Name: 复制集方法: 一种高通量方法定量测量秀丽线虫寿命 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 了解复制集方法，一种高通量定量测量秀丽线虫寿命与健康寿命的技术。该方法可同时筛选多种遗传条件，显著提升实验效率，并配备专用软件进行数据分析，助力衰老机制研究。

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本研究工作得到了以下机构的资助：罗切斯特大学教务长办公室及医学与牙科学院院长办公室，通过健康科学计算创新中心（HSCCI）提供；艾略特医学基金会老龄化新学者奖学金（AG-NS-0681-10）。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2000).</li>
<li>Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SID-2+is+required+for+environmental+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).</li>
<li>Grishok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+mechanisms+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).</li>
<li>Ceron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Improving+Caenorhabditis+elegans+Phenome+Mapping+With+an+ORFeome-Based+RNAi+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library.</a> Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Petrascheck, M., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Analysis+of+Lifespan+Experiment+Reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility.</a> Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+Genes+Regulating+Longevity+Using+Enhanced+RNAi-sensitive+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from:
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<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
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<li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li>
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<li>Ogg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fork+head+transcription+factor+DAF-16+transduces+insulin-like+metabolic+and+longevity+signals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans.</a> Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).</li>
<li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+tied+to+endocrine%2C+metabolic%2C+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
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<li>Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worming+pathways+to+and+from+DAF-16%2FFOXO%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Worming pathways to and from DAF-16/FOXO.</a> Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).</li>
<li>Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16%3A+An+HNF-3%2Fforkhead+family+member+that+can+function+to+double+the+life-span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans.</a> Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).</li>
<li>Hosono, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+growth+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+by+5-fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine.</a> Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).</li>
<li>Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Yu, S., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+signaling+comes+of+age%3A+Promotion+of+healthy+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).</li>
<li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormScan%3A+A+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormFarm%3A+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

传统方法和复制集方法均需要同步时间老化动物。我们介绍一种利用次氯酸盐处理怀卵成虫以实现动物同步的方法，其中只有受精卵随怀卵成虫在处理中存活。这些胚胎在液体悬浮中孵化，并在第一幼虫期（L1）发育停滞。将L1期动物接种至食物上后例如 E. coli 通过表达目标基因的双链RNA（dsRNA），动物恢复发育。采用次氯酸盐处理 gravid 成虫以同步L1期动物的优势在于，剩余未接种的L1期动物可长期冷冻保存于液氮或-80 °C冰箱中。通过这种方式，可保留实验设置时每种品系的样本，为后续研究提供宝贵资源，并提高实验的可重复性。然而，尽管对gravid成虫进行次氯酸盐处理是获得同步化动物常用于衰老研究的方法22，L1期停滞是一种饥饿应答。因此，一些实验室倾向于让孵化过程直接在培养板上进行，或者完全省去次氯酸盐处理步骤，而是让少数几条性成熟的成虫在培养板上产卵数小时（即 产卵）。在后一种情况下，移除亲本并追踪子代的寿命。据我们所知，目前尚未报道在M9中同步、在培养板上孵化或通过产卵获得的子代动物之间存在明显的寿命差异。然而，由于营养可利用性的变化与...

理解衰老遗传基础最具变革性的技术进步之一是基于喂食的RNAi技术的发展 秀丽隐杆线虫1；在RNAi技术应用于实验之前，许多衰老表型在遗传学上难以进行研究。基于喂食的RNAi技术是通过在体内产生dsRNA实现的 E. coli 与之匹配的 内源性 秀丽隐杆线虫 mRNA：IPTG 诱导跨越任一插入片段的双向转录 秀丽隐杆线虫 cDNA 或质粒中的开放阅读框片段2。当 秀丽隐杆线虫 以完整的为食 大肠杆菌， 细菌产生的dsRNA通过SID-2跨膜蛋白从肠腔转运至肠细胞内3，然后通过SID-1在动物体内其余部分进行分布4在每个细胞内，外源性dsRNA被Dicer复合物加工成siRNA，siRNA通过碱基互补配对与成熟的mRNA结合，形成新的siRNA-mRNA双链。该双链被RISC复合物识别并切割，从而导致内源性mRNA降解5因此，只需更换质粒中的插入片段，即可使几乎任何基因的功能失活 秀丽隐杆线虫 基因组。这一发现促成了多个基于喂食的RNAi文库的建立——这些文库是转化后的 E. coli 可组合使用的品系，能够覆盖已知基因型的大约86% 秀丽隐杆线虫 基因6,7.
随着基于摄食的RNA干扰（RNAi）技术的发展，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行的大规模筛选已发现了超过900个在失活后能够改变寿命的基因（这些基因与RNAi表型的关联信息已被收录于WormBase数据库中），我们将这些基因称为“衰老相关基因”（gerogenes）。其中大多数衰老相关基因在寿命调控中的作用，仅通过少数几项具有里程碑意义的研究，借助基于摄食的RNAi技术便得以揭示（详见图1A和补充文件1）。在某些情况下，这些衰老相关基因的鉴定仅依赖于在单个或少数几个时间点测量存活率，因而无法对RNAi处理引起的寿命变化提供可量化的评估。而在另一些情况下，这些基因的寿命变化已被定量分析，同时还评估了其他与年龄相关的表型。例如，我们先前鉴定出159个基因，它们对于胰岛素/IGF-1信号通路减弱的动物维持正常寿命及延长寿命均是必需的，并对其健康寿命（healthspan）的变化进行了量化。其中，有103个基因的失活会导致早衰表型，因为其缺失引发了一种或多种早衰迹象8。
尽管某些衰老相关基因已与100多项研究相关联（例如 daf-16、daf-2、sir-2.1），超过400个衰老相关基因的引用次数为10次或更少（图1B，以及 补充文件 2因此，尽管全面的基于喂养的RNAi筛选已发现并初步表征了数百个假定的衰老相关基因（gerogenes），但这些基因在寿命调控中的具体功能，以及它们编码产物之间的遗传相互关系仍缺乏深入研究。对衰老相关表型进行完整的纵向分析是揭示衰老相关基因之间遗传相互作用的前提。例如 上位性相互作用，合成致死相互作用 等等）。要更深入地了解衰老相关基因之间的遗传相互关系，需要一种高通量的定量方法，同时充分利用基于喂食的RNA干扰技术的优势。
衰老最常用的替代指标是寿命。测量寿命的传统方法 秀丽隐杆线虫 死亡率监测在小规模种群样本中随时间追踪个体动物的死亡情况。通过随时间推移对相对少量的动物进行定期观察，使用铂金丝或睫毛轻轻触碰，以运动反应作为存活的指标图 2A）。该方法已被广泛使用，因其可直接、简便地测量平均寿命和最大寿命。然而，这种传统方法耗时较长且通量相对较低，限制了在受控条件下可同时测量的动物数量和实验条件数目。最近的一项模拟研究发现，许多 秀丽隐杆线虫 寿命研究未检测足够数量的动物，因此无法可靠地检测不同条件之间的微小差异9此外，这种传统方法需要在一段时间内反复操作同一批动物，这可能引入污染，并可能损伤或杀死因衰老而日益脆弱的动物。
我们开发了一种用于测量 C. elegans 寿命的替代性&#34;重复组&#34;方法。具体而言，将大量年龄同步且基因型一致的动物群体划分为若干个小群体（即重复组）。生成足够数量的重复样本，以覆盖实验计划中的每个时间点。在每个观察时间点，对其中一个重复组进行评分，记录存活、死亡及删失动物的数量，随后丢弃该重复组中的所有动物。因此，在整个群体预期寿命期间，定期对一系列独立的亚群体进行取样（图2B）。采用重复组方法可避免对动物的反复触碰，也避免了反复暴露于潜在环境污染物的风险。每个时间点的存活状态评估完全独立于其他任何观察，从而最大限度地减少了操作干扰，并使通量至少提高了一个数量级。该方法使我们能够同时定量分析数百个RNAi克隆对寿命的影响8,10。
本文介绍了进行的详细方案 秀丽隐杆线虫 通过复制平板法和传统评分方法测定寿命 秀丽隐杆线虫 寿命。我们证明了这两种方法获得的结果相似。我们开发了软件，以协助对通过任一方法生成的寿命数据进行图形化分析，该软件我们依据 GPL V3 许可证免费提供（见 材料清单). &#34;WormLife&#34; 使用 R 语言编写11，包含用于绘制数据的图形用户界面（GUI），已在 Mac OS 和 Linux 系统中进行测试。最后，我们比较并分析了每种方法的局限性，并强调了在选择用于测量定量变化的方法时需考虑的其他因素 秀丽隐杆线虫 寿命

<table><tbody><tr><td>IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>FuDR（5-氟-2'-脱氧尿苷）</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>矩形未处理单孔板，128×86 mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>600 &amp;micro;L 96孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>透气性板封膜</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>96针平板复制器</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>HT115细菌中的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库—Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>另见 Kamath 等，Nature 2003。</td></tr><tr><td>HT115细菌中的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库—Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>另见 Rual 等，Genome Research 2004。该文库亦可从 Dharmacon 获得。</td></tr><tr><td>WormLife—用于复制组生存分析的软件</td><td>Samuelson 实验室</td><td>N/A</td><td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife</td></tr><tr><td>L4440 空载体质粒</td><td>Addgene</td><td>1654</td><td>https://www.addgene.org/1654/</td></tr><tr><td>Wormbase</td><td></td><td></td><td>http://www.wormbase.org/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>OASIS</td><td></td><td></td><td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

复制集方法是一种用于定量测量寿命或存活率的方法 秀丽隐杆线虫 以高通量方式处理线虫，从而使单个研究人员在相同时间内能够筛选更多处理条件或实验组，且不损失数据质量。该方法仅需大多数从事线虫研究的实验室中常见的设备 秀丽隐杆线虫 因此易于采用。该方法的核心在于，在每个观察时间点检测群体中的独立样本，而非像传统纵向方法那样对同一样本进行长时间追踪。评分过程包括向多孔板的孔中加入液体，以刺激 秀丽隐杆线虫 以促进移动并便于量化健康寿命的变化。复制平板法的其他主要优点包括减少了琼脂表面暴露于空气污染物的机会（例如 霉菌或真菌污染）、对动物操作最少化，以及对偶发性评分错误（例如将仍存活的动物误判为死亡）具有较强容错性。为了适当地分析和可视化复制集（Replica Set）实验的数据，还开发了一款定制软件工具。该软件目前的功能包括绘制复制集实验和传统（Kaplan-Meier）实验的生存曲线，以及对复制集数据进行统计分析。本文提供的实验方案描述了传统的实验方法和复制集方法，并概述了相应的数据分析流程。

在任何新方法的开发过程中，必须确保该新方法能够重现以往方法所获得的公认结果，并达到领域内的标准。我们此前已通过实验表明，Replica Set 方法与传统的检测方法在测定结果上具有可比性 C. elegans 寿命产生相似的结果20野生型 C. elegans (N2) 在以下条件下培养： 20 °C 通常存活20至25天，我们在传统方法中均观察到了这一现象（图 4A，黑线）和复制集方法（图 4B，黑色）。因此，这两种方法均能合理地近似野生型寿命。此外，一种新方法必须具备足够的分辨率以准确量化不同测试条件之间的变化，并具有足够的统计功效来检测出显著差异。在我们之前的研究中，我们发现Myc转录因子家族是决定因素 C. elegans 寿命 mml-1 和 mxl-2 编码 C. elegans 分别是哺...

本文介绍了复制集（Replica Set）方法，这是一种以高通量且稳健的方式定量测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命/存活率及健康寿命的技术，从而能够在不牺牲数据质量的前提下筛选多种实验条件。本实验方案详细阐述了该方法的实施策略，并提供了一套用于分析复制集数据的软件工具。

复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

复制集方法是一种以高通量方式定量测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命或存活率的方法，因此……

已有数百个基因被发现其功能会影响生物体的衰老过程，但其中许多基因之间的关系仍不清楚。该方法有助于回答衰老研究领域的一个关键问题。即，gerA 基因之间的遗传相互关系是什么？该技术的主要优势在于通量的提升，可同时进行定量测量的遗传扰动数量至少提高了一个数量级。采用本方法收集的寿命数据，可使用本文随附提供的软件进行绘图和分析。除了可用于研究寿命外，该方法还可应用于其他与年龄相关的表型，例如应激抗性以及健康状况的变化。对于本实验步骤，需制备一份新的RNAi亚文库的平板。首先，使用12通道移液器将含氨苄青霉素的LB培养基各200微升分装至96孔板的每个孔中。将96针平板复制器依次浸入50%次氯酸钠溶液中，随后浸入超纯水中，以对针头进行灭菌。然后将针尖浸入乙醇中，并小心地用火焰灼烧针尖。接着，小心移除冷冻的96孔甘油保存库板的粘性封口膜，将已灭菌的平板复制器针尖轻轻但牢固地压入仍处于冷冻状态的甘油保存孔中。然后接种培养物，并用透气膜密封接种好的平板。将培养物置于实验台面上过夜培养。次日，对平板复制器进行灭菌处理，小心移除过夜培养物的密封膜，将复制器针头浸入培养物中。接下来，用接种针接种含有氨苄青霉素和四环素的矩形 LB 琼脂平板。施加均匀压力，并采用小范围的环形动作转移细菌，避免菌落过于密集。随后，将平板在 37 摄氏度下过夜培养。第二天，每需要10块复制平板，向一个深孔96孔板的每个孔中加入1.5毫升含氨苄青霉素的LB培养基。接着，将培养的细菌接种至各孔中。然后，用透气膜密封该板，在振荡条件下培养20小时。对照孔应分散分布在96孔板中，使得当96孔次级文库板被分为每组24孔时，每组24孔中均包含每种对照各一个。次日，使用带可调枪头间距的六通道移液器，将120微升的培养物等分试样加入24孔板中。然后，将板置于超净工作台中敞口干燥，直至所有液体被完全吸收。切勿让其过度干燥。在分装液体培养物时，务必保持注意力集中，以确保将正确的细菌培养物加入24孔板中的相应孔内。复制组实验始于一组独立的24孔重复培养板，每块板均接种相同的细菌RNAi克隆。进行寿命实验时，每个孔中加入15至20只L1期动物，使其生长至L4期。在L4期时，向所有重复组的孔中加入FUdR。同一天的晚些时候，可从该组中取出一个重复板，作为第一个时间点进行计数。为了评估寿命，向培养板的孔中加入液体以诱导动物运动。对未开始运动的动物，用线虫挑针轻轻触碰刺激。随后记录动物总数以及死亡动物数量。首次观察后的培养皿随即弃用。在下一次观察时间点，从培养皿组中取出另一份重复样品，以相同方式评分。此过程按照预定的评分间隔重复进行。每次使用复制组中的新培养板。持续评分一组培养板，直至无存活动物为止。首先，采用与传统寿命测定实验相同的基于次氯酸钠处理的制备方法，同步化动物群体。然后，使用六孔可调间距移液器和试剂储液槽，将15至20只L1期动物接种到已准备好的24孔板的每个孔中。在接种过程中，需定期混匀L1期动物悬液，以保持分布均匀。接着，让动物发育至L4期。本实验方案必须明确掌握L4期发育的时间。定期观察线虫的发育情况。当线虫发育至L4期时，向每孔加入24 µL的50倍浓缩FUdR溶液，并将培养板放回培养箱。使用L4期的线虫至关重要。如果雌雄同体在线虫达到生殖成熟之前加入氟脱氧尿苷（FUdR），其子代将存活并摄食食物。相反，过早加入FUdR会导致线虫破裂。在预定的时间点，使用一个重复平板来评估存活率。为此，用 M9 溶液浸没孔板。每天评估存活率之前，剔除无食物、出现污染或含有形态学或发育缺陷个体的孔。记录每个孔中的线虫总数，并用线虫挑针轻轻触碰头部，检查不移动线虫的状态。计数完培养皿中所有不移动的死亡个体后，弃去该培养皿。进行此操作时，需将转化后的 e. Coli 在含氨苄青霉素的 LB 培养基中过夜培养。第二天，将细菌在 3,000 ×g 条件下离心 15 至 20 分钟进行浓缩。用起始体积 1/10 的溶液重新悬浮细菌。接着，将 200 微升的 10 倍浓缩细菌分装至六厘米培养皿中。每种测试条件准备三到四个平板，并额外准备两个平板以备污染时使用。将平板置于超净工作台中干燥，直至所有液体被吸收或蒸发。干燥后，将平板置于塑料盒中，在室温下存放过夜，以诱导双链RNA的产生。然后，将培养板在4°C下保存最多两周。对于线虫，用M9缓冲液收集带有卵的成虫，用M9缓冲液洗涤两次，每次均重复离心并吸除上清。随后，将秀丽隐杆线虫（C.elegans）重悬于4 mL M9缓冲液中，并加入2 mL次氯酸盐溶液。现在，立即将线虫涡旋振荡3分钟，并周期性地剧烈震荡。然后，在解剖显微镜下观察是否有成团的卵出现。如果未观察到卵团，则继续将线虫涡旋振荡额外10至20秒。接下来，用M9快速清洗卵，重复两次，方法同前。然后将清洗后的卵重悬于3毫升M9中。接着，将卵转移至一个新的15毫升离心管中，在20°C下轻轻旋转孵育，并让胚胎过夜孵化。第二天，通过计算三个10微升液滴中每个微升L1期幼虫的平均数量，确定所制备L1溶液的密度。将制备好的接种细菌的培养皿中分别放入50只L1期动物，在20°C培养箱中培养，直至胚胎发育至L4期。从L1期发育至L4期的正常发育过程约需40小时。然后，为了防止子代产生，向每个培养板中加入 160 微升 50 倍浓度的 FUdR。接着移除雄性个体，因为寿命测定通常仅针对雌雄同体进行。操作完成后，将培养板重新放回 20 °C 的培养箱中。在所有线虫死亡之前，每天对它们的存活情况进行评分。操作时，用铂金丝或睫毛轻轻触碰每个不移动的线虫头部。无反应的个体视为已死亡，需从培养皿中移除。在本实验过程中，注意记录任何异常情况。使用复制平板法和传统方法检测野生型 N2 动物的秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命时，结果相似。例如，通过饲喂法进行 RNAi 沉默 mml-1 或 mxl-2 基因，可显著缩短正常寿命。这通过传统的寿命测定实验和复制平板实验两种方法进行了测量。也可以检测到寿命的延长。如图所示，无论采用哪种方法测定，对 mdl-1 或 mxl-1 进行 RNAi 均显著延长了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命。利用复制平板法，可以同时量化超过100种条件下寿命的变化，而采用更传统的方法则难以实现。例如，一项基于喂食的全基因组RNAi筛选鉴定出159个基因，这些基因对于因降低daf-2类胰岛素信号通路而延长的寿命至关重要。通过测量动物的健康寿命，进一步阐明了类胰岛素信号通路与这些基因之间的关系。健康状况通过秀丽隐杆线虫（C. elegans）在溶液中悬浮时的摆动情况来判断。观看本视频后，您应充分了解如何利用基于摄食的RNAi技术来测定秀丽隐杆线虫的寿命。但RNAi具有多功能性，可应用于多种不同的表型。一旦掌握，若操作得当，利用复制平板法每天可评估超过100个RNAi克隆的寿命。早期和晚期时间点均可快速评分。孔板中的所有动物要么存活且能够活动，要么已经死亡。当动物开始死亡时，评分所需时间最长。因此，在安排独立实验时，应考虑到这一点，错开实验设置时间。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

复制集方法: 一种高通量方法定量测量秀丽线虫寿命

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测量 秀丽隐杆线虫 96孔微孔板中的寿命测定

本视频介绍了一种传统的基于平板的测量秀丽隐杆线虫（C.

寿命分析：测量 C. elegans 的寿命

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。...

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

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一种在Caenorhabditis elegans中进行高通量化学筛选的简单方法

蛋白质稳态的衰退是衰老的一个标志，会促进神经退行性疾病的发生。我们提出了一种实验方案，通过异源表达与荧光报告蛋白融合的多聚谷氨酰胺重复序列，定量测量两种不同组织中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

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使用寿命机进行高通量行为衰老与寿命分析

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通过测量细菌清除率定量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的食物摄入量

本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统能够在模式BY-2体系中实现大规模平行的基因表达与功能研究，且该技术有望拓展应用于非模式作物。...

一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

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复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

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