复制集方法: 一种高通量方法定量测量秀丽线虫寿命
2018年6月29日
在这里, 我们描述了复制集方法, 一种定量测量C. 线虫寿命/生存和 healthspan 的方法, 以高通量和健壮的方式, 从而允许筛选许多条件而不牺牲数据质量。该协议详细介绍了策略, 并提供了用于分析副本集数据的软件工具。
已经确定了数百个基因，其功能会影响生物体的衰老方式。但他们的许多关系却鲜为人知。这种方法可以帮助回答老龄化领域的一个关键问题。
即，gerA 基因之间的遗传相互关系是什么？该技术的主要优点是提高了通量，可以同时定量测量的遗传倾向的数量至少增加了一个数量级。通过此程序收集的寿命数据可以使用我们随本出版物提供的软件进行绘图和分析。
除了提供对寿命的洞察外，该方法还可以应用于其他与年龄相关的表型，例如抗压性和健康计划的变化。对于此过程，请创建 RNAi 子库的新邮票。首先，使用 12 通道移液器将 96 孔板的每个孔分装，加入 200 微升含氨苄青霉素的 LB。
依次将针脚浸入 50% 漂白剂中，然后浸入超纯水中，对 96 针板复制器进行消毒。然后将尖端浸入乙醇中，并小心地燃烧尖端。接下来，小心地取下冷冻的 96 孔甘油原液库板的粘合箔盖，然后轻轻但牢固地将灭菌板复制器的尖端研磨到仍然冷冻的甘油原液的孔中。
然后接种培养物并用可渗透膜密封接种板。让培养物在工作台上生长过夜。第二天，对板复制器进行消毒，小心地从过夜培养物中取出密封，并浸入复制器针的尖端。
接下来，用针接种矩形 LB 氨苄青霉素和四环素琼脂平板。施加均匀的压力，并使用小的圆周运动来转移细菌，而不会让斑点变得太拥挤。然后，将板在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天，对于每 10 个复制板，在深孔 96 孔板的每个孔中加入 1.5 毫升含氨苄青霉素的 LB。接下来，用培养的细菌接种孔。然后，用透气膜密封板，振荡培养 20 小时。
对照孔应分散在 96 个孔中，这样当 96 孔子文库板分成 24 个一组时，每个 24 个孔的分区都有一个对照。第二天，使用吸头间距可调的 6 孔多通道移液器，将 120 微升等分试样的培养物加载到 24 孔板中。然后，将干燥板揭开在层流罩中，直到所有液体都被吸收。
不要让它们过度干燥。分装液体培养物时，请务必保持专注，以确保将正确的细菌培养物放入 24 孔板的正确孔中。复制集实验从一组独立的 24 孔复制板开始，每个板都接种了相同的细菌 RNAi 克隆。
对于寿命实验，向每个板孔中加入 15 至 20 只 L1 动物，并允许其生长至 L4 阶段。在 L4 时，FUdR 被添加到重复的所有孔中。在同一天的晚些时候，可以从集合中取出一个复制板，并作为第一个时间点进行评分。
为了评估寿命，将液体添加到板的孔中以诱导动物运动。不开始移动的动物会用蠕虫镐轻轻地刺激。然后记录动物的总数和死亡动物的数量。
然后丢弃第一次观察的板。在下一个观察时间点，从集合中取出另一个复制板，并以类似的方式评分。这将在确定的评分间隔内重复。
每次使用来自复制组的新板。继续给一组盘子打分，直到没有动物存活。首先，使用与传统寿命测定相同的基于漂白剂的制备方法同步动物种群。
然后，使用 6 孔间距可调的移液管和试剂储液槽，将 15 至 20 只 L1 动物接种到准备好的 24 孔板的每个孔中。在接种板的同时，定期将 L1 动物混合到溶液中以保持均匀分布。现在，让动物发育到 L4。对于此协议，必须知道 L4 开发的时间。
定期监控蠕虫的发育。当动物达到 L4 时，向每个孔中加入 24 微升 50x FUdR，然后将板放回培养箱中。使用 L4 动物至关重要。
如果雌雄同体在添加 FUdR 之前达到生殖成熟，它们的后代将存活下来并吃掉食物。相反，过早添加 FUdR 会导致动物破裂。在所需的时间点，使用一个复制板来评估活力。
为此，请用 M9 溶液淹没井。在每天对活力进行评分之前，对任何没有食物、似乎受到污染或有形态或发育缺陷的动物的孔进行传感器检测。对于每个孔，记录每个孔的动物总数，并通过用蠕虫镐轻轻触摸每个蠕虫的头部来检查不移动蠕虫的状态。
清点盘子中所有不移动的死者后，丢弃盘子。对于此过程，生长转换后的 e。大肠杆菌在含有氨苄青霉素的 LB 中过夜。
第二天，以 3， 000 G 离心 15 至 20 分钟，浓缩细菌。将细菌重悬于起始体积的 1/10 中。接下来，将 200 微升 10x 细菌分装到 6 厘米的平板上。
每个测试条件准备 3 或 4 块板，并包括 2 块额外的板以防污染。以层流分批方式干燥板，直到所有液体都被吸收或蒸发。干燥后，将板在塑料盒中室温下存放过夜，以诱导双链 RNA 的产生。
然后，将板在 4 摄氏度下存放长达两周。对于动物，在 M9 中收集怀孕的成年动物。用 M9 清洗两次。在吸取时重复旋转。然后，将秀丽隐杆线虫重悬于 4 毫升 M9 中，并加入 2 毫升次氯酸盐溶液。
现在，立即将蠕虫涡旋三分钟，并定期剧烈摇晃。然后，在解剖显微镜下，寻找一团鸡蛋。如果没有看到云，请再将蠕虫涡旋 10 到 20 秒。
接下来，像以前一样，用 M9 快速清洗鸡蛋两次。并将洗净的鸡蛋重悬于 3 毫升 M9 中。然后，将鸡蛋转移到一个新的 15 毫升试管中，并在 20 摄氏度下轻轻旋转孵育试管，让胚胎孵化过夜。第二天，通过计算每微升 L1 的平均数量（分 3 次 10 微升滴）来确定制备的 L1 溶液的密度。
在制备的细菌种子板中，每个放置 50 只 L1 动物。将板放在 20 摄氏度的培养箱中，直到胚胎发育到 L4 阶段。从 L1 到 L4 的正常发育大约需要 40 小时。
然后，为防止后代产生，向每个板中加入 160 微升 50x FUdR。然后去除雄性，因为寿命通常只用雌雄同体来衡量。完成后，将板重新填充到 20 摄氏度的培养箱中。
直到所有蠕虫都死了，每天对它们的生存能力进行评分。为此，请用铂丝或睫毛轻轻触摸头部上每个不动的线虫。无反应的动物已经死亡，必须从板中取出。
记下此例程中的任何异常。复制集和测定秀丽隐杆线虫寿命的传统方法对野生型 N2 动物产生相似的结果。例如，基于饲养的 mml-1 或 mxl-2 的 RNAi 敲低显著降低了正常寿命。
这是通过传统的寿命测定和复制集测定来测量的。还可以检测到延长寿命。如图所示，当使用任一方法测量时，mdl-1 或 mxl-1 的 RNAi 显著延长了秀丽隐杆线虫的寿命。
使用副本集方法，可以同时量化 100 多种条件下的寿命变化，这对于更传统的方法来说是不合理的。例如，基于全基因组喂养的 RNAi 筛选确定了 159 个基因，这些基因是通过减少 daf-2 胰岛素样信号转导来延长寿命所必需的。通过测量动物的健康寿命，进一步描述了胰岛素样信号传导与这些基因之间的关系。
健康由 c. Elegans 悬浮在溶液中时抽打表示。看完这个视频，您应该对如何使用基于饲养的 RNAi 来测量秀丽隐杆线虫的寿命有一个很好的了解。
但 RNAi 用途广泛，可应用于许多不同的表型。一旦掌握了，如果执行得当，replica set 方法可以每天评估超过 100 个 RNAi 克隆的寿命。早期和晚期时间点可以快速得分。
井里的所有动物要么是活的、移动的，要么是死的。当动物开始死亡时，评分花费的时间最长。考虑到这一点，错开独立试验的设置。
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概览
本文介绍了复制集方法，这是一种用于定量测量秀丽隐杆蚯蚓寿命和健康寿命的高吞吐量方法。它能够在保持数据质量的同时筛选各种条件，并由用于分析的软件工具支持。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 衰老研究
背景
- 许多基因影响衰老，但它们之间的相互关系尚不明确。
- 复制集方法提高了基因扰动的吞吐量。
- 这种技术允许同时定量测量寿命数据。
- 提供了用于数据分析的软件。
研究目的
- 探索gerA基因之间的遗传关系。
- 提供一种用于测量寿命和健康寿命的稳健方法。
- 增强对衰老机制的理解。
使用的方法
- 用于寿命测量的复制集方法。
- 基因条件的高吞吐量筛选。
- 使用提供的软件工具进行数据分析。
- 健康寿命的定量评估。
主要结果
- 基因扰动的吞吐量增加。
- 有效收集定量的寿命数据。
- 软件便于详细分析结果。
- 关于影响衰老的遗传关系的见解。
结论
- 复制集方法是衰老研究的宝贵工具。
- 它允许对寿命中的遗传因素进行全面分析。
- 这种方法可以导致对衰老过程的更好理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Replica Set method enables high-throughput, quantitative measurement of Caenorhabditis elegans lifespan and healthspan, supporting large-scale genetic screening and functional target validation in aging research. By allowing simultaneous assessment of over 100 genetic perturbations, this approach accelerates hypothesis testing and de-risks early discovery decisions. Its robust, reproducible outputs facilitate confident portfolio triage and prioritization in preclinical model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of genetic pathways influencing organismal aging.
- Supports functional validation of candidate targets through quantitative lifespan and healthspan readouts.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying gene-phenotype relationships at scale.
- Provides robust data for predictive confidence in early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, high-throughput biological systems for compound or genetic screening workflows.
- Standardizes assay conditions and scoring, improving reproducibility and minimizing handling artifacts.
- Delivers quantitative survival and healthspan metrics suitable for downstream analytics.
- Enables scalable screening of RNAi clones or other perturbations across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical model outputs with disease-relevant phenotypes such as stress resistance and healthspan.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical validation of aging-related targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement of candidate interventions in aging pathways.
- Enhances predictive value for translational biomarker development when supported by phenotype alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The Replica Set method integrates into the discovery continuum from early genetic screening through preclinical model validation, enabling rapid, quantitative assessment of gene function and intervention effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling parallel analysis of genetic perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible systems with quantitative outputs for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides survival curves, healthspan metrics, and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects genetic findings to preclinical phenotypes relevant to aging and stress resistance.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform adaptable to diverse genetic or compound screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for genetic and phenotypic assays.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of aging-related targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, genetic perturbation, and phenotypic scoring.
- Utilizes standard laboratory instrumentation and multi-well plate infrastructure.
- Demands cross-team standardization of scoring and data analysis protocols.
- Adaptable to various genetic libraries and phenotypic endpoints relevant to aging research.
- Dependent on robust data management and statistical analysis tools for high-throughput outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Replica Set Method for Scoring C. elegans Longevity: Preparing the Plates
3:33
Replica Set Method for Scoring C. elegans Longevity
6:33
Traditional Method for Scoring C. elegans Longevity
9:48
Results: Sensitivity and Application of Replica Set Lifespan Analysis
11:13
Conclusion
