Name: 人隐静脉的去细胞和 Recellularization 方法学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学习人隐静脉的去细胞化和再细胞化方法，使用Triton-X 100等去污剂进行灌注处理，并通过外周血与内皮培养基实现血管再生。该技术利用简单血液样本即可完成再细胞化，避免侵入性骨髓采集，为组织工程和再生医学提供高效可行的血管支架制备方案。

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我们感谢 Anders Jeppsson 教授在实验所用血管提供方面给予的帮助。本研究由 LUA ALF 拨款资助给 SSH。

本研究所使用的组织及本论文的方案遵循哥德堡大学的伦理准则。
1. 组织制备与保存
<ol>
	<li>使用手术镊和剪刀从获取的大隐静脉上切除周围组织。 
	注意：大隐静脉由血管外科医生从人体下肢分离获得。本文使用的大隐静脉是旁路手术后未使用的部分。</li>
	<li>为防止灌注过程中发生泄漏，使用缝线和镊子在所有侧支血管的末端进行结扎。</li>
	<li>将静脉置于含有 40 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的 50 mL 离心管中。通过更换 PBS 2–3 次清洗静脉，以去除多余血液。将静脉在 -80 °C 冷冻保存。</li>
</ol>
2. 脱细胞支架制备装置与再细胞化生物反应器的准备
注意：使用剪刀按表1所示切割硅胶管。
<ol>
	<li>脱细胞化装置设置 1（用于Triton X-100灌注和洗涤）
	<ol>
		<li>将三段A型管按图示固定在2 L的塑料容器内 图1A. 
		注意：将一根导管固定在侧壁上，使其边缘接触腔室底部（洗涤剂入口），另两根导管固定在相对的侧壁上，两者间距为5–10 cm，具体距离取决于血管长度。这两根导管至少应有5 cm长度同样固定在腔室底部（血管入口和出口）。</li>
		<li>使用公母鲁尔接头，将洗涤剂入口管依次与管B、管F、管C连接，最后连接至静脉入口。将管F放入蠕动泵I的卡槽中。</li>
		<li>取另一根导管C，将其一端连接至静脉出口，另一端放入玻璃罐中，并确保该端位于距腔室45 cm高的底部软管出口处（洗涤剂出口），用胶带固定。取导管G，将其一端插入玻璃罐的软管出口，另一端放入静脉腔室中。 
		注意：完整装置（红色箭头）、腔室及流动方向（白色箭头）的示意图如图所示 图1A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱细胞化装置设置 2（用于 TnBP 灌注）
	<ol>
		<li>取一个1 L玻璃广口瓶，将C管（洗涤剂入口）的一端放入瓶中，直至管子接触瓶底。</li>
		<li>将另一端连接至导管F，再连接导管C。将导管C的另一端插入容器中至一半深度（静脉入口）。将导管F放入蠕动泵I的卡盒中。</li>
		<li>取试管D，将一端插入罐子（静脉出口）至一半深度，另一端插入玻璃罐，底部软管置于距静脉入口（洗涤剂出口）45 cm的高度。用胶带固定洗涤剂的入口和出口管。</li>
		<li>将1 L玻璃烧杯放在磁力搅拌器上，并将磁力搅拌子留在瓶内。</li>
		<li>取试管G，将一端插入玻璃罐的软管出口，另一端放入1 L玻璃罐中。 
		注意：完整的装置示意图（红色箭头）、腔室及流动方向（白色箭头）如图所示 图1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱细胞化装置设置 3（用于 DNase 灌注）
	<ol>
		<li>取一个250 mL玻璃瓶，将C管的两端放入瓶中，并将管的中段置于第二台蠕动泵的泵槽内。 
		注意：管的一端为溶液入口，另一端连接至静脉的入口。静脉的出口则自由地置于溶液中。</li>
		<li>将包括泵在内的整个装置置于37 °C环境中。完整的装置示意图及流体流向如图所示 图1C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再细胞化生物反应器
	<ol>
		<li>准备好如图所示的所有部件 图2A.</li>
		<li>如图所示 图2B，取四口塞，将管H（静脉出口）、管I（培养基入口）和管J（静脉入口）分别插入各端口。将管H的另一端插入4th 端口（培养基出口） 
		注意：从顶部观察的4端口帽示意图如图所示 图2C为便于插入试管，可用剪刀将边缘剪成尖锐的点状。</li>
		<li>将管 J 的另一端弯成 U 形，并用缝线结扎。将减径接头连接至管 H 的内端 &amp;#38; J.</li>
		<li>将带有平底的60 mL离心管放入250 mL玻璃瓶中，然后将上述组装好的装置按图示放入该离心管中 图2D如图所示 图2E将管路K、E和K串联连接。将一根管路K连接至静脉入口，另一根管路K连接至培养基入口。 
		注意：装置的示意图及流体流动方向见于 图 2F.</li>
		<li>通过高压灭菌器对生物反应器进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 溶液的配制
<ol>
	<li>溶液1（10倍水溶液）：向1 L超纯水中加入2 g叠氮化钠和18.6 g乙二胺四乙酸（EDTA），搅拌至盐类完全溶解。</li>
	<li>溶液2（1倍水溶液）：取100 mL溶液1，加入900 mL超纯水。</li>
	<li>溶液3（5倍Triton X-100溶液）：向950 mL超纯水中加入50 mL Triton X-100、1 g叠氮化钠和9.3 g EDTA，搅拌至溶解。</li>
	<li>溶液4（1倍Triton X-100溶液）：取200 mL溶液3，加入800 mL超纯水。</li>
	<li>溶液5（1倍TnBP溶液）：用10 mL移液管将10 mL TnBP加入990 mL溶液2中。</li>
	<li>溶液6（40 Kunitz单位/mL DNase）：将2,000 Kunitz单位的DNaseI加入含CaCl2和MgCl2的50 mL杜氏磷酸盐缓冲液中，现配现用。</li>
	<li>溶液7（PBS）：将24 g氯化钠、0.6 g氯化钾、4.32 g磷酸钠和0.72 g磷酸钾加入3 L超纯水中，搅拌至溶解，调节pH至7.4。将1 L PBS在高压灭菌器中灭菌后单独保存。</li>
	<li>溶液8（0.1%过氧乙酸溶液）：向50 mL无菌溶液7中加入50 µL过氧乙酸，现配现用。</li>
</ol>
4. 内皮细胞培养基的制备
<ol>
	<li>在无菌操作台中，向500 mL MCDB131培养基中加入5 mL L-谷氨酰胺、5 mL 抗-抗（anti-anti）、50 mL 人AB血清，以及EGM-2生长因子试剂盒中的所有组分（胎牛血清除外）。</li>
</ol>
5. 隐静脉的脱细胞处理
<ol>
	<li>将人隐静脉从 -80 °C 取出，在室温下解冻。再次于 -80 °C 冻存，然后在室温下再次解冻。</li>
	<li>使用剪刀切取一段长度为 2 mm 的组织活检样本，并在室温下用甲醛固定 24 - 48 小时。用缝线将静脉两端分别系在公母鲁尔接头的倒刺上。</li>
	<li>将静脉连接至去细胞化装置 1，加入 1 L 溶液 2，以 35 mL/min 的流速灌注 15 分钟。排空装置内容物。</li>
	<li>加入 1 L 溶液 4，以 35 mL/min 的流速灌注 4 小时。排空装置内容物。</li>
	<li>加入 500 mL 溶液 2，以 35 mL/min 的流速灌注 5 分钟。排空装置内容物，重复此步骤一次。将静脉从灌注装置 1 上断开，连接至灌注装置 2。</li>
	<li>加入 1 L 溶液 5，开启搅拌器，以 35 mL/min 的流速灌注 4 小时。 
	注意：溶液 5 在开启搅拌器后及整个灌注过程中呈现浑浊状态。</li>
	<li>将静脉从灌注装置 2 上断开，使用注射器或 10 mL 移液器，以超纯水清洗静脉内外壁，共更换 4 次，每次 5 - 10 分钟。</li>
	<li>将静脉连接至灌注装置 3，加入 50 mL 溶液 6，在 37 °C 恒温箱中以 10 mL/min 的流速灌注 4 小时。排空装置内容物后，将静脉从装置上断开。</li>
	<li>将静脉连接至灌注装置 1，加入 1 L 溶液 2，以 35 mL/min 的流速过夜灌注。重复步骤 5.4 至步骤 5.9 共 4 次（总计完成 5 个循环）。按照步骤 5.2 所述再次取活检样本。 
	注意：在第 1 和第 3 次循环中跳过步骤 5.8 的第二部分。</li>
	<li>排空装置内容物。加入 1 L 溶液 2，以 35 mL/min 的流速灌注 24 小时，12 小时后更换溶液 2。排空装置内容物。加入 1 L 超纯水，以 35 mL/min 的流速灌注 24 小时，12 小时后更换超纯水。排空装置内容物。加入 1 L 溶液 7，以 35 mL/min 的流速灌注 24 小时，12 小时后更换溶液 7。</li>
</ol>
6. 脱细胞效果的验证
<ol>
	<li>将福尔马林固定的活检组织在超纯水中洗涤15分钟。按照标准方案使用组织处理机进行处理，并包埋于石蜡中22。</li>
	<li>使用切片机切取5 µm厚的切片，并按照标准方案用迈耶苏木精和0.2%醇溶伊红（H&amp;#38;E）染色22。</li>
	<li>在显微镜下观察，比较脱细胞组织与正常组织中细胞核的丢失情况。</li>
</ol>
7. 再细胞化
<ol>
	<li>将血管放入含有50 mL溶液8的50 mL离心管中，进行灭菌处理。在摇床中以37 °C、80转/分钟（rpm）的条件振荡1小时。</li>
	<li>此后所有操作均需在层流（LAF）柜中进行，以保持无菌状态。使用无菌镊子将血管转移至含有50 mL无菌溶液7和500 µL抗-抗的新的50 mL离心管中。按上述条件振荡12小时，期间至少更换两次溶液7。</li>
	<li>使用无菌镊子将血管转移至另一个新的50 mL离心管中，加入50 mL内皮细胞培养基。按上述条件振荡11小时。</li>
	<li>在LAF柜内佩戴无菌手套组装生物反应器。使用无菌缝合线和镊子将血管固定在生物反应器的血管入口和出口处。</li>
	<li>将血管连接至生物反应器，并用相同的培养基填充。加入肝素至终浓度为50 IU/mL，在37 °C条件下以2 mL/min流速灌注1小时。</li>
	<li>从供体采集15–25 mL新鲜血液（根据血管长度而定），收集于肝素涂层的真空采血管中，并以1:1比例用Steen溶液稀释。随后加入内分泌腺源性血管内皮生长因子（EG-VEGF，80 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF，4 µL/mL）和乙酰水杨酸（5 µg/mL）。</li>
	<li>将生物反应器转移至37 °C、5% CO2的培养箱中，以2 mL/min流速持续灌注48小时。</li>
	<li>约12小时后，将生物反应器移至LAF柜中，取一滴血液，使用血糖监测仪测量葡萄糖浓度。若葡萄糖水平低于3 mmol/L，则添加葡萄糖使其浓度恢复至7–9 mmol/L。每8–12小时重复此步骤一次。</li>
	<li>48小时后，将生物反应器移入LAF柜中，排出其中的血液。加入30 mL无菌溶液7，灌注5分钟，排尽液体；再次加入30 mL无菌溶液7，灌注5分钟。重复该步骤两次或直至血液的红色完全消失。 
	注意：可取活检以验证细胞附着情况。断开血管连接，用剪刀剪去血管两端各5 mm并弃去。按照步骤5.2所述方法取活检，然后重新将血管连接至生物反应器（可选步骤）。</li>
	<li>加入30–45 mL内皮细胞培养基，在培养箱中以2 mL/min流速灌注96小时。 
	注意：加入内皮细胞培养基直至完全浸没血管。</li>
	<li>将生物反应器移入LAF柜中，断开再细胞化后的血管，用剪刀剪去两端各5 mm并弃去，按照步骤5.2所述方法取活检。</li>
</ol>
8. 再细胞化的验证
<ol>
	<li>按照第6节中的说明进行H&amp;#38;E染色。在显微镜下观察切片，检查是否存在细胞。</li>
</ol>

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SSH 持有 Verigraft 公司的股份，该公司已获得血管组织工程技术的许可。其他作者无任何利益冲突披露。

本文所介绍的隐静脉脱细胞方法是一种简便、经济且易于操作的技术，也可应用于所有小直径静脉，如脐静脉和乳内静脉。本方法中使用的脱细胞溶液及其浓度均基于我们先前的研究结果6,7。尽管我们推荐进行5个循环的脱细胞处理，但在某些静脉中，我们观察到仅需3个循环即可实现完全脱细胞。然而，使用5个循环可获得更稳定且可重复的结果。采用该方案，我们已成功对长达30 cm的不同长度静脉进行了脱细胞处理（未发表结果）。将脱细胞溶液的出口抬高45 cm，可在静脉内部产生约33 mmHg的压力。根据我们的经验，这一步骤是确保静脉在整个长度上均匀且可重复地完成脱细胞的关键。所选压力约为正常隐静脉压力（5–10 mmHg）的3倍，但与功能不全静脉（如静脉曲张）中的压力相当23。此外，我们推测这种较高压力会对静脉壁产生显著作用力，从而有助于更高效、更快速地去除细胞。
由于TnBP是一种有机溶剂且不溶于水，因此将洗涤剂搅拌至浑浊状态非常重要；否则，洗涤剂会漂浮。出于同样原因，为了使TnBP保持在溶液中混合均匀，洗涤剂的出口管被置于玻璃罐顶部，并连接软管出口。通过观察洗涤水中是否残留漂浮的TnBP液滴，可判断每次循环使用后TnBP是否被有效清除。我们还注意到，即使省略DNase步骤，也能获得脱细胞组织，但在少数情况下，脱细胞组织中的DNA含量相对较高。由于DNase活性不需要高压和高流速，因此可采用较低的灌注速率（10 mL/min）。本实验使用了另一种尺寸更小的蠕动泵，便于实验装置的操作。由于我们发现大多数细胞在脱细胞过程的第2个循环中即已受损，因此建议在第1和第3个循环中省略DNase处理步骤（未发表结果）。尽管本文未对细胞外基质蛋白进行表征和定量分析，但我们以往使用类似脱细胞方案的经验表明，组织的生物力学特性、细胞外基质结构及蛋白质得以保留7。虽然我们对这些静脉进行的初步定量实验也得到了类似结果（未发表），但已有发表的研究结果可进一步增强对此结论的信心。
与使用骨髓来源扩增细胞相比，利用血液进行再细胞化是一种更便捷、更简单的方法，因为可以避免长时间的细胞扩增过程、扩增细胞中可能发生的自发突变、手术侵入以及患者不适。已知内皮化也可由循环中的内皮祖细胞（EPCs）实现，因此我们假设，先用血液灌注，再用内皮细胞培养基灌注，足以完成再细胞化。采用类似方法构建的静脉组织的安全性已在临床移植中得到验证：两例因肝外门静脉阻塞而接受此类静脉移植的儿童患者均取得了成功结果7。我们推测，脱细胞细胞外基质中存在的生长因子能够促进循环EPCs从血液中黏附到血管壁上24。按照类似方案对静脉进行再细胞化后发现，管腔内表面存在表达VEGF受体-2和分化簇（CD）14的细胞，而外膜中则可见表达CD45的细胞7。我们还推测，在某些情况下，尤其是使用老年或患病个体的血液时，可能无法观察到连续的内皮层，因为已知这些个体的循环祖细胞数量减少25。然而，我们假设，使用受体自体血液进行灌注可能掩盖因脱细胞处理而暴露的多种抗原，从而在移植后降低发生不良炎症反应的风险，相较于仅移植脱细胞血管更具优势。此外，血液灌注可在管腔和外膜沉积更高水平的生长因子，进而募集更多循环祖细胞，促进体内快速完成再细胞化过程in vivo。
本研究中所用生物反应器设计的优点在于可完全高压灭菌、易于组装、成本低廉、操作简便且损坏可能性最小。根据我们的经验，采用当前设计可实现长达10 cm的静脉再细胞化。尽管通过将静脉以&#34;U&#34;形放置于生物反应器内，也可对长达25 cm的静脉进行再细胞化，但该方法仍需进一步验证。该生物反应器设计使静脉内的流动方向逆于重力，此设计模拟了这些静脉在人体内的正常血流方向。内皮细胞培养基灌注12小时的步骤旨在预处理静脉，提高后续内皮祖细胞（EPCs）黏附的亲和力。额外添加肝素并持续灌注1小时，可降低血液灌注过程中管道内形成血栓的风险。
所需血液体积取决于血管长度。我们遵循的基本原则是，血管应完全浸没在血液中。当处理超过45 mL的血液体积时，可能需要偶尔混匀，以防止细胞在生物反应器底部聚集。我们向血液中添加了Steen溶液，因为它含有大量蛋白质和器官移植过程中维持组织健康所需的成分26,27。添加VEGF和b-FGF是有益的，因为它们是强效的促血管生成生长因子28，其存在可诱导内皮祖细胞（EPCs）的迁移、增殖和分化29,30,31,32。添加VEGF的剂量依据我们此前未发表的结果确定，在80 ng/mL浓度下可观察到EPCs的增殖。添加阿司匹林可抑制血小板活化33，从而降低其附着于内皮层的可能性。持续监测并补充葡萄糖也有助于细胞增殖，并防止红细胞溶血。
由于仅需从受体采集简单的血液样本，因此该操作可被视为一种简便且可行的程序，对技术要求较低。尽管此处展示的整个流程从开始到结束需要20天，但若将脱细胞静脉作为即用型产品储存，则患者的实际操作时间可缩短至8天。虽然从技术上讲，脱细胞静脉的储存不应影响再细胞化的效率，但仍需对其进行评估。通过本流程生成的组织工程静脉可用于临床血管旁路手术，替代阻塞的静脉，治疗因静脉功能不全导致的静脉曲张，且无需免疫抑制治疗，从而为患者提供更高质量的生活。

在动脉瘤、颈动脉狭窄和动脉粥样硬化等导致严重血管问题的临床情况下，需要使用血管通路。外科医生通常采用自体、同种异体或人工合成的血管通路来恢复正常的血液供应。尽管自体血管移植仍被认为是理想方法，但在患者中其可用性受到极大限制。而同种异体或人工合成移植物等替代方案则存在明显的免疫抑制治疗需求和通畅率差的问题，常导致再次手术1,2，给各国带来沉重的医疗经济负担。血管组织工程技术旨在利用具有天然同源性并携带自体细胞的移植物，使受体免疫系统将移植移植物识别为“自身”组织；同时，由于此类移植物含有天然蛋白质和细胞，并保持原有的结构构型，其功能可能优于现有的替代方案。组织工程器官，如膀胱3、尿道4、气管5以及静脉6,7，已在临床中成功应用。
利用组织工程技术制备个性化移植物，需要先获取供体的移植物，随后进行脱细胞处理和再细胞化。脱细胞是一种有前景的技术，可用于去除组织和器官中的细胞8,9,10。脱细胞可通过特定的物理、化学和酶学方法单独或联合实现11。当这些方法得到最佳应用时，脱细胞后的组织可保留与天然组织相似的细胞外基质结构，并含有类似的结构和功能蛋白。此类器官具有内在能力，可促进植入干细胞的黏附、迁移、增殖和分化。
再细胞化是一个将细胞接种到移植物中的动态过程，可用于临床移植的受体干细胞包括骨髓来源、间充质来源以及器官驻留的干细胞3,5,6。动物实验和以研究为目的的研究中已使用来自胎儿组织或诱导多能干细胞来源的间充质干细胞12,13,14。该过程需要生物反应器（一种容纳静脉并提供温度、气体、pH值和压力等必要条件的装置）、细胞以及培养基。再细胞化面临的主要挑战在于获得足够数量的特定类型细胞，并设计一种有效的接种策略，使细胞能够分布至整个组织或器官。尽管迄今为止尚未成功构建并评估出在结构和功能上完全正常的组织或器官，但该领域已取得多项进展，初步结果表明未来具有可行性15。静脉的关键功能依赖于管腔内皮层，后者调控炎性细胞向组织的浸润，以及中层的平滑肌层，该层不仅参与血管收缩，还提供维持血压所需的机械强度16。研究表明，在损伤发生时，内皮化过程可通过吻合处延伸或通过血液中循环的内皮祖细胞（EPCs）实现17,18,19。我们针对静脉再细胞化的策略正是基于血液循环中存在的EPCs。
多个研究团队已采用不同的脱细胞和再细胞化策略，开展了静脉和动脉的组织工程研究20,21。我们团队也针对髂静脉和乳腺静脉开发并实施了脱细胞与再细胞化策略6,7。脱细胞过程通过在Triton X-100、三正丁基磷酸酯（TnBP）和脱氧核糖核酸酶（DNase）中振荡静脉完成。再细胞化则使用骨髓来源的内皮细胞和平滑肌细胞6，或外周血细胞进行7。采用任一方案再细胞化的静脉在临床应用中展现出良好前景，可用于为患有肝外门静脉阻塞的儿科患者提供功能性血液供应6,7。
目前，我们已开发出一种改进版的相同方案，以更高效、简便地实现小直径静脉的脱细胞、再细胞化及生物反应器操作。当前的脱细胞方案需通过压力将去垢剂灌注流经静脉，而非使用去垢剂震荡处理。再细胞化方案则增加了一个预处理步骤，以增强细胞黏附，并在循环血液中添加生长因子，以促进细胞黏附、存活和增殖。我们还利用市售产品优化了生物反应器的设计。本文中，我们详细描述了用于人隐静脉脱细胞与再细胞化的改进方案。

<table><tbody><tr><td>4-端口盖</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>乙酰水杨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>抗-抗试剂</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>血糖监测系统 - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA disodium salt dihydrate）</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 生长因子试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>任何带有 GL45 盖的瓶子均可使用</td></tr><tr><td>1 L 玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>任何带有 GL45 盖的瓶子均可使用</td></tr><tr><td>带底部软管出口的 500 ml 玻璃罐</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>肝素涂层真空采血管</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>人 AB 型血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>内径为 1/8&quot; 的鲁尔雌接头带凸缘</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>适用于 3×5 mm 硅胶管</td></tr><tr><td>内径为 3/32&quot; 的鲁尔雌接头带凸缘</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>适用于 2×4 mm 硅胶管</td></tr><tr><td>内径为 3/32&quot; 的鲁尔雄接头带凸缘</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>适用于 2×4 mm 硅胶管</td></tr><tr><td>内径为 1/8&quot; 的鲁尔雄接头带凸缘</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>适用于 3×5 mm 硅胶管</td></tr><tr><td>内径为 5/32&quot; 的鲁尔雄接头带凸缘</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>适用于 5×8 mm 硅胶管</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>过乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵 I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>用于脱细胞装置 1 和 2。所用卡匣型号为 7519-75</td></tr><tr><td>蠕动泵 II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>用于脱细胞装置 3 和再细胞化生物反应器</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm × 2.5 mm 缩径接头</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen 溶液</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>三正丁基磷酸酯</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>60 ml 带平底试管</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>管 A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>剪取 3 段，每段 25 cm，用于脱细胞灌注装置 1 和 2</td></tr><tr><td>管 B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>剪取 1 段，长度为 35 cm，用于脱细胞灌注装置</td></tr><tr><td>管 C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>剪取 5 段，每段 75 cm，用于脱细胞灌注装置 1–3</td></tr><tr><td>管 D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>剪取 1 段，长度为 90 cm，用于脱细胞灌注装置 2</td></tr><tr><td>管 E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>剪取 1 段，长度为 20 cm，用于再细胞化灌注装置</td></tr><tr><td>管 F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>剪取 2 段，每段 15 cm，用于脱细胞灌注装置 1 和 2</td></tr><tr><td>管 G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>剪取 2 段，每段 60 cm，用于脱细胞灌注装置 1 和 2</td></tr><tr><td>管 H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>剪取 1 段，长度为 15 cm，用于再细胞化灌注装置</td></tr><tr><td>管 I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>剪取 1 段，长度为 20 cm，用于再细胞化灌注装置</td></tr><tr><td>管 J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>剪取 1 段，长度为 25 cm，用于再细胞化灌注装置</td></tr><tr><td>管 K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>剪取 2 段，每段 35 cm，用于再细胞化灌注装置</td></tr></tbody></table>

人脐静脉脱细胞与再细胞化方法

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

在大多数血管手术中使用的血管通路移植物通常为同种异体移植物或合成移植物，常因免疫抑制和通畅性差而引发并发症。组织工程技术提供了一种新颖的解决方案，可通过脱细胞与再细胞化方法，制备含有受体自身细胞、具有天然细胞外基质的个性化移植物。本文展示了一种对人隐静脉进行脱细胞处理，并通过外周血灌注实现再细胞化的详细方法。采用灌注1% Triton X-100、1% 三正丁基磷酸酯（TnBP）和2,000 Kunitz单位脱氧核糖核酸酶（DNase）的方法对隐静脉进行脱细胞处理。Triton X-100和TnBP以35 mL/min流速灌注4小时，DNase在37 °C下以10 mL/min流速灌注4小时。随后，静脉用超纯水和PBS冲洗，并在0.1%过氧乙酸中灭菌。再次用PBS冲洗后，在内皮细胞培养基中进行预处理。将静脉连接至生物反应器，灌注含50 IU/mL肝素的内皮细胞培养基1小时。再细胞化过程通过向生物反应器中加入新鲜血液（以Steen溶液1:1稀释），并添加内分泌腺源性血管内皮生长因子（80 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（4 µL/mL）和乙酰水杨酸（5 µg/mL）来完成。随后将生物反应器转移至培养箱，在维持葡萄糖浓度为3–9 mmol/L的条件下，以2 mL/min流速持续灌注48小时。之后用PBS冲洗静脉，更换为内皮细胞培养基，在培养箱中继续灌注96小时。经Triton X-100、TnBP和DNase处理5个循环后，成功实现隐静脉脱细胞。脱细胞后的静脉呈白色，与正常的及再细胞化的静脉（淡红色）形成明显对比。苏木精 &amp;#38; 伊红（H&amp;#38;E) 染色显示细胞核仅存在于正常静脉中，而不存在于脱细胞静脉中。在再细胞化静脉中，H&amp;#38;E染色显示静脉管腔表面存在细胞。

正常静脉的大体形态呈淡红色（图3A）。随着脱细胞循环次数的增加（第2次循环），红色逐渐消失， 图3B；循环 3， 图3C）以及第5th 周期，它看起来呈苍白白色（图3D）。血液灌注后的再细胞化静脉（图3E）以及内皮培养基灌注（图3F) 呈现亮红色。经过5个循环的脱细胞处理后，静脉中的细胞被成功去除，H&amp;E染色（图4B）可见。相比之下，正常静脉中可见多个细胞核（图4A）。在管腔侧可见附着的细胞，如H&amp;血液灌注48小时后对再细胞化静脉进行伊红染色（图4C，黑色箭头）以及用内皮培养基灌注96小时后（图3D，黑色箭头）。
<img alt="灌注系统示意图，包含蠕动泵、静脉腔室、管路流动；用于流体动力学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：脱细胞化灌注装置的组装。 A) 图中显示了用于Triton X-100处理及洗涤的脱细胞化装置1的组装情况。白色箭头表示溶液的流动路径，红色箭头指示静脉和溶液的入口与出口。 B) 图中显示了用于TnBP灌注的脱细胞化装置2的组装情况。与脱细胞化装置1类似，白色箭头表示溶液的流动路径，红色箭头指示静脉和溶液的入口与出口。 C) 图中显示了用于脱氧核糖核酸酶灌注的脱细胞化装置3的组装情况。白色箭头表示溶液的流动路径，红色箭头指示静脉和溶液的入口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有管路、连接件和瓶子的蠕动泵装置；培养基流动过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2： 再细胞化生物反应器的准备与组装。A) 显示组装生物反应器所需的材料。 B) 四通盖内部照片，显示减径接头的位置（红色箭头）、静脉入口和出口的连接点（白色箭头）以及管路H、I和J的排列方式。管路H的自由端插入生物反应器中以回输培养基。 C) 从四通盖顶部可看到相应进出管路的布局。 D) 显示已组装好的生物反应器的照片。 E) 显示包含蠕动泵在内的完整生物反应器系统。管路K将生物反应器与蠕动泵连接起来。 F) 整个生物反应器灌注系统的示意图。橙色箭头表示流动方向。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织工程过程；支架制备阶段；脱细胞化实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：静脉在脱细胞化和再细胞化过程中的大体形态。 A) 正常静脉的大体形态呈鲜红色。随着脱细胞化循环次数的增加，颜色逐渐丧失，B) 第2次循环和C) 第3次循环后可见明显褪色。D) 经过5次循环后，静脉呈现苍白白色。静脉经E)血液灌注48小时和F)内皮培养基灌注96小时后，颜色再次恢复为鲜红色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学分析，胶原纤维，动脉壁，显微镜检查，层状结构，染色实验" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4: 脱细胞与再细胞化静脉的表征 苏木精和伊红染色图像 A) 正常静脉含有许多蓝色细胞核，但这些细胞核在 B) 脱细胞静脉。在用细胞重新接种的静脉中 C) 血液孵育 48 小时，并与 D) 内皮培养基中培养96小时后，可见细胞（黑色箭头）附着于管腔。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用去污剂对隐静脉进行脱细胞处理，并通过外周血和内皮培养基灌注实现再细胞化的实验方案。

在大多数血管手术中使用的血管通路材料为同种异体或合成移植物，这些材料常因免疫抑制及相关并发症而引发问题。

本方法详细阐述了隐静脉组织工程的操作流程。我们还展示了如何使用简单的设备制备脱细胞装置以及用于再细胞化的生物反应器。该技术的主要优势在于再细胞化仅需少量血液样本，从而避免了痛苦的骨髓采集过程以及耗时的细胞培养步骤。对于Triton-X 100的灌注和洗涤，准备去细胞化装置一。将三段A管用胶带固定在一个两升的容器内。将其中一段管子固定在容器壁上，使其边缘接触容器底部，作为去垢剂的入口。将另外两段管子固定在相对的容器壁上，彼此间距为5至10厘米，具体距离取决于静脉的长度。这些管子至少应有五厘米用胶带固定在腔室的底部。使用公母接头将洗涤剂的进液管连接到管 B。然后将管 B 连接到管 F，再将管 F 连接到管 C。最后将管 C 连接到静脉进液口。现在，将 F 管放入蠕动泵的卡槽中。取另一根 C 管，将其一端连接到静脉的出口，另一端放入一个带有底部软管出口且置于腔室上方 45 厘米处的玻璃罐中，并用胶带固定。这用作洗涤剂出口。然后，将管 G 的一端插入玻璃罐软管出口，另一端放入静脉腔。接下来，按照文本方案中的说明，准备用于 TnBP 灌注的脱细胞装置二。同时按照文中所述准备用于DNA灌注的去细胞化装置三，并置于37摄氏度环境中。为准备再细胞化生物反应器，将管H插入四口盖的一个接口中，作为静脉出口；将管I插入第二个接口中，作为培养基入口。将管 J 插入第三个端口，作为静脉的入口。接下来，将管 H 的另一端插入第四个端口，作为培养基的出口。将减径接头连接至管 H 和管 J 的内端。将管 J 的另一端弯成 U 形，并用缝合线扎紧。现在，将一个带有平底的60毫升离心管放入250毫升的玻璃杯中。接着，将一根K管的一端连接到静脉入口，另一端连接到E管。将E管再连接到第二根K管，然后连接至培养基入口。随后，将准备好的帽组件放入瓶中的离心管内。最后，通过高压灭菌对生物反应器进行灭菌。在剪取一段长度为两毫米的活检组织前，按照文本方案中所述，对人隐静脉进行两次冻融循环处理。将活检组织在室温下用甲醛固定24至48小时。用缝线将静脉的每一端分别系在公母引线连接器的倒钩上。将静脉连接至脱细胞装置一，并向腔室内加入一升溶液二。随后，在35毫升/分钟的流速下灌注15分钟，然后排空装置中的内容物。然后，加入一升溶液四，以每分钟35毫升的速度灌注四小时。倒空内容物，加入500毫升溶液二，灌注五分钟，再次倒空内容物。将静脉从灌注装置一上断开，并连接至灌注装置二。接下来，加入一升溶液五，开启搅拌器，并以每分钟35毫升的流速灌注四小时。将静脉从灌注装置二上断开，用20毫升超纯水冲洗静脉外壁两次。然后使用注射器用20毫升超纯水冲洗静脉内壁两次，每次持续五到十分钟。按照文本方案中所述使用灌注装置三进行灌注后，将静脉连接至灌注装置一。加入一升溶液二，以每分钟35毫升的速度过夜灌注。重复灌注过程四次，以彻底清除核物质。灌注完成后，排空装置，加入一升溶液二，并以每分钟35毫升的速度持续灌注24小时。24小时后，再次排空装置，加入一升超纯水，以每分钟35毫升的速度继续灌注24小时。最后，在相同条件下重复灌注，但使用溶液七。按照文本方案中所述验证脱细胞效果后，将静脉置于含有50毫升溶液八的50毫升离心管中进行灭菌处理。在37摄氏度下，以每分钟80转的速度在摇床中振荡一小时。在超净工作台中操作以保持无菌状态，现在使用无菌镊子将无菌血管转移至一个新的50毫升离心管中，管内含有50毫升无菌溶液七，其中包含500微升抗抗。如前所述振荡血管12小时，期间至少更换两次溶液七。使用无菌镊子将血管转移至另一个新的50毫升离心管中，加入50毫升内皮细胞培养基，并振荡11小时。现在，使用无菌缝合线和镊子将血管连接到生物反应器的血管入口和出口，并将瓶盖组件拧紧至250毫升瓶上。用相同的内皮细胞培养基填充生物反应器。加入肝素至终浓度为每毫升50单位，在培养箱中以每分钟2毫升的速度灌注一小时。在肝素涂层的真空采血管中采集供体15至25毫升新鲜血液，并用Steen溶液以1:1比例稀释。随后，加入内分泌腺来源的血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及微量水杨酸。将生物反应器中的内皮培养基移除后，将血液加入其中，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中以每分钟2毫升的速度灌注48小时。约12小时后，在超净工作台中操作，从生物反应器中取出一滴血液，使用血糖监测仪测量葡萄糖浓度。如果浓度低于3毫摩尔/升，则添加葡萄糖，使其浓度升至7至9毫摩尔/升范围内。重新放入培养箱中48小时后，在超净工作台中将生物反应器中的血液排出。加入30毫升无菌溶液七，灌注5分钟，然后排出溶液。重复此步骤直至血液的红色消失。最后，加入30至45毫升内皮细胞培养基，在培养箱中以每分钟2毫升的速度灌注96小时。在超净工作台中将再细胞化的静脉从生物反应器上断开，用剪刀剪去静脉两端各5毫米的边缘并弃去。按照之前的方法取活检样本，置于甲醛中，并按照文本方案所述进行再细胞化验证。正常静脉的大体形态呈鲜红色。随着脱细胞处理循环次数的增加，红色逐渐消失，经过五次处理循环后，血管呈现苍白白色。通过外周血和内皮培养基灌注重新接种细胞的静脉再次呈现鲜红色。图中显示的是正常静脉的代表性苏木精-伊红染色图像，可见大量蓝色细胞核。然而，在脱细胞静脉的苏木精和伊红染色中未观察到蓝色的细胞核。在用血液和内皮培养基灌注的再细胞化静脉中，苏木精和伊红染色显示管腔内存在细胞黏附。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用去污剂对大隐静脉进行脱细胞处理，以及如何使用外周血和内皮培养基进行再细胞化。采用Triton-X 100、TnBP和DNA在压力下灌注进行脱细胞的技术，成功且可重复地去除了人隐静脉中的细胞核。尽管该技术需要20天才能完成，但将脱细胞静脉作为即用型产品储存后，可将操作时间缩短至8天。使用受体外周血对静脉进行再细胞化可能具有临床相关性。采用类似方案重新细胞化的静脉在临床移植中展现出良好前景，术后可提供功能性血液供应。经过轻微修改，该方案可适用于任何类型的静脉，并可作为个性化移植物用于所有血管外科手术的临床应用。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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学习人隐静脉的去细胞化和再细胞化方法，使用Triton-X 100等去污剂进行灌注处理，并通过外周血与内皮培养基实现血管再生。该技术利用简单血液样本即可完成再细胞化，避免侵入性骨髓采集，为组织工程和再生医学提供高效可行的血管支架制备方案。

人脐静脉脱细胞与再细胞化方法

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