高效纯化及基于液相色谱-串联质谱的十一种易位-2 5-甲基胞嘧啶双加氧酶检测方法开发

该方法有助于解答表观遗传学及TET2介导的5-甲基胞嘧啶去甲基化领域中的关键科学问题，例如对正常与临床TET2突变体活性的分析。该技术的主要优势在于，可在一步纯化中获得天然TET2蛋白，并能够针对其催化生成的全部三种产物来分析其酶活性。多位研究生将演示该实验操作流程。

蛋白质纯化由 Chayan Bhattacharya 完成，TET2 检测由 Aninda Sundary Dey 完成，LC-MS/MS 分析由 Navid Ayon 完成。进行细菌转化时，将 1 微升含有无标签人源 TET2 双加氧酶的重组 pDEST 14 目的表达载体加入到 1.7 毫升离心管中的 100 微升化学感受态 E.coli BL21 DE3 细胞中。冰上孵育至少 15 分钟后，将混合物在 42 摄氏度水浴中热激 30 秒。

热激后立即将细胞放回冰上，至少放置两分钟。随后向细胞中加入250 µL含葡萄糖的超级优化培养基（SOC）。将细菌细胞在37 °C摇床中孵育1小时。

孵育后，将离心管在9,000 × g条件下离心1分钟，使细胞沉淀。用移液器弃去70%的上清液，并将沉淀物溶解于剩余的培养基中。将细胞悬液涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的Lirua肉汤琼脂平板上。

将培养板在37摄氏度下孵育16小时。挑选一个单菌落，接种至10毫升LB氨苄青霉素培养基中。将试管置于37摄氏度摇床中过夜培养。

随后，取 100 微升细菌培养物接种于 100 毫升含氨苄青霉素的 LB 培养基中，作为初级培养。将试管置于 37 摄氏度摇床中过夜培养。次日，将 15 个烧瓶分别接种，每个烧瓶中含有 600 毫升含氨苄青霉素的 LB 培养基，并向每瓶加入 6 毫升初级培养液。

将锥形瓶置于37摄氏度摇床中，以180转/分钟（RPM）振荡培养。为检测细菌培养物的密度，使用分光光度计在600纳米波长下测定其光密度（OD600）。当培养物在OD600处的密度达到0.8时，向每瓶培养物中加入300微升1摩尔的IPTG，诱导TET2蛋白表达，并在17摄氏度下继续培养16小时。

孵育结束后，将细菌培养物转移至离心管中。在5,250 × g 条件下离心表达TET2酶的细菌培养物45分钟。使用所得细菌沉淀进行TET2纯化。

在冰上或4 °C条件下，将细菌沉淀重悬于100毫升50毫摩尔/升MES缓冲液（pH 6）中。然后取5毫升细胞悬液，用缓冲液定容至45毫升。以功率20超声处理悬液，每次30秒，重复5次，每次间隔冷却60秒。

将裂解液在5,250 × g条件下离心45分钟。收集含有可溶性TET2酶的上清液，并在上样至FPLC系统前经0.45微米滤膜过滤。将30毫升强阳离子交换树脂装填至FPLC色谱柱中。

使用FPLC系统，以0.3毫升/分钟的恒定流速，用10个柱体积的洗涤缓冲液对层析柱进行平衡。将澄清的裂解液上样至预先平衡的层析柱中，并用约10个柱体积的洗涤缓冲液洗涤，直至穿流液变为澄清。采用从洗涤缓冲液到洗脱缓冲液的0%至10%线性梯度，在15个柱体积内洗脱TET2，随后在10%洗脱缓冲液条件下保持2个柱体积。

在上柱前后以及所有洗脱组分中分别收集100微升细胞裂解液样品，使用10%分离胶的SDS-PAGE进行分析。合并含有TET2蛋白的组分，并将蛋白冻干。然后将酶溶解于10毫升水中，于-80摄氏度保存。

所有去甲基化反应均设三个重复，每个重复使用三微克底物。将100微克纯化的TET2酶加入至总体积为50微升的反应缓冲液中。在37摄氏度孵育一小时后，加入5微升500毫摩尔的EDTA终止TET2催化的氧化反应。

为准备用于分析的样品，首先向55微升终止反应的产物中加入100微升寡核苷酸结合缓冲液，从而将DNA从TET2反应混合物中分离。随后，向该混合物中加入400微升100%乙醇。将此混合物通过寡核苷酸结合柱。

用750微升洗涤缓冲液洗涤结合的DNA后，用20微升水洗脱DNA。接着，将分离得到的DNA在37摄氏度下用2单位的DNase I和60单位的S1核酸酶消化12小时，以产生单个核苷一磷酸。消化完成后，向样品中加入2单位的小牛肠碱性磷酸酶。

在37摄氏度下额外孵育12小时，以去除核苷单磷酸的末端磷酸基团，获得核苷。使用高效液相色谱级水配制所有修饰胞嘧啶核苷及正常DNA碱基的100微摩尔浓度储备液，用于LC-MS/MS方法的建立。在增强型MS扫描模式下，以每分钟10微升的流速依次将储备液注入质谱仪，优化依赖于核苷的MS/MS参数。

可使用软件的自动定量优化功能对每种DNA核苷进行多个参数的优化。接下来，在流动注射分析模式下，使用软件的手动定量优化功能对每种DNA核苷的其余参数进行优化。现在，通过梯度洗脱注入10 µL储备溶液，流动相B为25%，流速为0.3 mL/min，以优化与离子源相关的串联质谱参数。

为分离全部八种DNA核苷，按照文本方案在C18柱上进行液相色谱。最后，采用LC-MS/MS方法结合标准曲线对所有核苷进行检测和定量。由于TET2的催化结构域等电点相对较高，与大多数内源性大肠杆菌蛋白相比，因此开发了一种利用阳离子交换色谱的有效纯化流程。

该纯化步骤单步即可获得纯度超过90%的TET2酶。为了在TET2酶促反应后分离并定量不同的脱氧胞苷衍生物及四种天然DNA碱基，优化了一种灵敏的基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的检测方法。标准曲线采用含有所有核苷的混合物进行系列稀释后绘制而成。

此处展示了液相色谱串联质谱（MS/MS）方法的结果。该方法可实现四种正常DNA碱基以及四种修饰胞嘧啶碱基的分离与定量。在本实验流程中，我们描述了利用位点特异性重组技术克隆无标签的人源TET2双加氧酶催化结构域，并在大肠杆菌中于目的载体内实现充分表达的方法。

我们利用阳离子交换色谱法高效纯化了无标签的TET2酶，单步操作即可获得纯度超过90%的产物。此外，我们开发了一种新型液相色谱方法，可分离四种正常的DNA碱基和四种修饰的胞嘧啶碱基。为了定量分析TET2催化反应生成的八种核苷，我们将优化后的液相色谱方法与串联质谱技术相结合。

随后采用高灵敏度的LC-MS/MS检测方法测定无标签重组人源TET2酶的活性。本文所述方法将显著提升对野生型及突变型TET2双加氧酶的评估能力。