斜扫描激光检眼镜 (奥斯陆) 与光学相干层析成像 (OCT) 的多模态视网膜成像

在这里, 我们提出了一个协议, 以获得一个大视野 (FOV) 三维 (3D) 荧光和 OCT 视网膜图像的新的成像多式联运平台。我们将介绍系统设置、校准方法和操作协议。在体内成像将被证明, 并有代表性的结果将提供。

这种方法可以帮助回答眼科和视网膜成像领域的关键问题。例如血液视网膜屏障破坏和视网膜毛细血管功能的成像和量化。该技术的主要优点是，它可以通过在一次光栅扫描中使用倾斜扫描激光获得大视场、三维、多对比度的视网膜成像。

该技术的意义延伸到糖尿病视网膜病变和其他视网膜前疾病的诊断。因为 oSLO 可以获得视网膜微血管系统的高对比度图像，低至 3D 单毛细血管。虽然这种方法可以提供对视网膜成像的见解，但它也可以应用于使用传统物镜的其他成像系统。

如小鼠皮层的活体成像。超连续激光源用作斜扫描激光检眼镜或 oSLO 设置的系统激光源。可见光范围与较高波长范围由第一二向色镜隔开。

光束通过偏振分束器后，光谱通过一对色散棱镜扩展。狭缝用于选择激发波长范围。反射镜将过滤后的光束反射回棱镜对，将光耦合到单模光纤中。

光谱仪用于确认单模光纤输出端的波长选择。单模光纤连接到两个级联光纤耦合器。第二个光纤耦合器的光纤输出端口之一将光传送到 oSLO 系统。

为了准直 oSLO 系统中的激光，激光由检流计镜偏转。一对一望远镜系统将激光中继到第二个振镜，三比一望远镜系统进一步将激光中继到眼睛的瞳孔。三比一望远镜系统内的二向色镜反射荧光信号。

三比一望远镜系统和二向色镜安装在定制的燕尾榫滑块上，以偏移光轴并产生倾斜扫描照明。倾斜照明允许进行体积荧光成像，而无需进行切片。通过偏移激光，斜光束聚焦在视网膜上，然后斜射检测可以沿斜光束路径捕获断层荧光图像。

为了创建荧光成像光路，荧光被二向色镜反射并传递到第三个振镜。然后，荧光通过另一个一对一望远镜系统传递到成像物镜。在第三个振镜下方安装了两个额外的平移台，以提供自由度的冗余以优化图像。

最终成像系统安装在具有三个自由度的载物台上。旋转和两个平移轴。平面相机用于捕获横截面荧光图像。

另一个二向色镜将后红外范围与剩余光线分开。长通滤光片用于将带宽进一步限制在 800 至 900 纳米。将光束耦合到单模光纤中。

单模光纤连接到两个级联光纤耦合器的另一个输入端口，以与蓝色 oSLO 激励相结合。来自第二个光纤耦合器的第二个输出端口的光被引导到 OCT 参考臂。它有色散补偿板、可变中性密度滤光片和反射镜。

从参考臂和眼返回的光在第二个光纤耦合器处重新组合，并被传送到 OCT 光谱仪以收集信号。使用用 Labview 编写并根据扫描 OCTA 扫描协议修改的数据采集系统软件。对于每个 b 扫描，模拟输出板输出一个具有 500 步的 80% 占空比锯齿，以控制 x-prime 快速扫描镜。

仅在镜子处于前向扫描方向时，在每个步骤中触发线阵扫描相机以采集 OCT 的数据。将线阵扫描相机的曝光时间设置为 17 微秒。要获取 OCTA 信号，请在同一个 b 扫描位置重复测量五次。

将 AO 输出速率设置为 100 kHz，将 OCT A 线速率设置为 50 kHz。通过斜坡波形控制 y-prime 慢速扫描镜 GM1。将取消扫描镜像 GM3 与 GM1 同步，以取消扫描缓慢的扫描。

通过另一个模拟输出板触发平面相机，在每个 y 定焦位置捕获一个荧光图像。裁剪成像大小或对相邻像素进行分箱，以根据需要提高速度和灵敏度。首先通过在指内捏合期间缺乏撤退反射来确认大鼠的适当麻醉水平。

麻醉诱导后，将大鼠放在支架上。安装鼻锥以在实验的剩余时间内保持麻醉。将 5 盐酸丁卡因滴眼液涂抹在大鼠眼上进行局部麻醉。

然后用 1% 托吡卡胺滴眼液扩张瞳孔。扩张两分钟后，使用 1 毫升注射器和 29 号针头通过尾静脉注射 10% 荧光素或 10% 用生理盐水稀释的 FITC。然后打开激光源，并放置一个中性密度滤光片以减弱对准过程中的蓝光激发。

测量蓝光的功率，确保其小于 10 微瓦。然后切换到光学相干断层扫描灯，确保它接近 8 毫瓦。打开检流计镜的电源，该镜用于控制激光的方向。

调整眼球的高度，在角膜上形成一个固定的激光点。调整眼睛位置，使瞳孔边缘大致垂直于激光。并将激光偏移到距眼尖中心约 1.5 毫米的位置。

进一步调整动物支架，直到光学相干断层扫描图像达到最佳质量。在 x 素数快速扫描方向上，确保横截面 b 扫描图像看起来是平坦的。切换到 y 素数慢速扫描方向时，请确保横截面 b 扫描图像由于倾斜扫描而出现倾斜。

移除蓝光激发的中性密度滤光片。并监控来自摄像头的实时馈送。应出现横截面荧光图像，显示不同深度的血管。

调整最终荧光成像系统的焦距以达到最佳焦距。并对眼睛在侧平面的位置进行微调，以达到最佳的斜扫描激光检眼镜图像质量。对齐后，开始同时获取光学相干断层扫描血管造影和体积荧光素血管造影。

该图像显示了大鼠视网膜的横截面光学相干断层扫描图像。这是同一区域的光学相干断层扫描血管造影或 OCTA 图像。以及斜位扫描激光检眼镜检查和体积荧光素血管造影图像、横断面荧光素血管造影或 oSLO-VFA。

类似于光学相干断层扫描 b 扫描。与 OCTA 相比，斜位扫描激光检眼镜和体积荧光素血管造影横截面图像清楚地识别了外丛状层中的毛细血管。视网膜的表层显示在 OCTA 图像中。

垂直条纹形式的伪影在图像中可见。oSLO-VFA 通过利用荧光发射对比避免了运动伪影。在视网膜中间层内，垂直潜水的血管在 oSLO FA 图像中清晰显示。

但在 OCTA 中并不明显。在尝试此程序时，重要的是要避免激光连续暴露在眼睛中超过两分钟。避免角膜干燥，并通过阻挡光线让眼睛在成像切片之间休息至少 30 秒。

按照这个程序，可以执行其他方法，如对转基因小鼠进行成像以表达荧光蛋白，以回答其他问题。比如特定的视网膜细胞类型如何变化，以及过去看到的已知疾病的变量。