Name: Bioprintable 藻酸盐/明胶水凝胶 3D体外模型诱导细胞球形形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 20 s
Description: 学习利用藻酸盐/明胶水凝胶生物打印技术构建乳腺癌三维体外模型，研究肿瘤细胞与基质细胞的相互作用机制。该方法成本低、可重复性高，有助于深入理解肿瘤发生发展过程。

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陶江感谢中国国家留学基金管理委员会（201403170354）和麦吉尔大学工程博士奖学金（90025）提供的奖学金资助。Jose G. Munguia-Lopez 感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT，项目编号 250279、290936 和 291168）以及魁北克自然科学与技术研究基金会（FRQNT，项目编号 258421）提供的奖学金资助。Salvador Flores-Torres 感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT，项目编号 751540）提供的奖学金资助。Joseph M. Kinsella 感谢加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大创新基金会、Townshend-Lamarre 家族基金会以及麦吉尔大学提供的经费支持。我们感谢 Allen Ehrlicher 允许我们使用他的流变仪，Dan Nicolau 允许我们使用他的共聚焦显微镜，以及 Morag Park 为我们提供荧光标记细胞系的使用权限。

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作者无任何利益冲突需要披露。

含细胞结构可能在工艺过程中的任何阶段因污染（生物或化学污染）而受损。通常，生物污染在培养两到三天后表现为培养基或生物打印结构的颜色变化。因此，灭菌（物理和化学消毒）是所有与细胞相关操作的关键步骤。值得注意的是，明胶经高压灭菌后会改变其凝胶特性，导致我们在实验中观察到其凝胶速度变慢。因此，我们对海藻酸钠和明胶粉末进行了灭菌处理。 通过 紫外线照射。由于紫外线的穿透能力非常有限，只能作用于极薄的一层（&#60; 应使用0.5 mm的喷头。海藻酸钠和明胶的浓度可根据需要任意调整，以调节材料的力学和生物学性能32在本研究中，我们选择了A3G7，因为它在其可打印时间窗口内具有理想的可打印性，且交联后的水凝胶在30天实验期间表现出高稳定性。将明胶粉末溶于DPBS时加热至60 °C有助于促进明胶的液化，从而便于搅拌。也可使用较低温度，但需要更长的搅拌时间。
流变学温度扫描显示溶胶-凝胶转变点为 30.6 °C，与其他文献报道结果一致33。理论上，任何高于 30.6 °C 的温度均可使...

尽管二维细胞培养在癌症研究中被广泛应用，但其存在局限性，因为细胞以单层形式生长，营养物质和氧气浓度均一。这类培养体系缺乏天然肿瘤微环境（TME）中存在的关键细胞间及细胞与基质间的相互作用。因此，这些模型难以真实模拟生理条件，导致细胞行为异常，包括形态不自然、受体分布紊乱、膜极性改变以及基因表达异常等多种情况1,2,3,4另一方面，三维细胞培养技术通过在立体空间中以细胞聚集体、球状体或类器官的形式扩增细胞，提供了一种可构建更精确模型的替代方法 体外 环境以研究细胞生物学和生理学的基本问题。3D细胞培养模型还可促进细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，这种相互作用是原生肿瘤微环境（TME）的关键生理特征 体外1,4,5新兴的3D生物打印技术为构建模拟异质性肿瘤微环境的模型提供了可能。
3D生物打印技术源于快速成型技术，能够制造出可模拟某些活体组织样本复杂性的3D微结构6,7目前的生物打印方法包括喷墨打印、挤出打印和激光辅助打印8其中，挤出法可通过将不同类型的材料精确定位在初始位置不同的区域，从而在打印的基质中控制异质性。因此，该方法是制备异质结构的最佳途径 体外 涉及多种细胞或基质的模型。挤出式生物打印已成功用于构建耳廓形状的支架9血管结构10,11,12以及皮肤组织13，从而实现高打印保真度和细胞活性。该技术还具有材料选择多样、可沉积含有已知密度包埋细胞的材料以及高重复性等优势。14,15,16,17天然和合成水凝胶因其生物相容性、生物活性以及可被设计成在结构上模拟细胞外基质（ECM）的亲水性网络，常被用作3D生物打印的生物墨水7,18,19,20,21,22,23水凝胶还具有多种优势，因其可包含细胞黏附位点、结构组分、对营养物质和气体的通透性，以及适宜的机械性能，从而促进细胞生长发育。24例如，胶原蛋白水凝胶可为细胞提供整合素锚定位点，使其能够附着于基质。明胶是变性的胶原蛋白，仍保留类似的细胞黏附位点。相比之下，海藻酸盐具有生物惰性，但可通过与二价离子交联而提供机械稳定性。25,26,27,28.
在本研究中，我们开发了一种由海藻酸盐和明胶组成的复合水凝胶作为生物墨水，其微观结构类似于天然肿瘤间质。将乳腺癌细胞和成纤维细胞包埋于该水凝胶中并进行打印。 通过 基于挤出的生物打印机构建模拟的三维模型 体内 微环境。这种人工构建的三维环境可使癌细胞形成长期培养下仍具有高存活率的多细胞肿瘤球（MCTS）。&#62; 30天）。本实验方案展示了复合水凝胶的合成方法、材料微观结构与可打印性的表征、细胞异质模型的生物打印，以及多细胞球（MCTS）形成过程的观察。这些方法同样可应用于挤出式生物打印中的其他生物墨水，以及具有不同设计的异质组织模型，有望用于药物筛选、细胞迁移实验及细胞基本生理功能的相关研究。

<table><tbody><tr><td>海藻酸钠</td><td>FMC BioPolymer</td><td>CAS编号: 9005-38-3</td><td>Protanal LF 10/60 FT</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>牛皮来源B型明胶</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS 1X）</td><td>Gibco</td><td>LS14190136</td><td>1&amp;times;，无钙，无镁</td></tr><tr><td>磁力加热搅拌器</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>搅拌器/加热板型号 PC-420</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>352098</td><td>Falcon&amp;reg; 50 mL 高透明度聚丙烯离心管，锥底，无菌</td></tr><tr><td>离心机</td><td>GMI</td><td>N/A</td><td>Sorvall RT6000D，GMI，美国</td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 0.22 &amp;micro;m 滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Millex-GS 注射器滤器单元，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m，混合纤维素酯，33&amp;nbsp;mm，环氧乙烷灭菌</td></tr><tr><td>振荡流变仪 MCR 302</td><td>Anton Paar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>流变仪测量工具 CP25</td><td>Anton Paar</td><td>79038</td><td>流变仪用锥形板几何结构</td></tr><tr><td>RheoCompass</td><td>Anton Paar</td><td>N/A</td><td>控制流变仪 MCR 302 的软件</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td>SEM，Hitachi SU-3500 变压</td></tr><tr><td>多聚甲醛，96%，超纯</td><td>Acros Organics</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌溶液（100X）稳定型</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养 T-75 培养瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 表面经组织培养处理</td></tr><tr><td>3D 生物打印机 BioScaffolder 3.1</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GeSim 软件</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td>控制 BioScaffolder 3.1 的软件</td></tr><tr><td>10 cc 筒，抗紫外</td><td>EFD Nordson</td><td>7012126</td><td></td></tr><tr><td>端盖</td><td>EFD Nordson</td><td>7014472</td><td></td></tr><tr><td>喷嘴盖</td><td>EFD Nordson</td><td>7014469</td><td></td></tr><tr><td>活塞&amp;nbsp;</td><td>EFD Nordson</td><td>7012182</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢喷嘴 G25</td><td>EFD Nordson</td><td>7018345</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>生物试剂，适用于分子生物学</td></tr><tr><td>Costar 6 孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>经组织培养处理的多孔板，独立包装，无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>共聚焦转盘倒置显微镜</td><td>Olympus Life Science</td><td>N/A</td><td>Olympus IX83</td></tr><tr><td>MTS 检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>CellTiter 96&amp;reg; AQueous&amp;nbsp;One 溶液细胞增殖检测试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>活/死细胞活力与细胞毒性检测试剂盒</td><td>Molecular Probes,ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 0.25/EDTA 1X</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 孔板</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板，独立包装，带低蒸发盖，无菌</td></tr><tr><td>高压灭菌器 Tuttnauer</td><td>Heidolph Brinkmann</td><td>N/A</td><td>Heidolph Tuttnauer 2540E 高压灭菌器电子型号，带4个不锈钢托盘，23L容量</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>T10282</td><td>0.4% 溶液</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EA95</td><td>Greenfield Specialty Alcohols</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td>MCO 19AIC-PA</td></tr><tr><td>冷冻干燥机&amp;nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td>Virtis Sentry 2.0</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>用于构建演示性螺旋桨状模型的CAD软件</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td>N/A</td><td>用于为 BioScaffolder 3.1 生成 G 代码的编程软件</td></tr></tbody></table>

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3d 体外 模型系统诱导细胞球体形成

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

原代肿瘤微环境在细胞、生化和生物物理层面具有高度异质性，而传统的二维（2D）细胞培养方法使用永生化癌细胞系无法重现这一复杂特性。通过生物打印技术构建包含多种细胞类型的异质性三维（3D）肿瘤模型，可有效克服上述局限。海藻酸钠和明胶是生物打印中最常用的两种生物材料，因其具备良好的生物相容性、仿生特性及机械性能。通过结合这两种聚合物，我们成功制备出一种可生物打印的复合水凝胶，其微观结构与天然肿瘤间质具有相似性。我们对这种复合水凝胶的可打印性进行了研究。 通过 流变学并获得了最佳打印窗口。将乳腺癌细胞和成纤维细胞包埋于水凝胶中，打印形成模拟的三维模型 体内 微环境。该生物打印的异质模型实现了长期细胞培养的高存活率（&#62; 30天）并促进乳腺癌细胞自组装形成多细胞肿瘤球体（MCTS）。在该模型中，我们观察了癌相关成纤维细胞（CAFs）与MCTS之间的迁移及相互作用。通过将生物打印的细胞培养平台用作共培养系统，为研究肿瘤发生对间质成分的依赖性提供了独特的工具。该技术具有高通量、低成本和高重复性的特点，还可作为传统单层细胞培养和动物肿瘤模型的替代方案，用于癌症生物学研究。

温度扫描显示 A3G7 前驱体在 25 °C 和 37 °C 下存在显著差异。前驱体在 37 °C 时呈液态，其复数黏度为 1938.1 ± 84.0 mPa·s，且 G" 大于 G'，验证了其流动性。随着温度降低，明胶分子自发物理缠结形成三螺旋结构，前驱体发生物理凝胶化29,30。G' 和 G" 均随温度下降而上升，并在 30.6 °C 时趋于收敛，表明发生了溶胶-凝胶转变。模量继续随温度降低而增加，在 25 °C 时达到 G' = 468.5 ± 34.2 Pa 和 G" = 140.7 ± 9.3 Pa（图 1a）。根据温度扫描结果，我们选择 25 °C 作为打印温度。凝胶动力学实验模拟了样品制备和操作过程中经历的温度变化（即将样品从 37 °C 水浴中取出并放入 25 °C 生物打印腔室）。在较低温度下，G'、G" 和 |η*| 随时间增加，溶胶-凝胶转变在约 17 分钟...

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内 肿瘤微环境并促进多细胞肿瘤球体的形成，有助于揭示驱动肿瘤发生的相关机制。

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

原发肿瘤微环境在细胞、生化和生物物理层面的异质性，无法通过培养永生化癌细胞来重现……

该方法有助于回答癌症生物学领域的关键问题，例如肿瘤形成、细胞迁移追踪以及癌细胞与正常细胞间的信号传导。该技术的主要优势在于，它能够在包含成纤维细胞等间质细胞的三维环境中研究肿瘤发生，且成本较低、可重复性高。确保材料兼具生物可打印性和生物功能性至关重要，这需要对其流变学特性和细胞相容性进行定量研究。该方法的可视化演示至关重要，因为水凝胶制备及细胞与水凝胶混合步骤较难掌握，气泡的形成会干扰打印模型的准确性。在生物安全柜中，将三克海藻酸钠和七克明胶粉末加入250毫升烧杯中。放入磁力搅拌子，并加入100毫升DPBS。用无菌石蜡膜和铝箔密封烧杯，以避免污染。然后向受试者展示与其肌电图（EMG）模式相对应的独特且特定的极坐标图。此后，在室温下继续振荡两小时。将溶液在 37 摄氏度下加热，直至凝胶发生相变转变为液态。然后将溶液转移至无菌的 50 毫升锥形离心管中并密封。以 834 ×g 离心 5 分钟，以去除任何气泡。接下来，将水凝胶前体吸入10毫升注射器中。用帽盖和石蜡膜密封注射器，并在4°C下保存，直至使用前。准备开始测试时，将装有制备好的水凝胶前体的注射器放入37摄氏度水浴中恒温一小时。在此期间，开启并初始化流变仪。一小时后，将注射器从水浴中取出。 将约 0.5 毫升前驱体挤出至流变仪平台。在控制面板上，点击向下的三角形按钮。等待测量工具下降至修整位置。使用刮刀修剪掉从测量工具边缘溢出的多余前体材料，并丢弃多余的物质。然后用移液管将矿物油滴加到测量工具的边缘，等待油完全封闭边界。在控制面板上，单击“继续”。然后单击“开始”按钮。测试完成后，松开测量工具，然后单击向上的三角形按钮。移除测量工具。使用70%乙醇清洁测量工具和平台。首先，按照文本方案中所述完成振幅和温度扫描。开始等温时间扫描时，点击“我的应用程序”，然后点击“等温时间-温度测试”模板。在工作流程中点击“测量”步骤，接着点击变量振荡应变，并调出设置窗口。将振荡应变设置为0.1%，振荡频率设置为1赫兹。在弹出窗口中，将数据点数设置为120。数据采集频率设置为每分钟采集一个数据点。单击“添加”按钮以添加温度变量。单击变量“temperature”，并将其设置为 25 摄氏度。在工作流程中右键单击步骤“Device, Move to measuring point”。单击“删除”。然后单击步骤“设备，设置值”。取消勾选“等待达到设定值”复选框，并将数值设置为 25 摄氏度。点击屏幕底部的图片、标题和按钮。取消勾选“Continue”复选框，然后点击“Start”步骤，为项目命名并保存。现在将样品加载到流变仪平台上，并按照先前所述的一般测试方案开始测试。随后观察储能模量（G′）和损耗模量（G″）随时间的变化曲线，找到G′与G″的交点，确定该交点对应的时间。然后点击“表格”，复制所有数据，并将其粘贴到一个文本文件中。

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生物工程

Bioprintable 藻酸盐/明胶水凝胶 3D体外模型诱导细胞球形形成

以下方案提供了通过巯基-烯烃光点击反应形成逐步增长型聚乙二醇-多肽水凝胶来包封胰岛β细胞的技术。该材料平台不仅为细胞包封提供了细胞相容性的微环境，还可实现用户可控地快速回收在水凝胶内形成的细胞结构。...

从逐步生长的PEG-肽水凝胶中生成与回收β细胞球体

采用生物打印机基于可牺牲模具制备出具有特定图案的水凝胶。首先用第二种水凝胶填充泊洛沙姆模具，随后将其洗脱，形成可被第三种水凝胶填充的孔隙结构。该方法利用泊洛沙姆快速洗脱和良好可打印性的特点，实现由生物聚合物构建复杂结构。...

打印热响应性反向模具以制备用于三维细胞培养的图案化双组分水凝胶

本文介绍了一种通过细胞聚集快速形成三维细胞球体的灵活实验方案。该方法可轻松适用于多种细胞类型，适用于细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及细胞-基质相互作用的成像与定量分析等多种应用。...

一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。...

基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。...

组织类球体的生成 通过 一种3D打印的印章状装置

水凝胶形成过程中的剪切处理可产生微凝胶悬浮液，该悬浮液具有剪切变稀特性，但在去除剪切力后能迅速重构。此类材料已被用作生物打印复杂、含细胞结构的支撑基质。本文描述了用于制备支撑床及相容性生物墨水的方法。...

通过凝胶化过程中剪切处理形成琼脂糖流体凝胶用于悬浮3D生物打印

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型...

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

本研究介绍了一种经济高效且简便的3D细胞结构制备方法，该方法采用基于印章的系统在琼脂糖模具中制备微孔。该系统可促进均一的类球体/类器官形成，从而增强细胞间相互作用。该方法降低了实验变异性，适用于药物筛选和组织工程等应用。...

利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

学习利用藻酸盐/明胶水凝胶生物打印技术构建乳腺癌三维体外模型，研究肿瘤细胞与基质细胞的相互作用机制。该方法成本低、可重复性高，有助于深入理解肿瘤发生发展过程。

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外模型系统诱导细胞球体形成

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可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

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