人隐静脉的去细胞和 Recellularization 方法学研究
July 27th, 2018
在这里, 我们描述了一个协议的隐静脉去细胞使用洗涤剂和 recellularization 的血液灌注的外周血和内皮介质。
该方法解释了大隐静脉组织工程的详细程序。我们还演示了使用简单仪器制备用于再细胞化的脱细胞装置和生物反应器。该技术的主要优点是需要简单的血液样本进行再细胞化，从而消除了痛苦的骨髓采集和耗时的细胞培养程序。
对于 Triton-X 100 灌注和洗涤，准备脱细胞设置一。对于一个 2 升的腔室，将所有三根管子都用胶带粘住 A.将一根管子粘在边缘接触洗涤剂入口腔室底部的墙壁上。将另外两根管子用胶带粘在对面的壁上，中间的距离为 5 到 10 厘米，具体取决于静脉的长度。
至少五厘米的这些管子也应该用胶带粘在腔室的地板上。使用公头和内头诱饵连接器将洗涤剂的入口管连接到管 B。然后将管 B 连接到管 F，将管 F 连接到管 C，将管 C 连接到静脉入口。
现在，将管 F 放入蠕动泵的盒中。取另一根管 C，将一端连接到静脉的出口。将另一端放入装有底部软管出口的玻璃罐中，位于腔室上方 45 厘米处，并用胶带固定。
这用作洗涤剂出口。然后，将管 G 的一端推入玻璃罐的软管出口，并将另一端放入静脉腔中。接下来，按照文本方案中的详细说明为 TnBP 灌注准备脱细胞设置二。
还要按照文中详述的为 DNA 灌注准备脱细胞设置 3，并将其置于 37 摄氏度。为了制备再细胞化生物反应器，将管 H 插入四端口盖的一个端口中，作为静脉的出口。将管 I 插入第二个端口，作为培养基入口。
然后插入第三个端口，将管 J 插入静脉的入口。接下来，将管 H 的另一端插入第四个端口，作为介质出口。将变径接头连接到管 H 和 J 的内端，将管 J 的另一端弯曲成 U 形，并用缝合线系住。
现在，将 60 毫升平底试管放入 250 毫升玻璃杯中。接下来，将管 K 的一端连接到静脉的入口，将另一端连接到管 E，将管 E 连接到第二根管 K，然后连接到培养基入口。然后将准备好的瓶盖设置放入瓶中的试管中。
最后，通过高压灭菌对生物反应器进行灭菌。按照文本方案中的详细说明对人大隐静脉进行两次冻融循环，然后用剪刀剪下两毫米长的活检。在室温下将活检固定在甲醛中 24 至 48 小时。
用缝合线将静脉的每一端系在公母诱饵连接器的倒钩上。将静脉连接到脱细胞设置 1，并用 1 升溶液 2 填充腔室。现在，以每分钟 35 毫升的速度灌注 15 分钟，然后清空设置的内容物。
然后，加入 1 升溶液 4，以每分钟 35 毫升的速度灌注 4 小时。清空内容物，加入 500 mL 溶液 2，灌注 5 分钟，然后再次清空内容物。断开静脉与灌注设置 1 的连接，并将其连接到灌注设置 2。
接下来，加入 1 升溶液 5，打开搅拌器，以每分钟 35 毫升的速度灌注 4 小时。断开静脉与灌注设置 2 的连接，并用 20 毫升超纯水清洗静脉外部两次。然后用注射器用 20 毫升超纯水清洗静脉内部两次，持续 5 到 10 分钟。
按照文本方案中的说明使用灌注设置 3 灌注后，将静脉连接到灌注设置 1。填充 1 升溶液 2，并以每分钟 35 毫升的速度灌注过夜。重复灌注过程四次以完全去除细胞核物质。
灌注后，清空设置，填充 1 升溶液 2，并以每分钟 35 毫升的速度灌注 24 小时。24 小时后，再次清空设置并填充 1 升超纯水。以每分钟 35 毫升的速度再灌注 24 小时。
最后，使用相同的条件重复灌注，但使用溶液 7。按照文本方案中的说明验证脱细胞后，将其放入含有 50 毫升溶液 8 的 50 毫升试管中，对静脉进行消毒。在摇床中以每分钟 80 转的速度在 37 摄氏度下搅拌 1 小时。
在层流柜中工作以保持无菌状态，现在使用无菌镊子将无菌静脉转移到新的 50 毫升试管中，该试管中含有 50 毫升无菌溶液 7，含有 500 微升抗药剂。像以前一样搅动静脉 12 小时，中间至少更换两次溶液 7。使用无菌镊子，将静脉转移到新的 50 毫升试管中，加入 50 毫升内皮培养基，搅拌 11 小时。
现在，用无菌缝合线和镊子将其连接到生物反应器的静脉入口和出口，连接静脉，并将瓶盖设置拧紧到 250 毫升瓶中。用相同的内皮培养基填充生物反应器。以每毫升 50 单位的浓度加入肝素，并在培养箱中以每分钟 2 毫升的速度灌注 1 小时。
在肝素涂层的 vacutainer 管中从供体收集 15 至 25 毫升新鲜血液，并用 steen 溶液一比一稀释。然后，添加内分泌腺衍生的血管内皮生长因子、碱性纤维原始细胞生长因子和微量水杨酸。从生物反应器中清空内皮培养基后，将血液加入其中，并在 37 摄氏度的培养箱中以每分钟 2 毫升的速度灌注 5% 二氧化碳 48 小时。
大约 12 小时后，在层流柜中工作，从生物反应器中取出一滴血，并使用血糖监测设备测量葡萄糖。如果水平低于每升 3 毫摩尔，则添加葡萄糖，使其在每升 7 至 9 毫摩尔的范围内。放回培养箱中 48 小时后，将血液从层流柜中的生物反应器中排出。
加入 30 毫升无菌溶液 7，灌注 5 分钟，然后沥干溶液。重复此过程，直到失去血红色。最后，加入 30 至 45 毫升内皮培养基，并在培养箱中以每分钟 2 毫升的速度灌注 96 小时。
断开再细胞化的静脉与层流柜中的生物反应器的连接，用剪刀剪下静脉的 5 毫米边缘，然后丢弃。像以前一样进行活检，置于福尔马林中，并按照文本协议中的说明进行再细胞化验证。正常静脉的大体形态看起来呈鲜红色。
红色在进行性脱细胞周期中丢失，经过五个周期的治疗后，看起来苍白。通过外周血和内皮培养基灌注再细胞化的静脉再次呈鲜红色。这里显示的是正常静脉的代表性苏木精和伊红染色图像，显示存在许多蓝色细胞核。
然而，在脱细胞静脉的苏木精和伊红染色中未见蓝色细胞核。在灌注血液和内皮培养基的再细胞化静脉中，苏木精和伊红染色显示管腔存在细胞附着。看完这个视频，你应该对如何用去污剂进行隐静脉脱细胞以及用外周血和内皮培养基进行再细胞化有一个很好的了解。
这种在压力下使用 Triton-X 100、TnBP 和 DNA 灌注的脱细胞技术在从人大隐静脉中去除细胞核方面是成功且可重复的。虽然这项技术需要 20 天才能完成，但将脱细胞的静脉作为货架后产品储存会将手术时间缩短到 8 天。使用受者的外周血进行静脉再细胞化可能被认为具有临床相关性。
静脉用类似的方案再细胞化，通过在手术后提供功能性血液供应，在临床移植中显示出前景。只需稍作修改，该方案即可用于任何静脉类型，并作为临床上所有血管手术的个性化移植物。
概述
本文描述了一种使用洗涤剂对伏状静脉进行去细胞化的详细协议，以及随后通过外周血液和内皮培养基的灌流实现再细胞化的方法。该方法通过使用简单的血液样本简化了过程，从而避免了更具侵入性的程序。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 再生医学
- 血管生物学
背景
- 去细胞化对于组织工程中的支架创建至关重要。
- 传统方法通常需要复杂的细胞培养技术。
- 使用血液样本进行再细胞化可减少患者的不适。
- 内皮培养基在血管组织再生中起着重要作用。
研究目的
- 开发一种简单的伏状静脉去细胞化协议。
- 利用易获得的血液样本促进再细胞化。
- 提高组织工程技术的效率。
使用的方法
- 使用Triton-X 100和其他溶液准备去细胞化设备。
- 使用生物反应器进行再细胞化过程。
- 使用灌流技术确保彻底的去细胞化和后续的细胞种植。
- 监测葡萄糖水平以评估再细胞化组织的活力。
主要结果
- 该协议成功地去细胞化了伏状静脉。
- 血液和内皮培养基的再细胞化已实现。
- 葡萄糖监测表明再细胞化组织具有代谢活性。
- 该方法比传统技术更高效且侵入性较小。
结论
- 该协议为血管组织工程提供了一种可行的替代方案。
- 使用血液样本简化了再细胞化过程。
- 该方法在再生医学中具有潜在应用。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
Decellularization and recellularization of human saphenous veins enable the generation of patient-specific vascular grafts, reducing reliance on allogeneic or synthetic conduits that carry risks of immunosuppression and poor patency. This approach supports predictive confidence in graft functionality by using autologous peripheral blood, thereby de-risking translational pathways in vascular tissue engineering. The method provides a scalable platform for preclinical evaluation of personalized grafts, aligning with enterprise goals of risk-adjusted advancement in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular graft biocompatibility and thrombogenicity using autologous blood-derived cells.
- Operational Value: Reduces need for invasive cell sourcing, simplifying hypothesis testing in vascular regeneration models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, decellularized scaffolds with quantifiable extracellular matrix retention for consistent seeding efficiency.
- Operational Value: Supports reproducible perfusion-based recellularization assays using simple blood samples, enabling high-throughput viability screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates luminal endothelialization and metabolic activity via glucose monitoring, supporting functional graft assessment.
- Operational Value: Facilitates preconditioning and maturation in bioreactors, improving readiness for implantation studies.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted prioritization of graft candidates through measurable recellularization outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a reusable platform for vascular graft development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-scaffold interactions and extracellular matrix integrity using decellularized human veins.
- Screening: Enables standardized recellularization assays with perfusion-defined shear stress and nutrient delivery for reproducible endothelial coverage.
- Analytics: Glucose monitoring and histological staining provide quantitative readouts for metabolic activity and cellular attachment, enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects discovery-phase scaffold optimization to preclinical validation through autologous cell seeding and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating patient-specific vascular grafts across multiple vein types, reducing dependency on custom cell culture.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in graft functionality by demonstrating endothelialization and metabolic activity in recellularized veins.
- Operational Value: Standardizes decellularization and perfusion workflows, improving reproducibility across runs and laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage development by enabling autologous graft testing prior to clinical use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantifiable recellularization metrics and graft patency indicators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, perfusion systems, and sterile cell handling.
- Dependent on bioreactor infrastructure, peristaltic pumps, and controlled incubation environments.
- Necessitates standardization of perfusion parameters, solution formulations, and glucose monitoring protocols.
- Adaptation to other vein types may require optimization of decellularization cycles and recellularization conditions.
- Practical limitations include the 20-day timeline for full processing and the need for aseptic maintenance throughout.
