可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

该方法有助于回答癌症生物学领域的关键问题，例如肿瘤形成、细胞迁移追踪以及癌细胞与正常细胞间的信号传导。该技术的主要优势在于，它能够在包含成纤维细胞等间质细胞的三维环境中研究肿瘤发生，且成本较低、可重复性高。确保材料兼具生物可打印性和生物功能性至关重要，这需要对其流变学特性和细胞相容性进行定量研究。

该方法的可视化演示至关重要，因为水凝胶制备及细胞与水凝胶混合步骤较难掌握，气泡的形成会干扰打印模型的准确性。在生物安全柜中，将三克海藻酸钠和七克明胶粉末加入250毫升烧杯中。放入磁力搅拌子，并加入100毫升DPBS。

用无菌石蜡膜和铝箔密封烧杯，以避免污染。然后向受试者展示与其肌电图（EMG）模式相对应的独特且特定的极坐标图。此后，在室温下继续振荡两小时。

将溶液在 37 摄氏度下加热，直至凝胶发生相变转变为液态。然后将溶液转移至无菌的 50 毫升锥形离心管中并密封。以 834 ×g 离心 5 分钟，以去除任何气泡。

接下来，将水凝胶前体吸入10毫升注射器中。用帽盖和石蜡膜密封注射器，并在4°C下保存，直至使用前。

准备开始测试时，将装有制备好的水凝胶前体的注射器放入37摄氏度水浴中恒温一小时。在此期间，开启并初始化流变仪。一小时后，将注射器从水浴中取出。

将约 0.5 毫升前驱体挤出至流变仪平台。在控制面板上，点击向下的三角形按钮。等待测量工具下降至修整位置。

使用刮刀修剪掉从测量工具边缘溢出的多余前体材料，并丢弃多余的物质。然后用移液管将矿物油滴加到测量工具的边缘，等待油完全封闭边界。

在控制面板上，单击“继续”。然后单击“开始”按钮。测试完成后，松开测量工具，然后单击向上的三角形按钮。

移除测量工具。使用70%乙醇清洁测量工具和平台。首先，按照文本方案中所述完成振幅和温度扫描。

开始等温时间扫描时，点击“我的应用程序”，然后点击“等温时间-温度测试”模板。在工作流程中点击“测量”步骤，接着点击变量振荡应变，并调出设置窗口。

将振荡应变设置为0.1%，振荡频率设置为1赫兹。在弹出窗口中，将数据点数设置为120。数据采集频率设置为每分钟采集一个数据点。

单击“添加”按钮以添加温度变量。单击变量“temperature”，并将其设置为 25 摄氏度。在工作流程中右键单击步骤“Device, Move to measuring point”。

单击“删除”。然后单击步骤“设备，设置值”。取消勾选“等待达到设定值”复选框，并将数值设置为 25 摄氏度。

点击屏幕底部的图片、标题和按钮。取消勾选“Continue”复选框，然后点击“Start”步骤，为项目命名并保存。

现在将样品加载到流变仪平台上，并按照先前所述的一般测试方案开始测试。随后观察储能模量（G′）和损耗模量（G″）随时间的变化曲线，找到G′与G″的交点，确定该交点对应的时间。

然后点击“表格”，复制所有数据，并将其粘贴到一个文本文件中。要测量不同凝胶时间下的屈服强度，请点击“我的应用程序”。选择“屈服强度和流动应力（类凝胶）”模板。

为该项目命名。然后，点击工作流程中的“开始”步骤。在顶部菜单中，点击“插入”。

然后，在下拉菜单中选择“等待”。调出设置窗口，将等待时间设定为50分钟。点击“开始”，然后再次点击“插入”。

从下拉菜单中选择设备。调出设置窗口，选择温度，并将其设置为 25 °C。取消勾选“等待达到设定值”选项。

在工作流程中，选择“测量”步骤。选择剪切应力变量，调出设置窗口。将初始剪切应力和最终剪切应力分别设置为0和10,000帕斯卡。

然后点击计算器，将点密度设置为每帕斯卡0.2个点。在左侧的数据点选项卡中，设置为每秒一个点。在弹出窗口底部，选择事件控制选项卡，设定准则：当剪切速率大于每秒100时，停止测量。

将样品加载到流变仪平台上，并按照先前所述的一般测试方案开始测试。测试完成后，单击“Diagram”以观察应变-应力曲线。分别在静置30、40和50分钟后重复该测试。

以下步骤必须在无菌条件下进行。首先，用70%乙醇彻底喷洒生物打印机以对其进行灭菌，然后将其暴露于紫外光下过夜。从储存处取出一管水凝胶前体，在37摄氏度水浴中预热一小时。

将一个预先培养的细胞T形瓶从CO2培养箱转移至生物安全柜中。弃去培养基，然后用DPBS冲洗细胞两次。向细胞中加入预热的胰蛋白酶-EDTA溶液。

在37摄氏度下孵育六分钟。随后，加入等体积的胎牛血清以灭活胰蛋白酶。将水凝胶前体的注射器从水浴中取出，并进行清洁。

将注射器转移至生物安全柜前，用70%乙醇进行灭菌。将约三毫升水凝胶前体挤入一个10毫升的打印 cartridge 中。通过缓慢移液将前体与MDA-MB-231-GFP细胞混合，细胞浓度为每毫升一百万个细胞，避免产生气泡。

用末端盖和顶部盖盖住滤芯，并用石蜡膜密封。然后在834 ×g条件下离心1分钟，以消除任何气泡。对其他前体重复整个过程。

此后，用70%乙醇对所有三个墨盒进行灭菌。将灭菌后的墨盒装入生物打印机的腔室中。在打印机的控制软件中，点击手动。

然后在打印机的控制软件中展开工具头选项卡。在左侧的图形界面中依次点击一个墨盒，将墨盒温度设置为 25 摄氏度，等待 35 分钟，使前体材料达到可打印状态。对另外两个墨盒重复此操作。

在打印机的控制软件中，展开工具头选项卡。在图形界面中单击一个墨盒，然后单击测量短路按钮以测量喷嘴尖端的位置。对另外两个墨盒重复此操作。

接下来，将一个透明的聚苯乙烯微孔板放置在打印机载物台上。打开G代码文件，将所有墨盒的压力调整为200千帕。返回控制软件，点击“支架生成器”选项卡。

选择一个起始点开始打印，然后点击运行按钮。重复此过程以获得三个重复样本。之后，加入100毫摩尔的氯化钙溶液交联模型，持续一分钟。

用DPBS冲洗两次。然后使用刮铲小心地将模型转移至涂有琼脂糖的六孔板中。每孔加入5毫升DMEM，于37°C及5%二氧化碳条件下培养，每隔三天更换一次细胞培养基。

本研究中，构建了三维水凝胶系统，以模拟体内肿瘤微环境并促进多细胞肿瘤球体的形成。A3G7前体的温度扫描结果显示，在37摄氏度时G双撇（G''）大于G单撇（G'），验证了该前体的已知特性。随着温度降低，明胶分子自发物理缠结形成三螺旋结构，前体由此发生物理凝胶化。

储能模量G′和损耗模量G″均随温度降低而增加，并在30.6摄氏度时趋于收敛，表明发生了溶胶-凝胶转变。打印的螺旋桨模型的共聚焦显微镜图像显示，MDA-MB-231-GFP细胞在培养第15天开始形成球状体，且球状体的大小和数量持续增加至第30天。部分IMR-90-mCherry细胞也被观察到形成聚集体。

培养30天后，可在最初由MDA-MB-231-GFP细胞占据的区域中观察到IMR-90-mCherry细胞，同时在原本以IMR-90-mCherry细胞为主的区域中也可观察到MDA-MB-231-GFP细胞。这表明模型中可能发生了细胞迁移事件。对圆盘模型进行共聚焦显微镜观察显示，MDA-MB-231-GFP细胞的行为与在螺旋桨模型中的表现相似，在培养21天后形成了含有球状体的水凝胶。

一旦掌握，若操作得当，该模型打印技术可在两小时内完成。在进行该操作时，重要的是要始终尽可能保持水凝胶和细胞的新鲜，切勿将旧批次的水凝胶与新批次混合，并且必须在无菌条件下操作，以避免产生误导性结果。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如扫描电子显微镜和延时显微成像，以回答更多科学问题，例如材料孔隙率、细胞迁移速率以及基质重塑等。

该技术在癌症治疗领域具有重要意义，因为这种体外模型能够对共培养系统中肿瘤的形成和行为进行系统性可控的研究。除了乳腺癌细胞外，该模型还可轻松应用于其他类型细胞在不同初始位置的培养体系。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过正确制备水凝胶、将细胞包埋其中，并在最佳打印时间窗口内进行材料打印，从而构建三维异质性疾病模型。

请注意，处理生物样本可能具有极高危险性，在进行本操作时，必须采取预防措施，例如佩戴个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。