一种新型饱和突变方法：利用硫代磷酸酯一步法表征RNA中调控蛋白结合位点

该RNA磷酸硫代修饰方法的总体目标是通过单步操作实现饱和突变。该技术有助于解答分子生物学领域中的关键问题，例如基因调控机制。该技术的主要优势在于，仅需一步即可完成对RNA中蛋白质结合位点的饱和突变。

该单步饱和突变实验方案的关键步骤是在蛋白质结合位点内，向DNA模板中掺入非野生型核苷酸。首先，通过DNA合成仪化学合成T7引物。随后，合成一段对应于蛋白质结合位点的掺杂寡核苷酸。

在此示例中，带下划线的序列包含果蝇（drosophila）sex-lethal 蛋白结合位点的反向互补序列，每个掺杂位点由 X 表示。每个掺杂位点使用 90% 野生型核苷酸与 10% 非野生型核苷酸的比例。绿色序列与 T7 引物序列互补，是用于体外转录的 T7 启动子。本实验方案的下一步是分别合成含有每种硫代磷酸核苷酸的 RNA，随后对 RNA 进行 5' 端放射性标记。

在20微升的转录反应体系中，分别合成每种硫代磷酸化RNA。向每个微量离心管中加入以下组分：T7转录缓冲液、1微摩尔T7寡核苷酸、1微摩尔掺杂寡核苷酸、10毫摩尔DTT、2毫摩尔GTP、ATP、CTP和UTP各1毫摩尔，以及每微升2单位的T7 RNA聚合酶。向其中一个管中加入0.167毫摩尔的α-硫代ATP，向另一管中加入0.05毫摩尔的α-硫代UTP。

将RNA合成反应混合物在37摄氏度孵育两小时。两小时后，向每个RNA样品中加入2.5微升热不稳定α磷酸酶和2.5微升10X磷酸酶缓冲液。在37摄氏度孵育10至30分钟，以去除5'端磷酸基团。

将碱性磷酸酶在80摄氏度加热两到五分钟以使其失活。后续步骤涉及放射性物质的使用，必须采取适当的防护措施，并使用有机玻璃屏蔽板以防止放射性暴露。为了对去磷酸化的RNA的5'端进行放射性标记，在10微升的反应体系中使用1微升T4多核苷酸激酶和1微升γ-P32 ATP。

将反应混合物在37摄氏度孵育30至60分钟。通过在65摄氏度加热20至30分钟使T4多核苷酸激酶酶失活。将反应产物在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。

通过放射自显影在凝胶上定位 RNA，并切下含有放射性标记 RNA 的凝胶片段。将凝胶片段放入微量离心管中，用移液器吸头紧贴管壁压碎，然后加入蛋白酶 K 缓冲液。室温下旋转孵育管子，时间从两小时至过夜。

接下来离心凝胶悬液，收集缓冲液，并弃去凝胶。每份溶液用等体积的苯酚-氯仿萃取两次。随后，用氯仿萃取一次。

收集水相，并加入0.1倍体积的3摩尔乙酸钠（pH 5.2）、载体tRNA或糖原，以及2.5倍体积的乙醇。将样品置于-80摄氏度保存1小时。在高速微量离心机中以16,873 ×g离心5至10分钟。

小心移除缓冲乙醇溶液，避免扰动RNA沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀，然后离心2至5分钟。小心除去乙醇，并将沉淀在空气中干燥。

将每个沉淀重悬于 20 至 50 微升经 DEPC 处理的水中。保存于负 20 摄氏度，直至使用。此处展示了由于干扰导致的分配概念。

在蛋白质结合过程中，RNA 分子分布在蛋白质结合部分和未结合部分之间。如果某一特定位置的核苷酸干扰蛋白质结合，则该核苷酸将优先被排除在蛋白质结合部分之外。随后，使用碘切割在磷酸硫代酯掺入位点处的 RNA。

开始本实验步骤时，配制蛋白质-RNA结合反应体系，每个反应体系包含10毫摩尔/升 Tris-HCl、1毫摩尔/升 DTT、50毫摩尔/升氯化钾、0.5单位/微升RNase抑制剂、0.09微克/微升乙酰化牛血清白蛋白、1毫摩尔/升 EDTA、0.15微克/微升 tRNA、5'端放射性标记的RNA，以及6微升适当浓度的蛋白质。将蛋白质结合反应体系在25摄氏度孵育20至30分钟。通过硝酸纤维素滤膜结合法将蛋白质结合的RNA组分与未结合的组分分离。

在室温下，将结合反应液加入连接真空装置的硝酸纤维素滤膜上。只有RNA-蛋白质复合物会滞留在滤膜上，而未结合的RNA则会通过滤膜。将含有滞留的放射性RNA的硝酸纤维素滤膜部分剪成小片，以适配微量离心管，并加入足量的蛋白酶K缓冲液，确保滤膜小片完全浸没。

从滤纸片中洗脱RNA，持续两到三小时或过夜。接着，将每管中的溶液转移至新管中，并按先前所示方法用苯酚-氯仿和氯仿进行抽提。收集水相，加入0.1倍体积的3摩尔/升乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的乙醇，然后置于冷冻冰箱中孵育。

离心、洗涤并干燥RNA后（如前所述），将RNA重悬于经DEPC处理的水中。所有涉及碘的操作步骤必须在通风橱中进行。为在磷酸硫代酯掺入位点切割RNA，向每个RNA样品中加入20微升含最多10微克载体tRNA的DEPC处理水中的一毫摩尔碘。

室温孵育5分钟。通过加入乙酸钠和乙醇沉淀已切割的RNA，具体操作如前所述。将已切割的RNA重悬于变性凝胶上样染料中。

加热后，将样品上样至15-20%变性聚丙烯酰胺凝胶中，通过电泳分离RNA片段。将聚丙烯酰胺凝胶暴露于X射线胶片，利用放射自显影检测结合组分与总文库中的条带。该示意图说明了由于干扰导致的分选概念。

在泳道 T 中，总 RNA 组分在所有掺入位点的条带强度大致相等。在蛋白质结合的 RNA 组分中，位点 1、4 和 7 处的核苷酸对结合无影响。然而，在位点 3 和 6 处，核苷酸会干扰结合，因而被排除在结合组分之外。

在第5位点，干扰是部分的。通过比较每种核苷酸对应的成对泳道，可对所有四种核苷酸进行分析。该放射自显影图显示了变性凝胶中的两对泳道。

泳道 T 为总 RNA，泳道 B 为蛋白质结合的 RNA。垂直线标记了性别致死（sex-lethal）蛋白的结合位点。对于 α-硫代腺嘌呤碱基对，条带 1、2、3 和 5 在总 RNA 组分中存在，但在结合 RNA 组分中缺失或显著减少。

对于α-硫代尿苷酸对，结合组分中的条带7和8相对强度较弱。在结合组分中被优先排除的残基对蛋白质结合至关重要。一旦RNA被合成并进行5'端标记，若操作得当，该技术可在12小时内完成。

在进行该实验操作时，需注意硫代磷酸盐的适当掺入水平以及确定适合的蛋白质浓度用于结合反应，这些都是重要的考虑因素。完成该操作后，可进一步采用适当的功能检测或体内实验等方法，验证诱变方法的结果并理解其生物学意义。该技术为那些成本较高或操作繁琐或兼具两者缺点的其他方法提供了一种替代方案。

观看本视频后，您应能够充分理解如何设计和合成突变文库、进行结合反应、鉴定每个文库中的突变核苷酸，并定量分析在每个测试位点上非野生型核苷酸所产生的影响。请务必注意，丙烯酰胺和放射性物质的操作具有潜在危险性，在执行本实验步骤时，应始终采取适当的预防措施，例如佩戴手套、使用合适的通风设备以及放射性屏蔽装置。