一种新的饱和诱变方法: 利用 Phosphorothioates 对 RNA 调控蛋白结合位点的单步表征

RNA 中这种硫代磷酸盐方法的总体目标是在单个步骤中进行饱和诱变。这种方法可以帮助回答分子生物学领域的关键问题，例如基因调控。该技术的主要优点是，只需一步即可完成 RNA 中蛋白质结合位点的饱和诱变。

这种单步饱和诱变方案的一个关键步骤是在蛋白质结合位点内用非野生型核苷酸掺杂 DNA 模板。首先通过在 DNA 合成仪上进行化学合成合成 T7 引物。接下来合成与蛋白质结合位点相对应的掺杂寡核苷酸。

在这个例子中，带下划线的序列包含果蝇性致死蛋白结合位点的反向互补，每个掺杂位点由一个 X.使用 90% 野生型核苷酸与 10% 非野生型核苷酸的比率对于每个掺杂位点。绿色序列与 T7 引物序列互补，是体外转录的 T7 启动子。该方案的下一步是用每个硫代磷酸盐核苷酸合成单独的 RNA，然后对 RNA 进行 5 端引物放射性标记。

在 20 μL 转录反应中合成每种硫代磷酸盐的 RNA。向每个微量离心管中加入以下物质：T7 转录缓冲液、1 微摩尔 T7 寡核苷酸、1 微摩尔掺杂寡核苷酸、10 毫摩尔 DTT、2 毫摩尔 GTP、ATP、CTP 和 UTP 各 1 毫摩尔，以及每微升 2 单位的 T7 RNA 聚合酶。将 0.167 毫摩尔的 α-硫代 ATP 添加到一根管中，将 0.05 毫摩尔的 α-硫代 UTP 添加到另一根管中。

将 RNA 合成反应混合物在 37 摄氏度下孵育 2 小时。2 小时后，向每个 RNA 样品中加入 2.5 μL 热不稳定的 α 磷酸酶和 2.5 μL 10X 磷酸酶缓冲液。在 37 摄氏度下孵育 10 至 30 分钟，以去除 5-引物磷酸盐。

通过在 80 摄氏度下加热 2 到 5 分钟来灭活碱性磷酸酶。其余步骤涉及放射性的使用，必须使用适当的预防措施和有机玻璃防护罩来防止放射性。要对去磷酸化 RNA 的 5-prime 末端进行放射性标记，请在 10 μL 反应体积中使用 1 μL 的 T4 多核苷酸激酶和 1 μL 的 γ-P32 ATP。

将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟。通过在 65 摄氏度下加热 20 至 30 分钟来灭活 T4 多核苷酸激酶。在 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶中运行反应。

通过放射自显影定位凝胶上的 RNA，并切除含有放射性标记 RNA 的凝胶切片。用移液管吸头将凝胶切片压在微量离心管中的侧面，然后将其压碎，然后加入蛋白酶 K 缓冲液。在室温下将试管从两小时旋转到过夜。

接下来离心凝胶浆液，收集缓冲溶液，丢弃凝胶。用等体积的苯酚氯仿提取每种溶液两次。之后，用氯仿提取溶液一次。

收集水相，并向其中加入 0.1 体积的三摩尔乙酸钠 pH 5.2、载体 tRNA 或糖原和 2.5 体积的乙醇。将样品在零下 80 摄氏度下放置 1 小时。在高速微量离心机中以 16， 873 倍 g 离心样品 5 至 10 分钟。

小心地去除乙醇缓冲液，不要干扰 RNA 沉淀。用 70% 乙醇洗涤沉淀并离心 2 到 5 分钟。小心取出乙醇并风干颗粒。

每个沉淀重悬于 20 至 50 微升 DEPC 处理过的水中。在零下 20 摄氏度下储存直至使用。此处说明了由于干扰而导致的分区的概念。

在蛋白质结合过程中，RNA 分子在蛋白质结合部分和未结合部分之间分配。如果给定位置的特异性核苷酸干扰蛋白质结合，则它将被优先排除在蛋白质结合组分之外。随后，碘用于切割硫代磷酸酯掺入位点的 RNA。

要开始此程序，设置蛋白质-RNA 结合反应，每个反应含有 10 毫摩尔 Tris-HCl、1 毫摩尔 DTT、50 毫摩尔氯化钾、0.5 单位/μL RNase 抑制剂、0.09 μg/μL 乙酰化牛血清白蛋白、1 毫摩尔 EDTA、0.15 μg/μL tRNA、5-引物末端放射性标记 RNA 和 6 μL 适当浓度的蛋白质。在 25 摄氏度下孵育蛋白质结合反应 20 至 30 分钟。通过硝酸纤维素过滤器结合将蛋白质结合的 RNA 组分与未结合的组分分离。

在室温下将结合反应物涂在连接到真空歧管的硝酸纤维素过滤器上。只有 RNA 蛋白复合物会保留在过滤器上，而未结合的 RNA 流经过滤器。将含有残留放射性 RNA 的硝酸纤维素滤膜部分切成小块，放入微量离心管中，并加入足够的蛋白酶 K 缓冲液以浸入滤片。

从滤片中洗脱 RNA 2 到 3 小时或过夜。接下来，将溶液从每个试管转移到新试管中，并如前所述用苯酚氯仿和氯仿提取。收集水相，加入 0.1 体积的三摩尔乙酸钠 pH 5.2 和 2.5 体积的乙醇，并在冰箱中孵育。

如前所述离心、洗涤和干燥 RNA 后，将 RNA 重悬于 DEPC 处理过的水中。所有涉及碘的步骤都必须在排气罩中进行。要在硫代磷酸酯掺入位点切割 RNA，请在每个 RNA 样品中加入 20 微升经 DEPC 处理的水中，其中含有高达 10 微克的载体 tRNA。

在室温下孵育 5 分钟。如前所述，通过添加乙酸钠和乙醇沉淀裂解的 RNA。将裂解的 RNA 重悬于上样染料中，以使凝胶变性。

加热后，将样品加载到 15-20% 变性聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电泳分离 RNA 片段。将聚丙烯酰胺凝胶暴露于 X 射线胶片下，并使用放射自显影术检测结合部分与总池中的条带。此原理图说明了由于干扰而进行分区的概念。

在泳道 T 中，总 RNA 分数，所有掺杂位置的条带强度大致相等。在蛋白质结合的 RNA 组分中，在 1、4 和 7 位点，核苷酸对结合没有影响。然而，在位置 3 和 6，它会干扰结合并被排除在结合组分之外。

在位置 5 处，干扰是部分的。比较每个核苷酸的配对泳道可以分析所有四个核苷酸。该放射自显影显示了来自变性凝胶的两对泳道。

泳道 T 是总 RNA，泳道 B 是蛋白质结合的 RNA。垂直线标记了性致死结合位点。对于 α-硫代偶联对，条带 1、2、3 和 5 存在于总 RNA 组分中，但在结合的 RNA 组分中不存在或显著减少。

对于 α-硫代 uline 对，条带 7 和 8 在结合部分的强度相对较低。优先从结合组分中排除的残基对于蛋白质结合很重要。一旦 RNA 合成并标记 5-prime 末端，如果作得当，该技术可以在 12 小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住，硫代磷酸酯掺入的适当水平和确定结合的适当蛋白质浓度是重要的考虑因素。按照此程序，可以进行其他方法，如适当的功能测定或体内测试，以验证诱变方法的结果并了解生物学相关性。这种技术为其他更昂贵或更费力或两者兼而有之的方法提供了一种替代方案。

看完这个视频，你应该对如何设计和合成突变文库、进行结合反应、鉴定每个池中的突变核苷酸以及定量分析非野生型核苷酸在每个测试位置的影响有一个很好的了解。不要忘记，使用聚丙烯酰胺和放射性物质可能是危险的，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用手套、适当的排气和放射性防护罩。