Name: 酵母 2-混合筛在批次中比较蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学习酵母双杂交批量筛选技术，利用深度测序比较多个诱饵蛋白的相互作用谱，揭示差异互作组。该方法结合pTEF-GBD质粒构建与免疫印迹验证，为分子和细胞生物学研究提供高效工具。

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感谢人类遗传学研究所工作人员在下一代测序文库制备与测序方面提供的支持。感谢Einat Snir在制备本研究中所用酵母双杂交质粒文库的基因组文库片段方面的专业贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH R21 EB021870-01A1）和美国国家科学基金会研究项目基金（1517110）资助。

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作者无任何利益冲突需要披露

本文提供了使用优化方法批量进行酵母双杂交（Y2H）实验的操作指南。该实验流程中有若干关键步骤，有助于确保用于筛选的酵母群体能够代表起始文库，并使用足够数量的起始酵母群体进行筛选，以减少变异性。重要的是，这些基准在对传统Y2H实验的方法和材料进行调整时相对容易实现，因此大多数具备常规分子生物学实验条件的实验室均可采用该方法。DEEPN技术允许在使用不同诱饵质粒的同时，从相同的猎物文库群体中进行筛选，因此可直接比较与不同诱饵产生Y2H相互作用的候选互作分子。由于采用了深度测序技术，可以验证每种诱饵特异性酵母群体的起始文库组成，并独立追踪文库中每个候选猎物基因的富集情况。批量处理可实现对同一文库与不同诱饵的半定量检测，从而能够计算出统计学排序4。
本方案中有多个步骤对成功至关重要。其一是必须获得大量二倍体细胞，以确保酵母双杂交（Y2H）猎物文库得到充分代表，并与每种目标诱饵质粒充分混合。本文所述的接合（mating）程序已通过优化多个参数而改进。我们发现，某些承载商业化Y2H文库的菌株通常接合效率较低，但采用此处描述的接合方法可产生 2 ×...

要全面理解细胞生物学过程，关键在于揭示其分子机制所依赖的蛋白质相互作用网络。鉴定蛋白质相互作用的一种方法是酵母双杂交（Y2H）实验，该方法通过目标蛋白结构域相互结合后组装成有功能的嵌合转录因子来实现检测1。典型的Y2H筛选是通过构建一群酵母细胞来完成，这些细胞同时含有编码相互作用蛋白与转录激活域融合的质粒文库（例如，“猎物”融合蛋白），以及一个给定的“诱饵”质粒，该质粒包含目标蛋白与DNA结合域的融合（例如，Gal4 DNA结合域，可结合Gal4上游激活序列）。Y2H方法的主要优势之一是，在具备常规分子生物学实验条件的典型实验室中，该实验相对容易且成本较低2。然而，在传统操作中，研究人员需对筛选出的阳性Y2H相互作用的单个菌落进行取样分析，这极大地限制了可检测的文库“猎物”克隆数量。当某一特定相互作用的猎物丰度远高于其他猎物时，该问题尤为突出，从而降低了检测低丰度猎物质粒相互作用的可能性。
利用酵母双杂交（Y2H）原理实现对蛋白质组全面覆盖的一种解决方案是采用矩阵式方法，即通过数字方式检测含有已知单个猎物质粒的阵列。然而，这种方法需要特定的基础设施，对于希望鉴定少数蛋白质或结构域相互作用组的独立研究人员而言，往往难以获得且成本高昂3。此外，若猎物文库极为复杂，可能编码多个相互作用蛋白的片段，这将使矩阵阵列的规模扩大到不切实际的程度。另一种替代方案是批量使用复杂文库进行实验，并通过大规模并行高通量测序来评估相互作用克隆的存在情况4。该方法可用于检测在多个菌落中出现的猎物质粒，其基于典型的Y2H实验格式，允许携带相互作用融合蛋白对的酵母细胞在平板上生长5,6。这一总体思路可进一步强化，以同时提高对多个诱饵和猎物组分的检测能力7,8。
然而，许多研究仅需针对少数几种蛋白质“诱饵”进行更简便且更集中的分析，通过全面且半定量地查询单一复杂猎物文库，可获得更大收益。我们开发并验证了一种基于酵母双杂交（Y2H）原理的批量操作方法，用于开展大规模蛋白质相互作用研究4。该方法利用特定猎物质粒扩增速率作为Y2H相互作用相对强度的替代指标9。对处于正常生长或选择性生长条件下的群体中所有质粒进行深度测序，可获得产生强或弱Y2H相互作用克隆的完整图谱。由此可获取相互作用蛋白的谱系，并在多个诱饵质粒之间进行直接比较。该工作流程被称为DEEPN（动态富集用于蛋白质网络评估），可用于从相同猎物文库中鉴定差异相互作用组，从而实现一种蛋白质与另一种蛋白质之间的比较分析。
本文中，我们演示了 DEEPN 技术，并介绍了可促进其应用的实验方法改进，这些改进如图1所示。主要改进包括：
猎物质粒酵母文库的构建。 DEEPN 的关键要求之一是构建含有不同诱饵质粒的酵母群体，且这些群体需具有相同的猎物质粒文库分布。为了在不同诱饵的相互作用组之间进行准确比较，必须确保猎物质粒文库具有等效的基础群体。当文库质粒已存在于单倍体酵母群体中，并通过交配将特定诱饵质粒导入该群体以形成二倍体时，最有利于实现这一目标。在此，我们提供了使用商业化的单倍体酵母文库构建此类群体的详细操作指南。尽管我们发现某些方法可产生大量二倍体，但这些含商业化文库的酵母菌株整体交配效率较低。因此，我们构建了一种新型菌株，该菌株可承载猎物质粒文库，并在每次交配反应中产生远更高数量的二倍体。
新的诱饵质粒组合许多当前用于表达“诱饵”融合蛋白的质粒，其融合蛋白由目标蛋白与DNA结合域组成 2&#181;基于此，它们能够扩增自身的拷贝数。该拷贝数在群体中可能具有较大变异性，从而导致酵母双杂交转录响应的差异。这反过来可能影响根据细胞在选择性条件下的生长反应来评估特定蛋白质相互作用强度的准确性。部分可通过使用低拷贝质粒来缓解这一问题，其中一些已有文献报道，例如 commercially available pDEST3210我们构建了一种新的诱饵质粒（pTEF-GBD），可在其中表达Gal4-DNA结合结构域融合蛋白 TRP1 基于着丝粒的低拷贝质粒，携带Kanr抗性基因，同时允许将诱饵片段克隆至Gal4 DNA结合域的上游和下游。
新型高密度 Y2H 片段文库。我们构建了一种新的质粒用于承载 Y2H 捕食者文库，并利用该质粒构建了一个高度复杂的 Y2H 文库，该文库由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组 DNA 的随机剪切片段组成。序列分析显示，该文库包含超过 100 万个不同的元件，其复杂性远高于此前报道的酵母基因组 Y2H 质粒文库11。利用这一新文库，我们证实 DEEPN 工作流程具有足够的稳健性，能够以可靠且可重复的方式容纳包含大量不同质粒的复杂文库。

<table><tbody><tr><td>llumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>深度测序平台</td></tr><tr><td>单克隆抗HA抗体</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>用于检测pGal4AD载体中HA表达的一抗</td></tr><tr><td>多克隆抗myc抗体</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>用于检测pTEF-GBD载体中MYC表达的一抗</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇3350，粉末</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子DNA</td><td>Trevigen, Inc 销售于 Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>酵母转化中使用的载体DNA，见第3.2.1节</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Research Products International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE琼脂糖</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>用于制备DNA琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Research Products International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Research Products International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA钠盐</td><td>Research Products International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物粉末</td><td>Research Products International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>酵母氮源基础（含硫酸铵）不含氨基酸</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td>用于第1节中培养基平板的制备</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基-1,2,4-三唑</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly克隆试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>第2节中用于质粒克隆的快速组装方法</td></tr><tr><td>NEBNext高保真2x PCR预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>用于第2.3节中Gibson Assembly产物的扩增，以及第6.2.1节DEEPN深度测序的样品制备</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于第6.2.3节中PCR产物的纯化</td></tr><tr><td>Qiaquick DNA凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>用于第2.1节中消化后的pTEF-GBD质粒的纯化</td></tr><tr><td>KAPA Hyper Prep试剂盒</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>深度测序样品制备试剂盒</td></tr><tr><td>密码子优化</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>密码子优化</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>第2.2节克隆中使用的DNA片段</td></tr><tr><td>Strings</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>第2.2节克隆中使用的DNA片段</td></tr><tr><td>GenCatch质粒DNA小量提取试剂盒</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>用于第2.3节中DNA的制备</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>第7节中使用的高性能超声破碎仪</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;- CGGTCTT&lt;br/&gt; CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于质粒构建过程中pTEF-GBD 5'插入片段的PCR扩增和测序</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;-GAGTAACG&lt;br/&gt; ACATTCCCAGTTGTTC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于质粒构建过程中pTEF-GBD 5'插入片段的PCR扩增和测序</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;-CACCGTAT&lt;br/&gt; TTCTGCCACCTCTTCC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于质粒构建过程中pTEF-GBD 3'插入片段的PCR扩增和测序</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;-GCAACCGC&lt;br/&gt; ACTATTTGGAGCGCTG-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于质粒构建过程中pTEF-GBD 3'插入片段的PCR扩增和测序</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;-GTTCCGATG&lt;br/&gt; CCTCTGCGAGTG-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于pGAL4AD插入片段扩增的5'引物</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;-GCACATGCT&lt;br/&gt; AGCGTCAAATACC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于pGAL4AD插入片段扩增的3'引物</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;-ACCCAAGCA&lt;br/&gt; GTGGTATCAACG-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于pGADT7插入片段扩增的5'引物</td></tr><tr><td>寡核苷酸 5&amp;rsquo;- TATTTAGA&lt;br/&gt; AGTGTCAACAACGTA -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies 或 Thermofisher</td><td></td><td>用于pGADT7插入片段扩增的3'引物</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA酵母菌株</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: 酵母中高效双杂交筛选用基因组文库及宿主菌株设计. GENETICS 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper 实验室</td><td></td><td>Gal4-DNA结合结构域表达质粒</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper 实验室</td><td></td><td>Gal4-激活结构域表达质粒</td></tr><tr><td>100 mm培养皿</td><td>Kord-Vallmark 销售于 VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 mL PYREX三角烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX三角烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX三角烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 mL PYREX三角烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm 一次性培养管</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助装置（pipet-aid）</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX Griffin烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX可重复使用培养基储存瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL量筒</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>用于测定细胞的光密度</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>用于定量DNA含量的分光光度计</td></tr><tr><td>电子式紫外透射仪</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>用于在溴化乙锭琼脂糖凝胶中观察DNA</td></tr><tr><td>P1000 Gilson移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 &amp;micro;L低吸附移液器吸头</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L低吸附移液器吸头</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L XL低吸附移液器吸头</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>木制涂布棒</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf微量离心机5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>微量离心机</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>台式离心机</td></tr><tr><td>Amersham ECL兔IgG，HRP标记全抗体（驴源）</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Amersham ECL小鼠IgG，HRP标记全抗体（羊源）</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>二抗</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico化学发光底物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL检测溶液</td></tr><tr><td>Isotemp培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>培养箱</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>摇床培养箱</td></tr><tr><td>Isotemp数字控制水浴锅 205型</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>水浴锅</td></tr><tr><td>Y2H小鼠cDNA文库（泛组织）于Y187菌株中</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>商业化cDNA文库</td></tr><tr><td>Y2H小鼠cDNA文库（小鼠脑组织）于Y187菌株中</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>商业化cDNA文库</td></tr><tr><td>pGADT7 AD载体</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>商业化AD载体，可承载多种cDNA文库</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD载体</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>商业化DNA-BD载体</td></tr><tr><td>Biolase DNA聚合酶</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>第2.4节中使用的DNA聚合酶</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 PCR仪</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>PCR仪</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 mL PCR管</td><td>USA Scientific</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

一种批量进行的酵母双杂交筛选方法用于比较蛋白质相互作用

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

利用酵母双杂交实验筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一种有效的工具，但其应用在很大程度上局限于发现那些在相互作用候选文库中高度富集的高亲和力互作蛋白。在传统模式下，当在低严谨性条件下进行酵母双杂交实验时，可能会发现低亲和力的互作蛋白，但产生的菌落数量过多而难以分析。此外，若未针对不同的诱饵质粒对同一文库进行全面且完整的检测，则无法实现比较分析。尽管使用阵列化的猎物质粒文库可在一定程度上解决其中一些问题，但运行此类筛选所需的费用和基础设施可能过于昂贵。作为替代方案，我们对酵母双杂交实验进行了改进，采用一种称为DEEPN（动态富集用于蛋白质网络评估）的策略，在单次筛选中同时揭示数十种瞬时和稳定的蛋白质相互作用，该方法结合高通量DNA测序与计算分析，追踪编码相互作用伙伴的质粒群体的演化过程。本文中，我们描述了定制化的试剂和实验方案，可实现DEEPN筛选的简便且经济高效的执行。

Y2H 检测已广泛用于发现蛋白质：蛋白质相互作用，且已开发出多种改进方法和系统。在很大程度上，那些有助于先前方法取得成功的关键因素，对于 DEEPN 同样重要。其中一些关键指标包括：确保 DNA 结合结构域融合蛋白的表达；确保在含有目标诱饵和空载体猎物质粒的二倍体中，非特异性 His+ 生长背景信号较低；含有诱饵的 MATA 酵母与含有文库的 MATalpha 酵母具有高效的交配效率；最后，采用低严谨性筛选条件，使群体能够在选择多种阳性 Y2H 反应的条件下生长，即使这些反应产生的 His3 活性水平较低、Y2H 转录响应较弱也能被检出。
DEEPN 的一个关键方面是可重复地将 Y2H 文库导入含有不同诱饵质粒的菌株中，并可靠地筛选出能够产生阳性 Y2H 相互作用的文库质粒群体。当 Y2H 文库的复杂性增加时，这一过程变得更加困难，因为更难确保在整个不同起始群体之间充分转移完整的文库。此外，为选择条件下的生长所选取的群体规模以及测序深度必须足够大，以便...

批量处理酵母双杂交筛选可实现多种诱饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白集合之间相互作用谱的直接比较。本文介绍了优化的方法、新试剂及其在此类筛选中的应用方式。

利用酵母双杂交实验筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一种有效工具，但其应用在很大程度上局限于发现文库中高度富集的高亲和力相互作用分子。在低严谨性条件下进行传统形式的酵母双杂交实验时，可能会检测到低亲和力的相互作用分子，但由此产生的菌落数量过多而难以分析。此外，若未针对不同诱饵质粒对同一文库进行全面且完整的检测，则无法实现比较分析。尽管可使用阵列式猎物质粒文库来解决其中部分问题，但此类筛选所需的费用和基础设施可能过于昂贵。作为一种替代方案，我们改进了酵母双杂交实验，采用一种称为 DEEPN（用于蛋白质网络评估的动态富集）的策略，在单次筛选中同时揭示数十种瞬时性和稳定性蛋白质相互作用，并结合高通量 DNA 测序与计算方法，追踪编码相互作用分子的质粒群体的演化过程。本文中，我们描述了可实现 DEEPN 筛选的定制化试剂与操作流程，使其能够以简便且经济的方式实施。

该方法利用酵母双杂交系统在两个群体中的原理，鉴定与多种分子和细胞过程相关关键问题的蛋白质-蛋白质相互作用。该技术结合深度测序，用于分析一种蛋白质与另一种蛋白质之间的相互作用。由于该方法适用于平行比较，因此能够鉴定出与一种蛋白质或另一种蛋白质相互作用的蛋白质集合，或同一蛋白质的不同构象，或在分析致病突变体时揭示差异相互作用组。本实验流程中构建了一种新型酵母双杂交诱饵质粒 pTEF-GBD，其构建方法在文本方案中有详细描述。该质粒可在携带卡那霉素抗性基因的 TRP1 着丝粒型低拷贝质粒中表达 Gal4 DNA 结合域融合蛋白，并允许将诱饵片段克隆至 Gal4 DNA 结合域的上游和下游。该诱饵质粒用于转化 MATa 酵母，通过抗-MIC 抗体的免疫印迹验证 Gal4 诱饵融合蛋白的表达。此外，还构建了一个新的酵母双杂交文库，该文库使用简化的捕获蛋白表达质粒载体 PGAL4 AD。基因组 DNA 经剪切片段化、大小筛选、连接接头修饰后，插入 PGAL4-AD 载体中，从而构建 saxairtab 酵母双杂交文库。为启动构建含诱饵和猎物文库的酵母菌群的操作，接种三毫升培养液，分别含有携带不同 TRIP1 诱饵质粒的 MATa 酵母转化子，并使用 CSM minus TRP 培养基。设置两个独立的培养物，仅含有载体质粒，作为实验操作的对照。将培养物在30摄氏度、200 rpm条件下孵育6小时。随后将每种培养物稀释至25毫升，在无菌锥形瓶中过夜培养。在室温下解冻一管含有携带 lu2 的猎物质粒库的 MAT alpha 细胞。将整管解冻后的细胞用于接种 125 毫升无亮氨酸和甲硫氨酸的 CSM 培养基（CSM minus lu minus met），接种于无菌的锥形瓶中。于 30 °C、200 rpm 条件下过夜培养该菌液。在次日，确认过夜培养的mat a转化子菌液的OD600在1.0至1.5之间后，将菌液转移至50毫升锥形管中，在室温下以4,696 × g离心各菌液21个OD600单位，离心5分钟。将每份mat a细胞沉淀重悬于10毫升无菌水中，转移至新的50毫升锥形管，并在室温下以4,696 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，再将沉淀重悬于4毫升pH 3.7的缓冲YPDA培养基中。每需要进行10个交配反应，就在一个50毫升锥形管中收集携带文库质粒的mat alpha菌株，使其菌体量达到39个OD 600单位。用10毫升无菌水重悬mat alpha细胞，并在室温下以4,696 × g离心5分钟，在新的50毫升锥形管中重新沉淀细胞。使用移液器小心移除上清液，避免扰动沉淀的细胞，然后将沉淀物重悬于10毫升pH 3.7的缓冲YPDA培养基中。为设置每个交配反应，向一个新的50毫升锥形管中加入以下成分：1毫升MAT-A转化细胞、1毫升含有细胞的MAT-α文库以及1毫升pH为3.7的缓冲YPDA培养基。在30°C下以温和的旋转振荡培养90分钟。90分钟后，在室温下以4,696 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于两毫升体积比为1:1的缓冲YPDA-YPD溶液中。将全部两毫升细胞悬液接种至一个100毫米的YPD平板上，于30°C培养约20小时。收集细胞时，向每个YPD平板中加入两到三毫升CSM缺亮氨酸缺色氨酸培养基，用细胞刮刀刮下细胞。用移液器将脱落的细胞转移至一个50毫升锥形管中。使用1,000微升移液器，用2至3毫升CSM缺亮氨酸缺色氨酸培养基冲洗培养板4到5次，将培养基吸起并轻轻吹打至YPD平板表面。在室温下以4,696 × g离心5分钟。弃去每个锥形管中的上清液，用移液器反复吹打，将细胞重悬于 40 毫升缺乏亮氨酸和色氨酸的 CSM 培养基（CSM minus lu minus trip medium）中。为估算形成的二倍体细胞数量，分别将 4 微升二倍体混合液加入 200 微升和 2,000 微升缺乏亮氨酸和色氨酸的 CSM 培养基中进行稀释。取每种稀释液各 200 微升，涂布于缺乏亮氨酸和色氨酸的 CSM 平板上，以代表收获的二倍体细胞原液 1:10,000 和 1:100,000 的完整稀释度。将平板在30摄氏度下孵育36至40小时。立即将每份40毫升细胞重悬液的剩余部分接种到1升锥形瓶中的500毫升CSM缺乏亮氨酸和色氨酸培养基中。测定每种培养物在600 nm处的光密度（OD 600）。将这些烧瓶在30摄氏度、180 rpm振荡条件下培养，直至达到饱和状态，通常需要36至40小时。在培养24小时和36小时时，通过测量OD 600监测细胞生长情况。在继续后续操作前，需确认两种酵母菌株的交配效率。在1比10,000稀释度的平板上，至少需有200个菌落。待培养物达到饱和后，使用移液器从每种培养物中取出20毫升等分试样，接种至两个1升的锥形瓶中：一个锥形瓶中含有750毫升CSM缺失亮氨酸及色氨酸培养基，另一个锥形瓶中含有750毫升CSM缺失亮氨酸、色氨酸及组氨酸培养基。根据此前文本方案中所述，使用可消除背景的最低浓度的三种氨基酸（124 三唑）。通过轻轻旋转充分混匀新培养物。测定初始 OD 600 后，将培养物置于 30 °C、180 rpm 振荡条件下培养至饱和，未施加筛选压力的 CSM 缺乏亮氨酸和色氨酸（CSM minus lu minus trip）培养物通常在 24 小时内达到饱和，而施加酵母双杂交相互作用筛选压力的培养物则可能需要超过 70 小时。当培养物达到饱和后，用移液器吸取 11 毫升每种培养物，于室温下以 4,696 ×g 离心 5 分钟沉淀细胞。弃去上清液，并按下一节所示进行 DNA 提取。开始 DNA 提取步骤时，用移液器将先前制备的每份细胞沉淀重悬于 500 µL 强 TE 缓冲液中。转移至1.5毫升微量离心管中，每管加入10微升Zymolyase原液。在通风橱内，每管加入3微升β-巯基乙醇，充分混匀。在37摄氏度培养箱中孵育24至36小时。接下来，按照文本方案所述，用 500 微升酚氯仿异戊醇溶液对样品进行两次提取。加入 7 微升 4 摩尔的氯化钠和 900 微升冰浴预冷的 100% 乙醇，通过反复倒置混匀。在室温下，以 21,130 ×g 离心 10 分钟，使 DNA 沉淀。用移液器弃去上清液，每份沉淀用900微升70%乙醇洗涤三次。在21,130 × g离心两分钟以沉淀DNA。除去残留乙醇后，在42摄氏度下干燥沉淀七分钟。将每个沉淀物重悬于 120 微升 0.1x 强 TE 缓冲液中，置于 37 摄氏度水浴中孵育 90 分钟。用移液器将 60 微升提取的 DNA 转移至无菌的 1.5 毫升微量离心管中。加入 120 微升强 TE 缓冲液和 3.5 微升 RN ace A 储存液，轻轻弹动混匀，并在 37 摄氏度孵育 1 小时。向每个试管中加入七微升五摩尔的乙酸铵和900微升冰上预冷的100%乙醇。通过倒置混匀，并按先前所示方法沉淀DNA。将经RNace-A处理的DNA重悬于55微升0.1x强TE缓冲液中，在37摄氏度水浴中孵育90分钟。通过在 260 纳米处的吸光度定量 DNA。下一步是对 cDNA 插入片段进行 PCR。每个 DNA 样本进行两次 50 微升的 PCR 反应。向每个反应体系中加入水、5微克DNA样本、各25皮摩尔的与猎物文库质粒匹配的正向和反向引物，以及25微升高保真2x PCR预混液。使用以下程序扩增反应：98摄氏度变性30秒，进行25个循环，每个循环包括98摄氏度变性10秒、55摄氏度退火30秒、72摄氏度延伸3分钟，最后在72摄氏度孵育5分钟。通过含溴化乙锭的1% DNA琼脂糖凝胶电泳分析每个PCR反应，并用紫外透射仪观察凝胶。未经过筛选的样品显示为弥散的DNA涂布条带，而经过筛选后可分辨出单一条带。合并重复的PCR样品，并按照生产商说明书使用试剂盒进行纯化。使用分光光度计在 260 纳米处通过吸光度定量 DNA。随后，按照文本方案中所述进行深度测序、生物信息学处理及验证。在本实验中使用了新构建的随机片段化酵母双杂交文库，并通过 PCR 扩增质粒插入片段，采用 DEEP 测序及 DEEPN 软件进行生物信息学分析，并与先前发表的文库进行比较。该图展示了各文库中每个基因的每基因芦苇数（reeds per gene）经酵母基因组测序结果归一化后的排序。该直方图显示了编码位于蛋白质编码区且处于正确翻译读码框内片段的每基因唯一质粒数量。图中还比较了各文库中编码酵母基因的不同质粒数量，以及处于正确翻译读码框内、非正确读码框内或反向插入的质粒所占比例。总体而言，新的文库包含更多种类的质粒。这些方法可确保文库能够可重复地转移至含有不同诱饵蛋白的细胞中，并且筛选过程能够获得可重复富集的基因集合，从而将其识别为特异性的候选相互作用蛋白。一旦掌握，若操作得当，该技术可在大约一周内完成。这项工作的大部分时间都在培养细胞，实际动手操作的时间仅有数小时。在进行该实验时，重要的是要记住，需构建包含大量独立二倍体细胞的群体，以便能够将文库可重复地转移至含有不同诱饵蛋白的细胞中。同时，在对群体进行酵母双杂交阳性筛选时，必须密切注意细胞的稀释条件和生长速率。按照本实验步骤，配套研究中所述的计算方法将鉴定出候选的相互作用蛋白，并提供通过传统的酵母双杂交实验或其他生物化学方法验证这些相互作用的途径。观看本视频后，您应能充分掌握如何可重复地构建包含猎物质粒文库的二倍体酵母群体，并在批量培养中生长以筛选出阳性酵母双杂交相互作用。请注意，在DNA纯化过程中使用有机溶剂可能存在危险，务必在通风橱中操作，并佩戴手套和实验服。

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