人网膜和皮下脂肪组织 CD34+CD31+ 内皮细胞的分离、扩增和脂肪诱导
2018年7月17日
脂肪组织血管祖细胞中白、米色脂肪体的分化具有改善肥胖代谢的潜力。我们描述了 CD34+CD31+ 内皮细胞与人的脂肪分离的协议, 并为随后的体外扩增和分化为白色和米色脂肪。讨论了几种下游应用。
这种方法可以帮助回答肥胖领域的关键问题，例如确定在脂肪组织重塑过程中阻止强烈脂肪生成反应的关键因素和机制。该技术的主要优点是它允许从少量组织开始从人脂肪组织中分离 CD34+CD31+内皮细胞。当我们想要识别人类脂肪脉管系统中对成脂刺激做出反应的细胞时，我们第一次想到了这种方法。
这种方法的视觉演示至关重要，因为由于通常无法获得新鲜的人体脂肪组织，因此很难进行细胞分离步骤。从接受减肥手术的人类受试者中收集人网膜和皮下脂肪组织。组织提取后，立即将人网膜和皮下脂肪组织保存在单独的小瓶中，小瓶中含有 Hank 缓冲盐溶液和每毫升 50 微克青霉素链霉素，在室温下。
组织提取后样品到达实验室后，使用 70% 乙醇拭子剪刀和镊子仔细清洁并去除组织的纤维化和烧灼部分。称量脂肪组织并将其分成 5 克等分试样以供胶原酶消化。在室温下，用两把剪刀将 5 克脂肪组织在 5 毫升胶原酶溶液中细碎。
在切碎的组织中再加入 10 毫升胶原酶溶液，总共 15 毫升。将样品在 37 摄氏度下在水浴中连续振荡 1 小时。消化后，将样品倒入 20 毫升平头注射器中。
将样品通过 250 微米尼龙网过滤到 50 mL 锥形管中，以将脂肪细胞和基质血管细胞与未消化的组织分离。用 10 ml KRBBS 洗净闪烁瓶，将洗液倒入过滤器以收集残留细胞，然后将过滤后的样品在室温下孵育 5 分钟。然后，使用 20 毫升注射器和 20 号 x 6 英寸的移液针头去除基质血管部分层并将其转移到干净的 50 毫升锥形管中。
加入 10 mL KRBBS，让样品在室温下在工作台上放置 5 分钟。将来自两个仓库的基质血管部分保存在冰上以供进一步处理。在 4 摄氏度下以 500 倍 G 旋转基质血管组分 5 分钟。
从离心机中取出样品，小心地倒出上清液，保持沉淀含有基质血管组分细胞。轻轻地将细胞沉淀重悬于 5 ml PBS 中。再次离心样品后，去除上清液，将细胞重悬于一毫升 PBS 中，并对细胞进行计数。
第三次沉淀样品，并将沉淀重悬于 100 μL CD34 分离缓冲液中。加入 10 μL CD34 混合物，在室温下孵育样品 15 分钟。然后加入 5 μL 磁珠，并在室温下孵育样品 10 分钟。
接下来，向每个样品中加入 2.5 mL CD34 分离缓冲液，并将样品放入磁力架中，在室温下放置 5 分钟。将磁力架倒置 5 秒钟，以倒出隔离缓冲液。重复此过程四次后，从磁力架中取出试管并加入 2 毫升 CD34 分离缓冲液。
再次离心后，将 CD34 + 细胞沉淀重悬于 1 mL CD34 分离缓冲液中，并对细胞进行计数。再次沉淀细胞，并将沉淀重悬于 250 μL 缓冲液 B 和 250 μL 洗涤缓冲液中。接下来，通过涡旋试管彻底重悬 CD31 珠子，然后将 20 μL CD31 珠子添加到重悬的细胞沉淀中，并在室温下摇动孵育样品 30 分钟。
在细胞分离之前，加入 1 mL 洗涤缓冲液以平衡过滤器。然后，将 CD31 珠子中制备的重悬细胞混合物涂在过滤器上。用 5 毫升洗涤缓冲液以圆周运动洗涤过滤器，总体积为 20 毫升。
将连接器连接到无菌的 50 ml 锥形管上，然后关闭 leur 锁。将过滤器连接到连接器后，沿过滤器壁添加 1 毫升洗涤缓冲液，然后沿过滤器壁添加 1 毫升活化缓冲液 D。轻轻旋转样品，并在室温下孵育 10 分钟。
接下来，加入 1 毫升洗涤缓冲液，上下吹打 10 次，将细胞与磁珠分离。打开 leur 锁，让分离的细胞流入 50 毫升锥形管。每次用 1 毫升洗涤缓冲液洗涤过滤器 10 次。
丢弃连接器和过滤器，将样品在 4 摄氏度下以 300 倍 G 离心 10 分钟。最后，将细胞沉淀重悬于 2 毫升完全 EGM2 培养基中进行培养。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中，用完整的 EGM2 培养基在六孔组织培养板中培养细胞。
每 3 到 4 天更换一次培养基，直到细胞达到 80% 至 90% 汇合。然后，将大约 100 到 200,000 个细胞接种到 6 孔板中，确保每个仓库都有重复的孔，并在完全 EGM2 培养基中培养两天。两天后，吸出所有生长培养基。
用 2 毫升含 5% FBS 的 DMEM/F-12 培养基和每毫升 50 微克青霉素链霉素替换培养基，用于对照细胞。对于处理细胞，用两毫升脂肪生成培养基替换培养基。将细胞在 37 摄氏度下在加湿的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 13 天，每 3 到 4 天更换一次相应的培养基。
代表性结果显示 CD34 + CD31 + 细胞在培养两次传代后的典型内皮鹅卵石状形态。还证明了细胞在如 预期的那样在 Matrigel 中培养时形成小管的能力。荧光标记的乙酰化 LDL 的均匀摄取表明存在具有内皮身份的同质细胞群。
此处显示的是成脂诱导 13 天后 CD34+CD31+细胞中中性脂滴的油红 O 染色。来自三个不同人类受试者的网膜和皮下贮库的细胞的代表性反应显示，说明了同一供体的脂肪库之间和供体之间对脂肪生成诱导的反应的巨大可变性。该图像显示了成脂诱导 13 天后 CD34+C31+细胞的荧光细胞内脂质染色。
该图像显示了具有单房脂质、多房脂质和无脂质积累的细胞。实时 PCR 显示泛脂肪细胞标志物脂联素和棕色米色标志物 CIDEA 和 UCP-1 的表达。这些结果证实，成脂诱导后的细胞表达与混合白色米色脂肪细胞表型一致的分子标志物。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住使用收集且储存时间不超过两个小时的新鲜人体脂肪组织。在此程序之后，可以进行其他方法，如流式细胞术、免疫组织化学和 RT-PCR，以识别反应细胞的特定亚群，以及可用于识别米色棕色脂肪细胞表型的成熟脂肪细胞标志物的表达。
经过开发，这项技术为肥胖领域的研究人员探索脂肪组织、血管细胞和脂肪生成在人类中的作用铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何分离、培养和扩增 CD34+31+ 细胞有了很好的了解。不要忘记，与人体组织一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如生物安全法规。
这项技术的影响延伸到治疗肥胖相关的合并症，例如胰岛素抵抗，因为它确定了细胞对潜在治疗干预的成脂反应。
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概述
本文讨论了一种从人体脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞的方法，这些细胞可以分化成白色和米色脂肪细胞。这种技术对于理解肥胖和脂肪组织重塑具有重要意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 代谢
背景
- 肥胖与功能失调的脂肪组织有关。
- 了解脂肪细胞分化对代谢健康至关重要。
- CD34+CD31+内皮细胞在脂肪组织动态中起作用。
- 获取新鲜的人体脂肪组织通常受到限制。
研究目的
- 从人体脂肪组织中分离内皮细胞。
- 将这些细胞分化为白色和米色脂肪细胞。
- 探索影响脂肪生成反应的机制。
使用的方法
- 收集人体网膜和皮下脂肪组织。
- 分离CD34+CD31+内皮细胞。
- 分离细胞的体外扩增。
- 细胞分化为脂肪细胞类型。
主要结果
- 成功从小组织样本中分离出内皮细胞。
- 证明了分化为白色和米色脂肪细胞的能力。
- 识别了影响脂肪生成反应的因素。
- 提供了细胞分离的视觉协议。
结论
- 该方法增强了对脂肪组织生物学的理解。
- 它为研究肥胖相关机制提供了实用的方法。
- 未来的应用可能改善代谢干预。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to interrogate adipogenic mechanisms in human adipose endothelial cells, supporting target validation for obesity therapeutics. By isolating CD34+CD31+ cells from small tissue biopsies, it provides a disease-relevant system for screening compounds that modulate white or beige adipocyte differentiation. The approach facilitates mechanistic de-risking and predictive confidence in preclinical models of adipose tissue remodeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipogenic pathways in human endothelial progenitors to validate therapeutic targets for obesity.
- Operational Value: Provides a reproducible cellular model from subcutaneous adipose tissue for target hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated endothelial cells for screening compounds that enhance adipogenic responses toward white or beige phenotypes.
- Operational Value: Supports assay standardization using cryopreserved cells passaged up to P5-P6 with retained adipogenic capacity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables donor-matched comparison of omental and subcutaneous depot responses to adipogenic induction for predictive modeling.
- Operational Value: Provides a translational biomarker-aligned system via adiponectin, CIDEA, and UCP-1 expression profiling post-differentiation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation by providing a human-relevant endothelial cell model for adipogenesis screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on factors preventing robust adipogenic response during adipose tissue remodeling.
- Screening: Enables compound screening for adipogenic induction using Oil Red O staining and fluorescent lipid uptake as quantitative readouts.
- Analytics: Delivers measurable outputs including lipid accumulation, tubule formation in Matrigel, and endothelial marker validation via acetylated LDL uptake.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through depot-specific response variability and molecular marker expression consistent with mixed white-beige phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for isolating endothelial cells from small subcutaneous biopsies across multiple donors and depots.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in adipogenic mechanism de-risking through human cell-based modeling of obesity-related tissue remodeling.
- Operational Value: Standardized isolation from as little as 2–3 g of tissue with expansion over 10–14 days and cryopreservation capability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying non-responder subjects for clinical trials targeting beige/brown adipocyte stimulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on depot-specific adipogenic response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, immunoseparation, and endothelial cell culture techniques.
- Dependent on access to fresh human adipose tissue collected during bariatric surgery and processed within two hours.
- Necessitates collagenase digestion, magnetic bead separation, and sterile filtration equipment for stromal vascular fraction processing.
- Requires adaptation considerations when applying the protocol to different adipose depots or donor variability in adipogenic response.
- Limited by the need for enzymatic digestion and multi-step separation, which may affect scalability for high-throughput screening without automation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Adipose Stromal Vascular Fraction Isolation
3:07
Isolation of Adipose Tissue Endothelial Cells
6:08
Induction of Adipogenesis in Isolated Endothelial Cells
7:13
Results: CD31+CD34+ have Endothelial Phenotype and Display Depot- and Subject-specific Responses to Adipogenic Induction
8:57
Conclusion
