从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

该方法有助于回答肥胖研究领域中的关键问题，例如识别在脂肪组织重塑过程中阻碍有效脂肪生成反应的关键因素和机制。该技术的主要优势在于，可以从少量人脂肪组织样本中分离出 CD34+CD31+ 内皮细胞。我们最初提出该方法的设想，是希望鉴定人脂肪组织血管系统中能够响应脂肪生成刺激的细胞类型。

该方法的可视化演示至关重要，因为细胞分离步骤在实践中往往难以操作，原因在于新鲜人体脂肪组织的获取机会通常有限。从接受减重手术的人类受试者中采集人体大网膜和皮下脂肪组织。在组织取出后立即分别置于含有青霉素-链霉素（50 微克/毫升）的 Hank's 平衡盐溶液的容器中，并在室温下保存。

组织提取后样本送达实验室时，使用经70%乙醇擦拭的剪刀和镊子仔细清理并去除组织中的纤维化和烧灼部分。称量脂肪组织，并将其分装为每份五克，用于胶原酶消化。取五克脂肪组织置于闪烁瓶中，加入五毫升胶原酶溶液，在室温下使用两把剪刀将其充分剪碎。

向切碎的组织中再加入 10 毫升胶原酶溶液，使总体积达到 15 毫升。将样品在 37 摄氏度水浴中消化 1 小时，期间持续振荡。消化完成后，将样品倒入 20 毫升钝端注射器中。

使用250微米尼龙滤网将样品过滤至50毫升锥形管中，以分离脂肪细胞和基质血管细胞与未消化的组织。用10毫升KRBBS冲洗闪烁瓶，并将洗涤液倒入滤网中以收集残留细胞，随后将过滤后的样品在室温下孵育5分钟。然后，使用20毫升注射器和20号6英寸移液针去除基质血管组分层，并将其转移至洁净的50毫升锥形管中。

加入 10 毫升 KRBBS，将样品在室温下静置五分钟。将两个脂肪库的基质血管组分置于冰上以备后续处理。在 4 摄氏度下以 500 × g 离心五分钟。

从离心机中取出样品，小心倒掉上清液，保留含有基质血管组分细胞的沉淀。用 5 毫升 PBS 轻柔重悬细胞沉淀。再次离心后，弃去上清液，用 1 毫升 PBS 重悬细胞，并进行细胞计数。

第三次离心收集样品，将沉淀重悬于100微升CD34分离缓冲液中。加入10微升CD34抗体混合物，在室温下孵育15分钟。然后加入5微升磁珠，在室温下继续孵育10分钟。

接下来，向每个样本中加入 2.5 毫升 CD34 分离缓冲液，并将样本置于磁力架上，室温孵育五分钟。将磁力架倒置五秒钟，弃去分离缓冲液。重复此步骤四次后，从磁力架上取下离心管，加入两毫升 CD34 分离缓冲液。

经过另一次离心后，将 CD34+ 细胞沉淀重悬于 1 毫升 CD34 分离缓冲液中，并对细胞进行计数。再次离心收集细胞沉淀，将其重悬于 250 微升缓冲液 B 和 250 微升洗涤缓冲液中。接下来，通过涡旋充分重悬 CD31 磁珠，然后向重悬的细胞沉淀中加入 20 微升 CD31 磁珠，并在室温下轻轻摇动孵育 30 分钟。

在细胞分离之前，加入一毫升洗涤缓冲液以平衡滤网。然后，将重悬于CD31磁珠中的细胞混合液加入滤网中。以五毫升洗涤缓冲液沿螺旋方向洗涤滤网，共洗涤至总体积为20毫升。

将连接器连接至一个无菌的50毫升锥形管，并关闭鲁尔锁。将滤网连接至连接器后，沿滤网内壁加入1毫升洗涤缓冲液，然后沿滤网内壁加入1毫升活化缓冲液D。轻轻旋转混匀样品，在室温下孵育10分钟。

接着，加入一毫升洗涤缓冲液，通过上下吹打10次将细胞从磁珠上分离。打开鲁尔锁，使脱离的细胞流入50毫升锥形管中。每次用一毫升洗涤缓冲液冲洗滤网，重复10次。

弃去连接器和滤网，将样品在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。最后，用 2 毫升完全 EGM2 培养基重悬细胞沉淀用于培养。将细胞接种于六孔组织培养板中，加入完全 EGM2 培养基，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中培养。

每三到四天更换一次培养基，直到细胞达到 80% 至 90% 的融合度。然后将约 10 万至 20 万个细胞接种到六孔板中，确保每个组织来源设置复孔，并在完全 EGM2 培养基中培养两天。两天后，吸去所有生长培养基。

对于对照细胞，更换为含有5% FBS和50微克/毫升青霉素-链霉素的2毫升DMEM/F-12培养基。对于处理组细胞，更换为2毫升成脂诱导培养基。将细胞在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养13天，每3至4天更换相应的培养基。

代表性结果展示了CD34+CD31+细胞在体外培养传代两次后典型的内皮细胞铺路石样形态。同时显示，这些细胞在Matrigel中培养时能够形成管状结构，符合预期。对荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（acetylated LDL）的均匀摄取表明，该细胞群体具有均一的内皮细胞特性。

图中显示了 CD34+CD31+ 细胞在脂肪生成诱导 13 天后中性脂滴的油红 O 染色结果。展示了来自三位不同人类受试者的大网膜和皮下脂肪库细胞的代表性反应，用以说明同一供体不同脂肪库之间以及不同供体之间的脂肪生成诱导反应存在显著差异。该图像显示了 CD34+CD31+ 细胞经 13 天脂肪生成诱导后的细胞内荧光脂质染色情况。

图像显示了含有单房脂滴、多房脂滴以及无脂质积聚的细胞。实时PCR结果显示泛脂肪细胞标志物脂联素以及棕色/米色脂肪标志物CIDEA和UCP-1的表达。这些结果证实，经脂肪生成诱导后的细胞表达出与白色/米色混合型脂肪细胞表型一致的分子标志物。

熟练掌握后，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行此操作时，务必注意使用新鲜的人类脂肪组织，且采集后存放时间不得超过两小时。完成该操作后，可进一步采用流式细胞术、免疫组织化学以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等方法，鉴定发生响应的细胞亚群，以及成熟脂肪细胞标志物的表达情况，从而用于识别米色或棕色脂肪细胞表型。

该技术建立后，为肥胖研究领域的科研人员探索人类脂肪组织、血管细胞以及脂肪生成的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离、培养和扩增CD34+31+细胞。请务必注意，操作人体组织具有极高的危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取适当的预防措施，例如遵守生物安全规范。

该技术的应用意义延伸至与肥胖相关的共病（如胰岛素抵抗）的治疗，因为它能够识别细胞对潜在治疗干预的成脂反应。