线虫线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定
2018年10月15日
本文介绍了一种改良的小尺度萃取和比色法测定乳酸和丙酮酸在线虫中的含量.使用商用试剂盒时, 其灵敏度和准确度的技术发展非常重要。在萃取中蛋白质沉淀是定量测定细胞内代谢产物的关键步骤。
本研究可以帮助回答生物化学计数和方法学领域的任何问题，例如线虫开发权分析。该技术的主要优点是蛋白质沉淀在外向和饮用和蠕虫的均质化。开始这个实验，在37摄氏度的37摄氏度的LB肉汤液体介质中种植大肠杆菌OP50菌株。
在四摄氏度下存储成功的 OP50。移液两毫升培养OP50至少三个先前准备的NGM，或线虫生长介质阿加板，并用手旋转板传播。在室温下孵育板过夜，形成一层薄薄的OP50。
接下来，使用无菌牙签从带蠕虫的盘子中挑选一块阿加，在每个 OP50 NGM 板中添加至少 100 个蠕虫。培养至少三个板与蠕虫在20摄氏度，直到蠕虫到达成人阶段，这是在立体显微镜下确认。使用立体显微镜找到装满鸡蛋的草本草。
在板中加入五毫升的S缓冲液后，使用巴斯德移液器将蠕虫从所有三个板转移到15毫升锥形管中。通过加入15毫升S缓冲液，然后在室温下以300倍G离心30秒，清洗蠕虫三次。如果 S 缓冲液的体积超过 5 毫升，则离心后取出多余的缓冲液。
要成功分离和散装鸡蛋分离，将蠕虫溶解在0.5毫升碱性次氯酸盐溶液中。在室温下倒置和孵育10至15分钟。以 1，400 RPM 的速度离心 30 秒，以去除溶液。
使用15毫升S缓冲液清洗鸡蛋颗粒。离心后，它取出上经剂，并重复此洗涤至少三次。上次洗涤后，我们悬浮在五至六毫升的S缓冲液中，不带大肠杆菌，在20摄氏度下孵育卵子，孵化卵子，实现L1级幼虫的H同步培养。
在三个盖滑单上移液 10 微升含有 L1 蠕虫的 S 缓冲器。在立体显微镜下计算幼虫数值，并计算平均值以确定 L1 级幼虫的近似数量。最后，将L1阶段幼虫转移到5个NGM Agar板与OP50，并在20摄氏度生长，直到年轻的成人阶段，在此期间进行自我受精和几个卵子的产卵。
每天在显微镜下观察蠕虫，然后收集年轻的成年人，或五天大的蠕虫。要仅选择活蠕虫，请将悬浮在三到四毫升 S 缓冲液中的蠕虫添加到 15 毫升锥形管中。然后加入同等体积的冰冷60%蔗糖和混合。
在4摄氏度下将管在1500倍G下离心15秒，15秒。然后使用巴斯德移液器小心地将蠕虫从管壁上移出，然后将漂浮的蠕虫取出到新鲜管中。用 S 缓冲液填充管中清洗蠕虫，并在 4 摄氏度下以 1500 次 G 离心 30 秒。
拆下缓冲液并再重复洗涤两次。第三次洗涤后，小心地取出上流液，确保不清除任何蠕虫，并使用1000微升移液器尖端测量洗涤蠕虫的湿体积。对于蛋白质沉淀，使用巴斯德移液器将洗涤的蠕虫添加到放在冰上的均质剂中等量的冰冷 10% 三氯乙酸中。
使用旋转的 40 冲程进行均质化，转速高达 1，300 RPM。使用具有 20% 占空比的超声波均质器对均质进行声波化。使用巴斯德移液器将均质转移到放在冰上的1.5毫升管。
将均质转移到微型离心管后，在4摄氏度的G下用8000次G离心，10分钟进行澄清。将上一液转移到一个新鲜的管子中，加入四个氯化钾，在冰上孵育20分钟，将其中和。然后在4摄氏度下将G的8000倍离心10分钟。
将上一液转移到新鲜管中，并在 80 摄氏度下储存，直到需要进一步检测。要测量乳酸的浓度，请使用色度测定试剂盒对测试样品进行重复分析。将测试样品的10微升添加到96井板的每个井中，然后向每个样品添加乳酸检测缓冲液，将体积调整为15微升。
将100毫摩尔L+乳酸标准与乳酸测定缓冲液稀释至1毫摩尔。然后，放入一系列井中，加入零、二、四、六、八和十微升稀释的 L+乳酸盐标准。在每个井中加入50微升的反应混合物，并在室温下孵育，防止光线至少30分钟，使颜色形成。
最后，使用微孔板读取器测量每孔在 570 纳米的吸光度。从反应混合物的吸收度中减去背景控制混合物的吸光度。然后绘制乳酸标准曲线，通过将每个浓度乘以 2.25 来计算曲线中的乳酸浓度。
使用色度测定试剂盒测量测试样品中丙酮酸盐的浓度，并进行双工检查。将测试样品的10微升添加到96孔板的不同孔中，并在每个样品中加入90微升的工作试剂。在室温下孵育30分钟。
然后将板放在微孔板读卡器中，以测量每孔在 570 纳米处的吸水性。绘制丙酮酸盐标准曲线，通过将每个浓度乘以 2.25 来计算标准曲线中的丙酮酸盐浓度。最后，要测量测试样品中的蛋白质浓度，请使用文本协议中描述的色度测定试剂盒。
蛋白质沉淀后，色度测定可用于乳酸和丙酮酸盐浓度的定量测定。这个实验显示了与C.Elegans之前的报告相反的色度测定的准确性。此外，这些测定足够敏感，即使在小规模样品中，也足以在短时间内测量乳酸和丙酮酸盐浓度。
为了准确检测C.elegans中的乳酸和丙酮酸盐，在蠕虫均质过程中进行蛋白质沉淀至关重要。当样品在均质过程中沉淀蛋白质时，与完整的细胞酸分相比，或在完全未检测到乳酸或丙酮酸盐时，在均质化后，检测到的乳酸和丙酮酸盐的含量更高。
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概览
本研究提出了一种改进的方法，用于在秀丽隐杆线虫中提取和分析乳酸和丙酮酸。重点关注蛋白沉淀对于准确代谢物定量的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 代谢组学
- 神经科学
背景
- 理解模型生物中的代谢过程对生物化学研究至关重要。
- 秀丽隐杆线虫是研究代谢途径的宝贵模型。
- 准确测量代谢物对于生物化学分析至关重要。
- 商业分析试剂盒需要仔细优化以提高灵敏度和准确性。
研究目的
- 开发一种在秀丽隐杆线虫中提取乳酸和丙酮酸的可靠方法。
- 提高细胞内代谢物比色分析的准确性。
- 研究蛋白沉淀在代谢物提取中的作用。
使用的方法
- 在LB培养基中培养E. coli OP50，用于饲养线虫。
- 准备线虫生长培养基（NGM）琼脂板。
- 孵化琼脂板以建立细菌层，用于线虫培养。
- 在代谢物提取过程中实施蛋白沉淀技术。
主要结果
- 成功从秀丽隐杆线虫中提取乳酸和丙酮酸。
- 证明蛋白沉淀在分析准确性中的关键作用。
- 使用比色分析验证改进的提取方法。
- 洞察研究条件下秀丽隐杆线虫的代谢特征。
结论
- 改进的提取方法提高了关键代谢物的定量分析。
- 蛋白沉淀对于准确的生物化学分析至关重要。
- 本研究有助于理解秀丽隐杆线虫的代谢过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of intracellular lactate and pyruvate enables mechanistic de-risking of metabolic target validation in discovery pipelines. The protein precipitation-enhanced colorimetric assay provides a scalable, reproducible readout for pathway interrogation in disease-relevant systems. This approach supports predictive confidence in early-stage target triage by linking metabolite flux to phenotypic outcomes in C. elegans.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking energy metabolism to phenotypic modulation.
- Operational Value: Provides quantitative lactate/pyruvate ratios as functional biomarkers for pathway activity.
- Predictive Value: Supports metabolic de-risking by clarifying mitochondrial vs. glycolytic flux in disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, protein-free supernatants compatible with 96-well colorimetric detection.
- Quantitative Output: Generates linear standard curves for lactate and pyruvate enabling absolute concentration calculations.
- Scalability: Facilitates duplex examinations across multiple conditions using common laboratory plate readers.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Lactate/pyruvate ratio serves as a translational biomarker for oxidative stress and glycolytic shift.
- Preclinical Continuity: Extracted metabolites support longitudinal profiling from larval to adult stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Metabolite flux data informs go/no-go criteria for target advancement based on energetic phenotype.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where metabolite extraction precedes functional screening and target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of metabolic inhibitors or activators via lactate/pyruvate readouts.
- Screening: Enables assay-ready sample preparation for compound library screening in nematode-based models.
- Analytics: Provides absorbance-based quantification at 570 nm with background subtraction for accurate metabolite measurement.
- Translational Research: Connects intracellular lactate/pyruvate levels to age-related metabolic imbalance in C. elegans.
- Enterprise Reuse: Protein precipitation protocol standardizes sample prep across labs for consistent metabolomic profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in energy pathway modulation by removing protein interference.
- Operational Value: Uses common precipitants (TCA, PCA, MPA) and standard lab equipment for broad accessibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling accurate metabolite screening without specialized fluorimeters.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on lactate/pyruvate flux in validated disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode culture, homogenization, and cold-chain protein precipitation.
- Depends on access to microcentrifuges, homogenizers, and microplate readers with 570 nm filters.
- Necessitates standardization of worm wet volume measurement and precipitant final concentration (5%) across users.
- Involves adaptation considerations when extending to other model systems or tissue types.
- Limited by the need for immediate processing post-homogenization to prevent metabolite degradation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Caenorhabditis elegans Synchronized Culture
3:21
Extraction of Cellular Fraction from C. elegans
5:35
Lactate, Pyruvate and Protein Assays
7:32
Results: Efficiency of Lactate and Pyruvate Colorimetric Assays After Protein Precipitation of C. elegans
8:26
Conclusion
