Name: 人网膜和皮下脂肪组织 CD34+CD31+ 内皮细胞的分离、扩增和脂肪诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解从人网膜和皮下脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞的方法，并学习将其诱导分化为白色和米色脂肪细胞的技术。该方法有助于研究肥胖及脂肪组织重塑机制。

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作者希望感谢Sentara减重中心的临床协调员Becky Marquez，她在患者筛选和知情同意过程中提供了帮助。本研究由Anca D. Dobrian获得R15HL114062基金支持。

东弗吉尼亚医学院的机构审查委员会批准了本研究及所用人体脂肪组织样本的采集。已从患者处获得知情书面同意。
1. 缓冲液、培养基和仪器的准备
<ol>
	<li>配制克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBBS）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1 mM 腺苷、0.01% 抗生素/抗真菌素混合液（含青霉素 50 µg/mL、链霉素 50 µg/mL、庆大霉素 30 µg/mL、两性霉素 15 ng/mL）以及 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液每次组织采集和消化前均需新鲜配制。</li>
	<li>配制新鲜的胶原酶溶液：将 1 型胶原酶以 1 mg/mL 的浓度溶于 KRBSS 中，每克脂肪组织使用 3 mL。在组织消化前，将胶原酶溶液置于 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>配制 CD34 细胞分离缓冲液：在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 2% 胎牛血清（FBS）和 1 mM EDTA。</li>
	<li>配制脂肪生成培养基：DMEM/F12 培养基，添加 5% FBS、50 µg/mL 青霉素/链霉素、1.25 µL/mL 人胰岛素（终浓度为 5 µg/mL 或 144 mU/mL）以及 0.36 µL/mL 的 2.8 mM 罗格列酮溶液（终浓度为 1 µM）。</li>
	<li>配制 0.3% 油红 O（ORO）储备液（质量/体积）：将 0.3 g 油红 O 溶解于 100 mL 异丙醇中。</li>
</ol>
2. 脂肪基质血管组分的分离
注意：本研究纳入了一组在Sentara代谢与减重手术中心（Sentara医疗集团，弗吉尼亚州诺福克）接受减重手术的重度肥胖2型糖尿病（T2D）及非糖尿病受试者，年龄为18–65岁。排除标准包括自身免疫性疾病（如1型糖尿病）、需要长期免疫抑制治疗的疾病、使用抗炎药物或噻唑烷二酮类药物、正在吸烟、慢性或急性感染，以及在过去12个月内接受过恶性肿瘤治疗的病史。2型糖尿病的诊断标准为：空腹血浆葡萄糖≥126 mg/dL，口服2小时葡萄糖耐量试验后血糖≥200 mg/dL，或正在使用降糖药物。
<ol>
	<li>从接受减重手术的人类受试者中采集大网膜（OM）和皮下（SC）脂肪组织（AT）。</li>
	<li>组织取出后，立即将OM和SC脂肪组织分别置于含有50 µg/mL青霉素/链霉素的Hank's平衡盐溶液中的离心管内，并在室温下保存。</li>
	<li>样本送达实验室后，使用经70%乙醇擦拭过的剪刀和镊子仔细清理并去除组织中的纤维化和烧灼部分。</li>
	<li>称量脂肪组织，并将其分割为每份5 g（或更少）的等分试样，用于胶原酶消化。</li>
	<li>在室温下，使用两把剪刀将5 g脂肪组织在5 mL胶原酶溶液中精细剪碎，置于闪烁瓶中。</li>
	<li>向剪碎的组织中再加入10 mL胶原酶溶液，使总体积达到15 mL。</li>
	<li>将样品在37 °C水浴中持续振荡消化1小时。</li>
	<li>剪掉20 mL注射器的尖端，制成钝端。</li>
	<li>从250 µm孔径的筛网中裁剪一块9 cm × 9 cm的正方形，用钝端注射器将其推入50 mL锥形管中约一半深度。</li>
	<li>将样品倒入20 mL钝端注射器中，通过250 µm尼龙筛网过滤至50 mL锥形管中，以分离脂肪细胞和基质血管细胞与未消化的组织。 
	注意：每个50 mL锥形管中使用的脂肪组织不得超过5 g，否则由于过量未消化的纤维化物质会导致筛网堵塞。</li>
	<li>用10 mL KRBBS冲洗闪烁瓶，并将冲洗液通过滤网倒入锥形管，以收集残留细胞。</li>
	<li>将过滤后的样品在室温下静置孵育5分钟。 
	注意：此步骤至关重要，可使脂肪细胞上浮至管顶，部分基质血管细胞沉降至管底。</li>
	<li>使用20 mL注射器和20 G × 6 in移液针吸取基质血管组分层，并转移至洁净的50 mL锥形管中。</li>
	<li>加入10 mL KRBBS，在室温下静置5分钟。</li>
	<li>重复步骤2.12–2.14两次。 
	注意：这些步骤可确保基质血管细胞中无漂浮脂肪细胞的污染。</li>
	<li>将两个部位来源的基质血管组分置于冰上，用于后续处理，具体步骤如下所述。 
	注意：细胞在冰上放置时间不得超过1小时，以免影响细胞活力。脂肪细胞可立即用于实验或在液氮中速冻以长期保存。</li>
</ol>
3. 脂肪组织内皮细胞的分离
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心基质血管组分（SVF）5 分钟。</li>
	<li>从离心机中取出样品，小心倾倒上清液；保留含有 SVF 细胞的沉淀。</li>
	<li>用 5 mL PBS 轻柔重悬细胞沉淀。 
	注意：如果处理的脂肪库（AT depot）超过 5 g 并分装成多个等份（参见步骤 2.4），则需将所有细胞沉淀合并。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心样品 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL PBS 中并进行细胞计数。 
	注意：此处使用自动细胞计数仪进行细胞计数。通过将 12 µL 细胞悬液与 12 µL 蒽啶橙/碘化丙啶（AO/PI）溶液混合（参见材料表）测定细胞活力。各脂肪库每克 AT 的平均细胞数为：(a) 大网膜（OM）库：1.69 × 105 ± 4.51 × 104；(b) 皮下（SC）库：1.24 × 105 ± 6.45 × 104。两个脂肪库来源细胞的活力均 >90%。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心样品 5 分钟。 
	注意：步骤 3.7–3.15 采用 CD34 免疫磁珠分离方案（参见材料表）。</li>
	<li>将沉淀重悬于 100 µL CD34 分离缓冲液中。 
	注意：根据总细胞数确定所需重悬体积：(a) <2 × 107 个细胞：将沉淀重悬于 100 µL 中；(b) 2 × 108–5 × 108 个细胞：将沉淀重悬于 1 mL 中。在步骤 3.9–3.16 中，对于 <2 × 107 个细胞的情况，所用试剂体积相应缩小。</li>
	<li>加入 10 µL CD34 混合液，在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 5 µL 磁珠，在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入 2.5 mL CD34 分离缓冲液，将样品置于磁架上放置 5 分钟，室温操作。</li>
	<li>将磁架倒置 5 秒，倒掉分离缓冲液。</li>
	<li>从磁架上取下样品，重复步骤 3.10 和 3.11 四次。</li>
	<li>将试管从磁架上取下，加入 2 mL CD34 分离缓冲液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心细胞 5 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 1 mL CD34 分离缓冲液中并进行细胞计数。 
	注意：此时每克 AT 的平均细胞数为：(a) OM 库：4.75 × 104 ± 3.36 × 104；(b) SC 库：1.06 × 104 ± 9.53 × 103。步骤 3.16–3.34 采用 CD31 塑料免疫珠分离方案（参见材料表）。</li>
	<li>以 500 × g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于 250 µL Buffer B 和 250 µL 洗涤缓冲液中。</li>
	<li>通过涡旋充分重悬 CD31 珠子。</li>
	<li>加入 20 µL CD31 珠子。 
	注意：由于总细胞数 >1 × 106，根据制造商建议调整了使用体积。</li>
	<li>在室温下轻轻摇动孵育 30 分钟。</li>
	<li>将滤器连接至无菌 50 mL 锥形管。 
	注意：滤器较大开口端必须朝上。</li>
	<li>在细胞分离前，加入 1 mL 洗涤缓冲液以平衡滤器。将步骤 3.16 所得混合物加至滤器上。</li>
	<li>以 5 mL 洗涤缓冲液沿圆周方向洗涤滤器，共洗涤至总体积达 20 mL。将连接器接至无菌 50 mL 锥形管并关闭鲁尔锁。</li>
	<li>将滤器连接至连接器。沿滤器壁加入 1 mL 洗涤缓冲液。再沿滤器壁加入 1 mL 活化缓冲液 D。轻柔旋转样品，并在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入 1 mL 洗涤缓冲液。通过上下吹打 10 次使细胞与珠子分离。 
	注意：避免产生气泡。</li>
	<li>打开鲁尔锁，使脱离的细胞流入 50 mL 锥形管中。每次用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤滤器，共洗涤 10 次。</li>
	<li>弃去连接器和滤器，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心样品 10 分钟。将细胞沉淀重悬于 2 mL 完全 EGM-2 培养基中用于培养。 
	注意：此时每克 AT 的平均细胞数为：(a) OM 库：5.92 × 103 ± 4.27 × 103；(b) SC 库：4.12 × 103 ± 2.1 × 103。两个脂肪库来源细胞的活力均超过 90%。</li>
</ol>
4. 分离内皮细胞中脂肪生成的诱导
<ol>
	<li>在37℃、5% CO₂培养箱中，使用完全EGM-2培养基，在6孔组织培养处理板中培养细胞。 &#176;℃，5% CO₂2 培养箱中培养，每3–4天更换一次培养基，直至细胞达到80–90%汇合度。 
	注：群体倍增时间为2–3天。</li>
	<li>将细胞接种于100 mm培养皿中进行扩增，并以1:3比例传代一次。此时细胞处于第2代。</li>
	<li>使用自动细胞计数器对细胞进行计数（参见 材料表).</li>
	<li>将约100,000–200,000个细胞接种至6孔板中，每个组织来源设置复孔，用完全EGM-2培养基培养2天。</li>
	<li>吸弃所有生长培养基，替换为 2 mL 含 5% FBS 和 50 &#181;对照细胞中加入含青霉素/链霉素（终浓度为 g/mL）的培养基，处理细胞则更换为 2 mL 脂肪生成培养基（见步骤 1.4）。</li>
	<li>将细胞在37℃下孵育 &#176;5% CO₂ 湿润环境中2 在培养箱中孵育13天，每3至4天更换相应培养基。 
	注意：细胞在处理4天后将开始积累脂质。</li>
	<li>根据已发表的方法进行油红O和尼罗红染色15-17.</li>
	<li>为提取RNA而分离细胞时，从6孔诱导板中移除培养基，并用1 mL无菌PBS洗涤。</li>
	<li>加入350 &#181;硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液的 L（参见 材料清单向每个孔中加入适量溶液，在室温下孵育5–10分钟。</li>
	<li>使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，并将细胞转移至1.5 mL微量离心管中。 
	注意：样品可在 -80 ℃保存 &#176;C 冻存用于后续 RNA 提取及进一步处理。</li>
	<li>使用改良的RNA提取方案从样品中提取mRNA（参见 材料表).</li>
	<li>使用以下探针通过实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测基因表达：adiponectin、UCP-1 和 CIDEA（参见 材料表). 
	注意：此处RT-PCR操作采用以下标准程序：变性（95 &#176;C；15 秒），退火和延伸（60 &#176;C；1 分钟）进行 40 个循环。表达基因的样本其 CT 数值 &#62;35 被视为未检出。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文的重点是提供一种从人体内脏和皮下脂肪组织库中分离、扩增和诱导CD34+CD31+内皮细胞脂肪生成的方法。
已有文献报道了从啮齿类动物或人类不同血管床中分离内皮细胞的方法，这些方法主要采用荧光标记或磁珠偶联的CD31抗体18,19,20,21,22,23。这些分离技术在普遍应用中的主要挑战在于不同血管床内皮细胞群体的异质性，以及易受成纤维细胞和血管壁细胞污染的高风险。然而，已有研究报道对分离技术进行了优化，以避免此类污染24。使用这些技术通常从组织中分离出的是成熟内皮细胞。脂肪组织是干细胞/前体细胞的重要储存库，其中包括内皮前体细胞<sup ...

最近的证据表明，在小鼠和人类中，存在于脂肪组织血管中的一类细胞可分化为白色或米色/棕色脂肪细胞1,2,3。这类细胞的表型尚存争议，有研究支持其为内皮细胞、平滑肌/周细胞，或一系列中间表型4,5,6,7。本方法的开发旨在检测从肥胖个体不同脂肪库中分离出的CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成潜能。文献中其他研究主要关注整个基质血管组分或已知脂肪细胞前体细胞的脂肪生成能力2,8,9。由于目前已有技术可特异性地将药物递送至脂肪组织内皮细胞10，因此了解这些细胞向白色或米色脂肪细胞诱导分化的潜能，对未来实现靶向治疗具有重要意义。
不同研究团队已报道将 CD31 与 CD34 标记物的组合用作从人脂肪组织中分离内皮细胞的替代方法11,12,13。通常，该分离过程采用两步连续操作，并通过磁珠进行阳性筛选。在本报告中，我们采用了结合 CD34+ 磁珠与 CD31 塑料珠的免疫分离方法。我们发现，与连续磁性免疫分离相比，该技术在维持典型的鹅卵石样内皮细胞形态方面更具优势。此外，我们能够仅从 1–2 g 脂肪起始材料中获得足够数量的细胞，用于后续扩增及脂肪生成诱导。仅需少量皮下脂肪活检样本，即可获得下游应用所需的细胞数量。这一特点可能具有重要意义，尤其当该方法用于筛选个体对脂肪生成诱导反应性时。
与其他文献报道的系统不同，该方法仅使用两种成分对CD34+CD31+细胞进行脂肪生成诱导：一种PPARγ激动剂——罗格列酮，以及人胰岛素。&#947; 激动剂——罗格列酮——和人胰岛素。重要的是，所使用的人胰岛素剂量处于人体空腹状态下循环胰岛素的正常/较高水平范围内。14细胞对胰岛素的反应程度 体外，通过Akt磷酸化水平测定，与其对诱导试剂盒的响应能力无关。有趣的是，在本诱导试剂盒及实验条件下，细胞表现出白色与米色/棕色脂肪细胞的混合表型，该结果基于细胞内脂滴的大小与数量以及分子标志物的表达情况确定。这一简单且经济高效的诱导方案，结合对响应细胞表型（白色 对比 米色）可实现对可能改变分化后的米色与白色脂肪细胞平衡的试剂进行筛选。
该方法还为理解人脂肪组织中血管内皮祖细胞成脂作用的潜在机制提供了一种可转化的研究途径。利用这种特定的分离与分化技术，研究人员可以探究在瘦型和肥胖个体的不同脂肪库中，特定亚群血管内皮细胞成脂过程所涉及的多种信号通路。

<table><tbody><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;大型设备&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;生物安全柜&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nuaire&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;nu-425-400&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;细胞培养箱&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;800 DH&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;水浴&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Forma Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;2568&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;双向振荡器&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;RT-PCR仪&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CFX96-C1000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;电泳槽&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Mini PROTEAN 3 电泳槽&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;转膜电泳槽&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Mini Trans-Blot 细胞转移装置&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;电泳电源&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;PowerPac Basic&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;ELISA 阅读仪&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Molecular Devices&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;SpectraMax M5&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;印迹读取器&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;奥德赛&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;近红外&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;冷藏离心机&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Eppendorf&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;5810 R&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;台式离心机&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Eppendorf&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;MiniSpin Plus&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;荧光显微镜&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Olympus&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BX50&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;倒置显微镜&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;尼康&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;经颅磁刺激&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;KRBSS 缓冲液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;HEPES&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;研究产品国际公司&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;H75030&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;碳酸氢钠&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;792519&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;二水合氯化钙&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;C7902&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;磷酸二氢钾&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;P5655&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;硫酸镁&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;M2643&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氯化钠&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;746398&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;磷酸二氢钠一水合物&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S9638&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氯化钾&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;P9333&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;葡萄糖&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Acros Organics&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;410950010&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;腺苷&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Acros Organics&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;164040250&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;牛血清白蛋白&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;GE Healthcare Bio-Sciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;SH30574.02&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;青霉素/链霉素&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;15070063&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;组织消化&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;20 mL 注射器&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;全球医学&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;67-2020&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;尼龙筛网，250 &amp;micro;m&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sefar&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;03-250/50&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;移液针头&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Popper&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;7934&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;精细剪刀&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fine Science Tools&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;14058-11&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;组织镊&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;George Tiemann &amp;和公司&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;160-20&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;I型胶原酶&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;沃辛顿生化&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LS004196&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;培养皿，100 mm&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;5666-4160&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;TC 处理组&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Eppendorf 管，1.5 mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1615-5500&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;锥形管，15 mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nest Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;601052&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;50 mL 锥形管&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nalgene&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;3119-0050&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;闪烁瓶&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Kimble&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;74505-20&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;组织切碎&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;细胞分离&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cellometer&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nexcelom&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Auto 2000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cellometer 载玻片&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nexcelom&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CHT4-SD100-002&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cellometer 活率染色剂&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Nexcelom&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CS2-0106-5mL&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;吖啶橙/碘化丙啶&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗CD34磁珠&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;StemCell Technologies&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;18056&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;试剂盒&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;EasySep 磁铁&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;StemCell Technologies&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;18000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗 CD31 塑料微珠&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;19-03100-10&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect 10x 洗涤缓冲液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60-00080-10&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect 连接环&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;41-50000-03&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect 解离缓冲液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60-00046-12&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect 孵育缓冲液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60-00060-12&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;pluriSelect S 细胞筛&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;pluriSelect USA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;43-50030-03&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;6孔板&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CC7682-7506&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;TC 处理&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;4孔板腔载玻片&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;康宁生命科学&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;354559&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;纤维连接蛋白包被&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;4孔板载玻片&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;154526PK&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;未包被玻璃&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;人脂肪微血管内皮细胞（HAMVEC）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sciencell 研究实验室&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;7200&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;原代细胞系&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;内皮细胞培养基（ECM）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;ScienCell 研究实验室&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1001&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;完整试剂盒&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DMEM/F12 基础培养基&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;11320082&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;胎牛血清（FBS）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Rocky Mountain Biologicals&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;FBS-BBT&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;胰岛素&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Lilly&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;U-100&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;优泌乐&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;罗格列酮&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;R2408&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;strong&gt;细胞分析&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;油红O染料&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;O0625&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;在异丙醇中配制&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;96 孔板&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;USA Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1837-9600&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;96孔PCR板&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Genesee Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;24-300&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;RNA提取&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Zymo Research&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;R2072&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;试剂盒&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;cDNA合成&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1708841&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Supermix&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;JumpStart PCR聚合酶&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;D9307-250UN&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;热启动，使用 PCR Buffer N&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氯化镁溶液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;M8787-5ML&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;PCR 反应中终浓度为 3 mM&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;dNTPs&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Promega&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;U1515&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan AdipoQ&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00605917_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan CIDEA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00154455_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan RPL27&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs03044961_g1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TaqMan UCP1&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Hs00222453_m1&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;BCA 法测定&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;QPBCA-1KT&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;试剂盒&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;双丙烯酰胺&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610146&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;40% 储备液&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;过硫酸铵&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610700&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;TEMED&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610800&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Tris&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;T1503&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;甘氨酸&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;BIO-RAD&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;1610718&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;十二烷基硫酸钠&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;L3771&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;EDTA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S311-100&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;溴酚蓝&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;B8026&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;转膜&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;EMD Millipore&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;IPFL00010&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;甲醇&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;A452-SK4&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Odyssey封闭缓冲液，Tris&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;927-50000&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗AKT抗体&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Cell Signaling Technology&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;2920S&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;小鼠单克隆&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗pAKT抗体&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Cell Signaling Technology&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;9271S&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;兔多克隆&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗UCP1抗体&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Abcam&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;ab10983&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;兔多克隆&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗小鼠 IgG 抗体&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;926-68070&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;山羊多克隆，IRDye 680RD&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗兔IgG抗体&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;LI-COR&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;926-32211&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;山羊多克隆，IRDye 800CW&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抗兔IgG抗体&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Jackson ImmunoResearch&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;111-025-003&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;山羊多克隆，TRITC&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;磷酸盐缓冲液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10010049&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;37% 甲醛溶液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Electron Microscopy Sciences&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;15686&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;用于细胞固定的4%溶液&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;正常山羊血清&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Vector Laboratories&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S-1000&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10% 封闭液&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Triton X-100&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;X-100&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;0.1% 透化溶液&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DAPI&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;D1306&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Calcein AM&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;赛默飞世尔科技&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;65-0853-39&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;细胞荧光成像&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Matrigel 基底膜基质&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;康宁生命科学&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;356231&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;生长因子减少&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Thermo-Fisher Scientific&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;L3484&lt;/p&gt; </td><td></td></tr></tbody></table>

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导cd34+cd31+内皮细胞的脂肪生成

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

肥胖伴随着脂肪组织的广泛重塑，主要通过脂肪细胞肥大实现。脂肪细胞的过度生长会导致对胰岛素反应不良、局部缺氧和炎症。通过促进前体细胞分化为功能性白色脂肪细胞，可防止脂肪细胞群体的极端肥大，从而改善脂肪组织的代谢健康，并减轻炎症。此外，通过促进米色/棕色脂肪细胞的分化，可增加机体总能量消耗，进而导致体重减轻。这一策略有望预防肥胖相关合并症的发生，例如2型糖尿病和心血管疾病。
本文描述了从共表达 CD31 和 CD34 标志物的人类脂肪组织内皮细胞亚群中分离、扩增和诱导白色及米色脂肪细胞分化的方法。该方法成本相对较低，且不需耗费大量人力。该技术需要获取人类脂肪组织，皮下脂肪库适用于取样。在本实验方案中，于减重手术过程中收集病态肥胖受试者[体重指数（BMI）>35]的新鲜脂肪组织样本。通过从基质血管组分进行连续免疫分离，仅需 2–3 克脂肪即可获得足够数量的细胞。这些细胞可在体外培养中扩增 10–14 天，可进行冷冻保存，并在传代至第 5–6 代时仍保持其成脂分化能力。细胞使用含人胰岛素和 PPARγ 激动剂罗格列酮的成脂诱导剂混合物处理 14 天。
该方法可用于获得脂肪组织内皮细胞中驱动成脂反应的分子机制的概念验证实验，或用于筛选能够增强定向分化为白色或米色/棕色脂肪细胞的成脂反应的新药。利用小的皮下活检样本，该方法可用于在旨在刺激米色/棕色和白色脂肪细胞以治疗肥胖及其合并症的临床试验中，筛选出无反应的受试者。

我们的方案旨在提供一种 体外 评估不同部位人脂肪组织中CD34+CD31+血管细胞成脂潜能的方法。简化流程图如图所示。 图1A. 通过正向筛选表达 CD34 的细胞，第一步可获得 &gt; 95% 的 CD34+ 细胞存在于新鲜分离细胞群体中（图1A）。重要的是，这些细胞在传代培养几次后该标志物即会丢失。由于CD34是多种造血和非造血前体细胞的共同标志物，因此接下来分离内皮前体细胞所需的步骤是从CD34+细胞群体中通过阳性选择富集CD31+细胞（图1A）。尽管CD31是内皮细胞的标志物，但也可能存在于某些造血细胞亚群中。我们通过流式细胞术分析了来自大网膜和皮下脂肪的多个样本， consistently 发现CD34+CD31+细胞不表达CD45标志物（图1B，上图面板）。通常情况下， &lt;总细胞群中仅有1%的细胞呈...

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外 扩增及向白色和米色脂肪细胞的分化。文中讨论了多种下游应用。

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

肥胖伴随脂肪组织的广泛重塑，主要表现为脂肪细胞肥大。脂肪细胞过度增大导致胰岛素反应不良、局部缺氧和炎症。通过促进前体细胞分化为功能性白色脂肪细胞，可防止脂肪细胞群体的过度肥大，从而改善脂肪组织的代谢健康并减轻炎症。此外，通过促进米色/棕色脂肪细胞的分化，可增加机体总能量消耗，实现减重。该策略有望预防肥胖相关共病，如2型糖尿病和心血管疾病的发生。本文介绍了一种从共表达CD31和CD34标志物的人类脂肪组织内皮细胞亚群中分离、扩增并诱导其分化为白色和米色脂肪细胞的方法。该方法成本较低且操作简便，仅需获取人类脂肪组织，皮下脂肪库即可满足取样需求。本方案采用病态肥胖受试者（体重指数[BMI] >35）在减重手术过程中获取的新鲜脂肪组织样本。通过从基质血管组分进行连续免疫分离，仅需2–3 g脂肪组织即可获得足够数量的细胞。这些细胞可在体外培养扩增10–14天，可冻存保存，并在传代至第5–6代时仍保持其成脂特性。细胞经含人胰岛素和PPARγ激动剂罗格列酮的成脂诱导剂处理14天后完成分化。该方法可用于研究驱动脂肪组织内皮细胞成脂反应的分子机制的概念验证实验，或用于筛选可增强白色或米色/棕色脂肪细胞分化方向成脂反应的新药。利用小型皮下活检样本，该方法还可用于在旨在通过促进米色/棕色及白色脂肪细胞生成以治疗肥胖及其共病的临床试验中，筛选出无应答个体。

该方法有助于回答肥胖研究领域中的关键问题，例如识别在脂肪组织重塑过程中阻碍有效脂肪生成反应的关键因素和机制。该技术的主要优势在于，可以从少量人脂肪组织样本中分离出 CD34+CD31+ 内皮细胞。我们最初提出该方法的设想，是希望鉴定人脂肪组织血管系统中能够响应脂肪生成刺激的细胞类型。该方法的可视化演示至关重要，因为细胞分离步骤在实践中往往难以操作，原因在于新鲜人体脂肪组织的获取机会通常有限。从接受减重手术的人类受试者中采集人体大网膜和皮下脂肪组织。在组织取出后立即分别置于含有青霉素-链霉素（50 微克/毫升）的 Hank's 平衡盐溶液的容器中，并在室温下保存。组织提取后样本送达实验室时，使用经70%乙醇擦拭的剪刀和镊子仔细清理并去除组织中的纤维化和烧灼部分。称量脂肪组织，并将其分装为每份五克，用于胶原酶消化。取五克脂肪组织置于闪烁瓶中，加入五毫升胶原酶溶液，在室温下使用两把剪刀将其充分剪碎。向切碎的组织中再加入 10 毫升胶原酶溶液，使总体积达到 15 毫升。将样品在 37 摄氏度水浴中消化 1 小时，期间持续振荡。消化完成后，将样品倒入 20 毫升钝端注射器中。使用250微米尼龙滤网将样品过滤至50毫升锥形管中，以分离脂肪细胞和基质血管细胞与未消化的组织。用10毫升KRBBS冲洗闪烁瓶，并将洗涤液倒入滤网中以收集残留细胞，随后将过滤后的样品在室温下孵育5分钟。然后，使用20毫升注射器和20号6英寸移液针去除基质血管组分层，并将其转移至洁净的50毫升锥形管中。加入 10 毫升 KRBBS，将样品在室温下静置五分钟。将两个脂肪库的基质血管组分置于冰上以备后续处理。在 4 摄氏度下以 500 × g 离心五分钟。从离心机中取出样品，小心倒掉上清液，保留含有基质血管组分细胞的沉淀。用 5 毫升 PBS 轻柔重悬细胞沉淀。再次离心后，弃去上清液，用 1 毫升 PBS 重悬细胞，并进行细胞计数。第三次离心收集样品，将沉淀重悬于100微升CD34分离缓冲液中。加入10微升CD34抗体混合物，在室温下孵育15分钟。然后加入5微升磁珠，在室温下继续孵育10分钟。接下来，向每个样本中加入 2.5 毫升 CD34 分离缓冲液，并将样本置于磁力架上，室温孵育五分钟。将磁力架倒置五秒钟，弃去分离缓冲液。重复此步骤四次后，从磁力架上取下离心管，加入两毫升 CD34 分离缓冲液。经过另一次离心后，将 CD34+ 细胞沉淀重悬于 1 毫升 CD34 分离缓冲液中，并对细胞进行计数。再次离心收集细胞沉淀，将其重悬于 250 微升缓冲液 B 和 250 微升洗涤缓冲液中。接下来，通过涡旋充分重悬 CD31 磁珠，然后向重悬的细胞沉淀中加入 20 微升 CD31 磁珠，并在室温下轻轻摇动孵育 30 分钟。在细胞分离之前，加入一毫升洗涤缓冲液以平衡滤网。然后，将重悬于CD31磁珠中的细胞混合液加入滤网中。以五毫升洗涤缓冲液沿螺旋方向洗涤滤网，共洗涤至总体积为20毫升。将连接器连接至一个无菌的50毫升锥形管，并关闭鲁尔锁。将滤网连接至连接器后，沿滤网内壁加入1毫升洗涤缓冲液，然后沿滤网内壁加入1毫升活化缓冲液D。轻轻旋转混匀样品，在室温下孵育10分钟。接着，加入一毫升洗涤缓冲液，通过上下吹打10次将细胞从磁珠上分离。打开鲁尔锁，使脱离的细胞流入50毫升锥形管中。每次用一毫升洗涤缓冲液冲洗滤网，重复10次。弃去连接器和滤网，将样品在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。最后，用 2 毫升完全 EGM2 培养基重悬细胞沉淀用于培养。将细胞接种于六孔组织培养板中，加入完全 EGM2 培养基，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中培养。每三到四天更换一次培养基，直到细胞达到 80% 至 90% 的融合度。然后将约 10 万至 20 万个细胞接种到六孔板中，确保每个组织来源设置复孔，并在完全 EGM2 培养基中培养两天。两天后，吸去所有生长培养基。对于对照细胞，更换为含有5% FBS和50微克/毫升青霉素-链霉素的2毫升DMEM/F-12培养基。对于处理组细胞，更换为2毫升成脂诱导培养基。将细胞在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养13天，每3至4天更换相应的培养基。代表性结果展示了CD34+CD31+细胞在体外培养传代两次后典型的内皮细胞铺路石样形态。同时显示，这些细胞在Matrigel中培养时能够形成管状结构，符合预期。对荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（acetylated LDL）的均匀摄取表明，该细胞群体具有均一的内皮细胞特性。图中显示了 CD34+CD31+ 细胞在脂肪生成诱导 13 天后中性脂滴的油红 O 染色结果。展示了来自三位不同人类受试者的大网膜和皮下脂肪库细胞的代表性反应，用以说明同一供体不同脂肪库之间以及不同供体之间的脂肪生成诱导反应存在显著差异。该图像显示了 CD34+CD31+ 细胞经 13 天脂肪生成诱导后的细胞内荧光脂质染色情况。图像显示了含有单房脂滴、多房脂滴以及无脂质积聚的细胞。实时PCR结果显示泛脂肪细胞标志物脂联素以及棕色/米色脂肪标志物CIDEA和UCP-1的表达。这些结果证实，经脂肪生成诱导后的细胞表达出与白色/米色混合型脂肪细胞表型一致的分子标志物。熟练掌握后，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行此操作时，务必注意使用新鲜的人类脂肪组织，且采集后存放时间不得超过两小时。完成该操作后，可进一步采用流式细胞术、免疫组织化学以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等方法，鉴定发生响应的细胞亚群，以及成熟脂肪细胞标志物的表达情况，从而用于识别米色或棕色脂肪细胞表型。该技术建立后，为肥胖研究领域的科研人员探索人类脂肪组织、血管细胞以及脂肪生成的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离、培养和扩增CD34+31+细胞。请务必注意，操作人体组织具有极高的危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取适当的预防措施，例如遵守生物安全规范。该技术的应用意义延伸至与肥胖相关的共病（如胰岛素抵抗）的治疗，因为它能够识别细胞对潜在治疗干预的成脂反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人网膜和皮下脂肪组织 CD34+CD31+ 内皮细胞的分离、扩增和脂肪诱导

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

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人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

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通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

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从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

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从适合RNA分析和巨噬细胞表型鉴定的人类内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分

本方案详细描述了一种小鼠脂肪组织库的解剖方法，以及相应动脉的分离与消化，以释放并鉴定内皮细胞群体。该方法获得的原代细胞可用于后续实验，有助于深入理解血管细胞生物学及血管功能障碍的机制。...

从不同脂肪组织库中分离和鉴定血管内皮细胞用于后续应用

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

本文介绍了从小鼠腹主动脉周围脂肪组织中分离的基质血管组分来源的前脂肪细胞的分离、培养及成脂诱导方法，可用于研究血管周围脂肪组织的功能及其与血管细胞之间的关系。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导基质血管组分来源的前脂肪细胞进行脂肪生成

脂肪组织是间充质干细胞的优良来源。本文详细介绍了从小鼠附睾脂肪组织中分离、培养和鉴定脂肪组织来源干细胞（ADSCs）的逐步操作方法。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离、体外扩增及表征间充质干细胞

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

了解从人网膜和皮下脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞的方法，并学习将其诱导分化为白色和米色脂肪细胞的技术。该方法有助于研究肥胖及脂肪组织重塑机制。

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

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