72小时。为收获P2

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

光谱分析 TRPV1 的纯化与重构

我们描述了一种简单的方案，用于鉴定与ATP门控P2X2受体全长C末端结合的脑蛋白。将该方法拓展并系统地应用于所有P2X受体，有望加深对P2X受体信号转导机制的理解。...

蛋白质组学鉴定与P2X2配体门控阳离子通道相互作用的蛋白质

等速电泳（ITP）是一种强大的电动力学分离和预富集技术，其应用范围从毒素检测到样品制备。本文综述了ITP的物理原理，并介绍了该技术在两个具体示例应用中的方法：小分子的分离与检测，以及从细胞培养裂解液中纯化核酸。...

芯片上等速电泳用于离子分离与核酸纯化

微量热泳（MST）可广泛用于测定结合亲和力，而无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白。该方案包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白、裂解细胞，并在不同浓度配体存在下检测MST信号。...

无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

为了补充研究TRPV4的常用方法，本文描述了两种方法：可通过低渗刺激下转基因酵母中的Ca2+-腔肠素发光测定法来研究其机械敏感性；也可通过向Xenopus卵母细胞注射TRPV4...

酵母发光检测与Xenopus卵母细胞电生理检测对TRPV4分子机械敏感性的研究

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。...

利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。...

将跨膜蛋白——电压门控离子通道KvAP——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

本文描述了如何开展基于（单分子）荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，用于测量T细胞抗原受体（TCR）与负载抗原肽的主要组织相容性复合物（MHC）分子之间的结合动力学过程，该过程发生在T细胞与功能化的平面支撑脂双层接触时所形成的免疫突触内。...

测量TCR-pMHC结合 原位 使用基于FRET的显微镜检测法

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

根据INAD蛋白复合物的组装机制，本方案采用改良的亲和纯化结合竞争策略，以纯化内源性的Drosophila...

内源性Drosophila瞬时受体电位通道的纯化

本方案描述了一种基于iSCAT的图像处理与单粒子追踪方法，可同时研究大分子与脂质膜相互作用时的分子质量及其扩散行为。文中提供了样品制备、质量-对比度转换、视频采集和后期处理的逐步操作指南，并给出了避免潜在问题的建议。...

利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

学习TRPV1离子通道的纯化与重构方法，利用电子顺磁共振和双电子共振光谱技术分析其多模态激活过程中的构象变化。该方案适用于研究哺乳动物TRP通道的结构与功能。

用于光谱分析的TRPV1纯化与重组

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