Name: 一种组合单细胞法表征人茎和祖种群的分子和免疫表型异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解单细胞基因表达分析与荧光激活细胞分选相结合的方法，用于表征人干细胞和祖细胞的分子与免疫表型异质性。该技术可揭示细胞异质性并分离特定癌症细胞群体。

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本工作得到瑞典癌症协会、瑞典研究理事会、瑞典医学研究学会、瑞典儿童癌症基金会、拉格纳·瑟德贝里基金会以及克努特和爱丽丝·瓦伦贝里基金会的资助

1. 裂解板的制备
<ol>
	<li>在无RNA/DNA的实验台上，通过混合390 µL无核酸酶水、17 µL 10% NP-40、2.8 µL 10 mM dNTP、10 µL 0.1 M DTT和5.3 µL RNase抑制剂（见材料表），配制足够用于96孔的裂解缓冲液，并额外增加10%。涡旋混匀后离心。</li>
	<li>将4 µL裂解缓冲液分配至96孔PCR板的每孔中，并用粘性封膜密封板子。离心以使液体沉降至孔底。在细胞分选前将板子置于冰上保存（最长24小时）。</li>
</ol>
2. 细胞分选前的细胞准备
<ol>
	<li>解冻实验所需数量的细胞（此处为CD34富集的造血干细胞和祖细胞）。1 × 106 个细胞足以用于分选约三个96孔板的单细胞，并包含对照组。</li>
	<li>将解冻后的细胞转移至15 mL圆锥形离心管中，每隔30秒加入1 mL胎牛血清（FBS），直至总体积达到8 mL。在4 °C下以350 × g 离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用8 mL染色缓冲液（含2% FBS的PBS）重悬细胞，在4 °C下以350 × g 离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用200 µL染色缓冲液重悬细胞，并取出部分细胞用于对照染色。</li>
	<li>为每种荧光染料制备荧光减一对照（FMO），方法是将部分细胞在50 µL染色缓冲液中进行染色。本示例中使用6个微量离心管，每管含20,000个细胞作为FMO。注意，细胞数量应根据所研究的细胞群进行调整。除一种荧光染料外，其余抗体均以与样本染色相同的浓度加入各管中。</li>
	<li>为每种荧光染料制备单染对照，方法是将部分细胞分别在50 µL染色缓冲液中与每种荧光染料进行染色。本示例中使用6个微量离心管，每管含20,000个细胞。需注意，用于对照的细胞必须表达每种抗体的靶标。将每种抗体以与样本染色相同的浓度分别加入独立的管中。此外，保留20,000个未染色的细胞于50 µL染色缓冲液中作为未染色对照。</li>
	<li>向细胞样本中加入相应浓度的抗体。本实验中使用的抗体及其稀释比例为：CD34-FITC 1/100，CD38-APC 1/50，CD90-PE 1/10，CD45RA-bv421 1/50，CD49F-PECy7 1/50，以及谱系混合抗体（Lineage Mix）：CD3-PECy5 1/50，CD2-PECy5 1/50，CD19-PECy5 1/50，CD56-PECy5 1/50，CD123-PECy5 1/50，CD14-PECy5 1/50，CD16-PECy5 1/50，和CD235a-PECy5 1/1000。</li>
	<li>将细胞与抗体在冰上避光孵育30分钟。</li>
	<li>用3 mL染色缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以350 × g 离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重悬细胞并重复步骤2.9。</li>
	<li>将样本用500 µL、FMO用100 µL染色缓冲液重悬，加入1/100的7AAD，并通过50 µm滤器过滤，以获得单细胞悬液。</li>
</ol>
3. 细胞分选
<ol>
	<li>确保流式细胞分选仪已根据制造商说明正确完成液滴延迟和细胞仪设置与追踪（CST）校准，以保证正确分选目标细胞。对于造血细胞，建议使用85微米喷嘴，最大分选速度为4，最佳事件速率为800至2000事件/秒。</li>
	<li>通过荧光补偿校正光谱重叠，并根据FMO对照或内部阴性对照设门。</li>
	<li>通过将至少100个目标细胞分选至含有100 µL染色缓冲液的新微量离心管中，对目标群体进行重新分析。对分选后的细胞进行流式细胞分析，记录分选样本，并确保细胞最终落入分选门内。</li>
	<li>在96孔板的A1孔中通过将液滴居中来设置单细胞分选。当液滴居中后，在一个空的96孔板的所有边缘孔中各分选50–100个6 µm的微粒，以确保每个孔中的细胞均位于孔的中心。</li>
	<li>如果可能，可通过分选单细胞增加一个额外的对照，以确保分选的细胞具有活性。 体外 增殖。造血细胞可在U型底96孔板中培养，每孔加入100 µl SFEM培养基，并添加1%青霉素-链霉素、100 ng/mL FLT3L、TPO和SCF。培养3天后，使用显微镜观察各孔中的细胞集落情况。</li>
	<li>从培养板上移除粘性封膜。将目标单个细胞（此处为 Lin-CD34+CD38- 细胞）分选至 96 孔中的 92 个孔中，在 FACS 分选软件中启用 INDEX 分选功能，以保存每个单细胞其他目标标志物（此处为 CD45RA、CD49f 和 CD90）的免疫表型谱。</li>
	<li>分别分选两个孔，每孔细胞数分别为10个和20个，用于PCR扩增的线性对照。通常使用H1和H2孔。</li>
	<li>将两个无细胞的孔用作无模板对照，通常为H3和H4孔。</li>
	<li>用透明粘性封板膜密封培养板，并在300 x g条件下离心培养板 g 在干冰上快速冷冻前，保持1分钟。</li>
	<li>将冻存板保存在 -80 °C。 
	注意：此为安全暂停点。分选并裂解的细胞可在 -80 °C 长期保存。</li>
</ol>
4. 逆转录与特异性靶标扩增
<ol>
	<li>在无RNA/DNA的实验台上，取一个1.5 mL无RNA酶的离心管，为全部96个基因靶标配制引物混合液：向管中加入每对引物各2 µL，包括看家基因引物和外源添加对照RNA的引物。若使用的引物少于96对，则用无核酸酶水补足缺失引物的等体积。引物需单独订购，以匹配所需的基因面板。</li>
	<li>在无DNA的实验台上，配制逆转录与特异性靶标扩增混合液：加入632.5 µL 2×反应混合液、101.2 µL Taq/SuperscriptIII酶、151.8 µL引物混合液和0.7 µL外源添加对照RNA。通过涡旋振荡混匀后离心，使液体沉降至管底。混合液配制完成后置于冰上，待加入样本时使用。</li>
	<li>在无DNA的实验台上，为四个孔配制无逆转录对照混合液：混合27.5 µL 2×反应混合液、1.76 µL Taq酶、6.6 µL引物混合液和2.64 µL无核酸酶水，并加入外源添加对照RNA。涡旋振荡混匀后离心，使液体沉降至管底，置于冰上待用。</li>
	<li>将裂解物板置于冰上解冻。向92个孔（包括线性对照和无模板对照孔）中各加入8.75 µL先前配制的逆转录与特异性靶标扩增混合液。向剩余的四个孔中各加入8.75 µL无逆转录对照混合液。用透明粘性封板膜密封反应板，离心使液体沉降至孔底。</li>
	<li>将反应板放入PCR仪中，按照预扩增程序运行，进行逆转录与特异性靶标扩增：步骤1：50 °C孵育60分钟；步骤2：95 °C孵育2分钟；步骤3：95 °C变性15秒；步骤4：60 °C退火延伸4分钟；重复步骤3至步骤4共24个循环；最后步骤5：8 °C永久保存。</li>
	<li>PCR完成后，将反应板短期保存于8 °C，长期保存于-20 °C。 
	注意：此为安全暂停点。扩增产物可短期保存于8 °C，长期保存于-20 °C。</li>
</ol>
5. 多重微流控基因表达分析的样本与检测板制备
<ol>
	<li>使用移液器将 3 µL 检测试剂加入 96 孔板的每个孔中，制备检测试剂加样板。将每种引物各 3 µL 分别加入检测试剂加样板的各个孔中。</li>
	<li>用粘性封板膜密封板孔，离心以使液体沉降至板底。</li>
	<li>在 96 孔板的所有孔中加入 8 µL 无核酸酶水，制备稀释板。向稀释板中加入 2 µL 扩增后的样品，最终稀释比例为 1:5。</li>
	<li>用粘性封板膜密封板孔，涡旋振荡 10 秒以混匀，最后离心以使液体沉降至板底。</li>
	<li>小心混合 352 µL 预混液与 35.2 µL 样品加样试剂，制备样品加样混合液。将 3.3 µL 加样混合液分装至 96 孔板的每个孔中，制备样品加样板。</li>
	<li>从稀释后的样品中取 2.7 µL 加入样品加样板的每个孔中。</li>
	<li>用粘性封板膜密封板孔，离心以使液体沉降至板底。</li>
</ol>
6. 微流控芯片的加载
<ol>
	<li>取出一个新的 96 x 96 微流控芯片。使用带针帽的注射器戳刺进样口，以确保其可被顺利推动，完成进样口的准备工作。</li>
	<li>去除注射器中的气泡。将各注射器中的全部液体加入对应的阀门中，同时将芯片倾斜 45 度并下压阀门。使用 IFC 控制器对芯片进行预启动。</li>
	<li>从检测加样板的每个孔中取 4.25 µL，加入到每个检测进样口中。避免产生气泡。若孔中出现气泡，使用移液器吸头将其移除。</li>
	<li>从样本加样板的每个孔中取 4.25 µL，继续加入到每个样本进样口中，避免产生气泡；若出现气泡，使用移液器吸头将其移除。</li>
	<li>使用 IFC 控制器加载芯片。</li>
	<li>检查芯片表面是否均匀，确认所有反应腔室均已加载。用胶带轻触芯片表面以去除灰尘。将芯片放入多重微流控基因表达分析平台中运行。</li>
</ol>
7. 在多重微流控基因表达平台上运行芯片
<ol>
	<li>将芯片加载到多重微流控基因表达分析平台后，为样品命名。</li>
	<li>设置ROX为被动染料，选择单探针并设置FAM-MGB为荧光通道，采用96 x 96 standard v2程序，开始运行。</li>
	<li>运行完成后取出芯片。</li>
</ol>
8. 芯片运行的初步分析
<ol>
	<li>将数据载入实时荧光定量 PCR 分析软件。</li>
	<li>通过粘贴制表符分隔文件中的细胞和基因布局来载入基因名称和细胞名称。</li>
	<li>打开图像视图并选择 ROX 作为染料。检查所有孔是否均含有 ROX 被动染料。</li>
	<li>检查所有扩增曲线是否正常，扩增曲线应平滑且无尖峰（类似于 图 3E）。</li>
	<li>确认所有单细胞均表达加入的对照 RNA，以确保所有细胞均已正确加载。</li>
	<li>确认所有细胞均表达看家基因，从而确保细胞分选正确。</li>
	<li>确认 10 个和 20 个细胞的线性对照之间 CT 值相差约 1，以验证扩增的线性。</li>
	<li>检查无逆转录酶（noRT）对照样本中是否存在表达。若在 noRT 样本中检测到表达，则考虑在后续实验中更换探针，选用不检测基因组 DNA 的探针。</li>
	<li>将数据导出为 csv 文件以进行进一步分析。</li>
</ol>
9. 使用 SCExV 进行单细胞分析
注意：提供了一部介绍性影片20以帮助了解该工具。此处简要推荐如何使用本方案中介绍的控件进行分析。
<ol>
	<li>连接至 SCexV 网站20。</li>
	<li>上传导出的 CSV 文件。</li>
	<li>选择添加的外源对照 RNA 作为阳性对照。剔除对照 RNA 的 CT 值高于 25 的任何细胞。将数据归一化至对照 RNA 的中位表达水平。</li>
	<li>点击 &#34;完成此步骤 -&#62; 分析&#34;。在“排除细胞”选项中，移除无逆转录对照（noRT）、无模板对照（notemplate）以及 10 和 20 个细胞的对照。</li>
	<li>根据预期的簇数量，使用选定的聚类方法对细胞进行聚类。导出分析后的数值。</li>
</ol>
10. 索引分选分析
<ol>
	<li>打开 FACS 分析软件并加载索引样品。</li>
	<li>打开脚本编辑器，运行 Quinn J. 等人21 提供的脚本。</li>
	<li>此时 FACS 分析软件应已为每个单细胞创建了门控，打开布局编辑器，并根据 SCexV 的分组结果（文件“&#34;Sample_complete_Data.xls&#34;”中提供）对细胞进行着色。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，单细胞基因表达分析已成为定义各种细胞群体异质性的重要手段23。RNA测序技术的出现理论上使得检测单个细胞的整个转录组成为可能，但这些方法受到细胞间测序深度差异和dropout效应的限制。单细胞qPCR能够在所有细胞接受相同处理的条件下，对数百个关键基因的表达进行灵敏且稳健的分析，从而降低技术噪声。对有限数量转录本的聚焦分析还能够简化数据分析过程，避免高表达基因的干扰。
由于该方法仅检测细胞中部分表达的基因，因此在设计基因面板时选择正确的基因组合至关重要。基因的选择可通过多种方式实现，包括文献调研、基于群体分析的前期研究结果，以及对公开可用数据的生物信息学分析。这一过程并非易事；然而，若基因组合选择得当，该方法将具有极高的效能。在基因面板设计完成后，必须验证引物在多重扩增过程中是否相互干扰。我们建议通过使用足量样本进行梯度稀释实验，来检测引物的线性关系；本研究中所用引物的梯度稀释结果见 Warfvinge et al.22 的补充图 2D。
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人们认为，每种血细胞均处于一个细胞层级结构中，其中干细胞位于顶端，其下是一系列逐步定向分化的中间祖细胞，最终分化为具有特定生物学功能的终末效应细胞1。关于干细胞系统组织方式的大部分知识均来源于造血系统的研究，这主要得益于可通过FACS分选前瞻性地分离出高度富集干细胞或各类祖细胞的不同造血细胞群体2。这使得许多细胞群体能够通过功能分析或分子分析（主要是基因表达谱分析）进行研究3,4。然而，在分析整体细胞群体的基因表达时，细胞间的个体差异会被平均化而丢失5。因此，若某一细胞群体的推断生物学功能实际上由其中少量细胞亚群所介导，则无法检测细胞间变异性的局限性可能会干扰我们对关键生物学过程的理解6,7。相反，单细胞分辨率下的基因表达特征分析则为揭示细胞异质性、避免高丰度细胞亚群的掩盖效应提供了可能8。
迄今为止，已开发出多种单细胞基因表达分析方案，每种方法均有其局限性。最早的方法是RNA荧光原位杂交 原位 杂交（RNA-FISH），可同时检测有限数量的转录本，其独特之处在于能够研究RNA的定位9,11早期利用PCR和qPCR检测单个或极少数转录本的方法也已建立12然而，这些方法最近已被基于微流控的技术所取代，后者可通过qPCR在数百个细胞中同时分析每个细胞数百个转录本的表达，从而利用预定义的基因面板实现高维度的异质性分析10,13近年来，基于RNA测序的技术已广泛应用于单细胞分析，因为这些技术理论上能够检测单个细胞的整个转录组，从而为异质性分析增加探索性维度10,14多重qPCR分析与单细胞RNA测序具有不同的特性，因此选择其中任一方法的依据取决于所研究的科学问题以及目标细胞群体的数量。当研究未知细胞类型或大规模细胞群体时，单细胞RNA测序因其高通量、单细胞成本低以及无偏倚的探索性特征而具有显著优势。然而，单细胞RNA测序也倾向于更频繁地测序高丰度转录本，而低丰度转录本则容易出现丢失（dropout）。这可能导致数据复杂性显著增加，对生物信息学分析提出较高要求，以揭示那些常被技术噪声掩盖的微弱或隐匿的重要分子信号15因此，对于特征明确的组织，利用预先选定的功能重要基因或分子标志物引物组合进行单细胞qPCR分析，可作为一种灵敏且直接的方法来评估细胞群体的异质性。然而需要注意的是，与单细胞RNA测序相比，单细胞qPCR方法的单细胞成本通常更高。本文描述了一种结合单细胞RT-qPCR（源自Teles J.的改良方法）的技术方案。 等16），用于FACS索引分选17 和生物信息学分析18 为了同时表征群体内部分子和免疫表型的异质性。
在此方法中，首先对目标细胞群体进行染色，然后通过流式细胞术（FACS）将单个细胞直接分选至96孔PCR板中的裂解缓冲液中。在FACS分选过程中，同时记录每个单细胞表面标志物的额外组合表达水平，该技术称为索引分选（index-sorting）。随后，对裂解的细胞材料进行扩增，并利用微流控平台通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析选定基因集的基因表达水平。该策略不仅可实现对分选后单细胞的分子分析，还可同时表征每个单细胞的细胞表面标志物表达情况。通过将分子特征明确的细胞亚群与索引分选所得的标志物表达直接关联，可将这些亚群与特定的免疫表型相联系，从而用于后续的前瞻性分离。该方法的详细步骤见图1。预先确定的基因组合有助于提高目标基因表达的分辨率，因为它避免了对无关且高丰度基因的检测，而这些基因可能掩盖微弱的基因表达信号。此外，特异性靶标扩增、一步法逆转录与扩增过程使得低表达转录本（如转录因子或非多聚腺苷酸化RNA）的检测更加稳健可靠。尤为重要的是，qPCR方法可用于检测融合蛋白的mRNA，在研究某些恶性疾病时具有重要意义19。最后，由于该方法检测的基因数量有限、基因检出缺失率低，且细胞间的技术差异较小，相较于高维度方法（如单细胞RNA测序），数据分析更为简便。按照本实验方案，从细胞分选到获得分析结果的整个实验可在三天内完成，因此这是一种操作简单、快速且适用于高通量、高灵敏度单细胞基因表达分析的方法。

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>克隆：61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>克隆：3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>304608</td><td>克隆：MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>克隆：HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>克隆：RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>克隆：HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>306008</td><td>克隆：6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>BD Pharma</td><td>559944</td><td>克隆：GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>克隆：561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>克隆：Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>克隆：5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD bioscience</td><td>560362</td><td>克隆：HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>克隆：eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>Stem cell technologies</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>CST磁珠</td><td>BD</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>Accudrop磁珠</td><td>BD</td><td>345249</td><td>6 &amp;micro;m颗粒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>透明粘性封膜</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>铝箔粘性封膜</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR 1.5 mL管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 PCR扩增仪</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10% NP40</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>RNase抑制剂</td></tr><tr><td>CellsDirect一步法qRT-PCR试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>来自CellsDirect试剂盒</td></tr><tr><td>2x反应混合液</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>来自CellsDirect试剂盒</td></tr><tr><td>SuperScript III RT/Platinum Taq混合液</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>来自CellsDirect试剂盒</td></tr><tr><td>Platinum&amp;nbsp;Taq&amp;nbsp;DNA聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan细胞至cDNA对照试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA对照</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>来自TaqMan细胞至cDNA对照试剂盒</td></tr><tr><td>20x Xeno RNA对照TaqMan基因表达检测</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>来自TaqMan细胞至cDNA对照试剂盒</td></tr><tr><td>96.96样本/上样试剂盒&amp;mdash;10个IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x检测上样试剂</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>来自96.96样本/上样试剂盒</td></tr><tr><td>20x GE样本上样试剂</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>来自96.96样本/上样试剂盒</td></tr><tr><td>控制线流体&amp;nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>来自96.96样本/上样试剂盒</td></tr><tr><td>TaqMan基因表达预混液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96动态阵列IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar</td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm实时PCR分析软件</td><td>Fluidigm</td><td>Fluidigm</td><td></td></tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td></tr><tr><td>ACE</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00174179_m1</td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00169233_m1</td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL.52</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs03043652_ft</td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs03024541_ft</td><td></td></tr><tr><td>BMI1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00995536_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNA2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00996788_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01030099_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01084593_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNC</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNE1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01026535_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNF</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10.MME</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00153510_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11a</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11c.ITAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00174217_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD123.IL3RA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00608141_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD133.PROM1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220.INSR</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00961554_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD24.HSA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs03044178_g1</td><td></td></tr><tr><td>NCOR1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01094540_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD26.DPP4</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00175210_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD274</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01125301_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD276</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00987207_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD32.FCGR2B</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01634996_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD33</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344.FZD4</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00201853_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD352.SLAMF6</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD38</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01120071_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD41.ITGA2B</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01116228_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD49f.ITGA6</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01041011_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD56.NCAM1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00941830_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD97</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00908458_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDK6</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01026371_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1A</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00355782_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1B</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01597588_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1C</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00175938_m1</td><td></td></tr><tr><td>CEBPa</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00269972_s1</td><td></td></tr><tr><td>CSF1r</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00911250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CSF2RA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00531296_g1</td><td></td></tr><tr><td>CSF3RA</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01114427_m1</td><td></td></tr><tr><td>E2A.TCF3</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00413032_m1</td><td></td></tr><tr><td>EBF1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01092694_m1</td><td></td></tr><tr><td>ENG</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00923996_m1</td><td></td></tr><tr><td>EPOR</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00959427_m1</td><td></td></tr><tr><td>ERG</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01554629_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLI1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00956711_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLT3</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00174690_m1</td><td></td></tr><tr><td>FOXO1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01054576_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>GATA1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00231112_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00231119_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA3</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00231122_m1</td><td></td></tr><tr><td>GFI1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr><td>HES1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01118947_g1</td><td></td></tr><tr><td>HLF</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00171406_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMGA2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00171569_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXA5</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00430330_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXB4</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00256884_m1</td><td></td></tr><tr><td>ID2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs04187239_m1</td><td></td></tr><tr><td>IGF2BP1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00198023_m1</td><td></td></tr><tr><td>IGF2BP2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01118009_m1</td><td></td></tr><tr><td>IKZF1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00175238_m1</td><td></td></tr><tr><td>ITGB7</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01565750_m1</td><td></td></tr><tr><td>KIT</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00174029_m1</td><td></td></tr><tr><td>Lin28B</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01013729_m1</td><td></td></tr><tr><td>LMO2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01017441_m1</td><td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01032443_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPO</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00924296_m1</td><td></td></tr><tr><td>NFIB</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01062011_m1</td><td></td></tr><tr><td>Pten</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs02621230_s1</td><td></td></tr><tr><td>RAG2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01851142_s1</td><td></td></tr><tr><td>RPS18</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile.IgH</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00169795_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

免疫表型分析和分子分析长期以来被用于界定细胞异质性并定义不同的细胞群体。流式细胞术（FACS）本质上是一种单细胞检测方法，但在进行分子分析之前，目标细胞通常被前瞻性地大量富集，从而失去了单细胞分辨率。单细胞基因表达分析为理解异质性细胞群体中各个细胞之间的分子差异提供了手段。在群体细胞分析中，某一特定细胞类型的过度代表会导致信号偏差，并掩盖具有重要生物学意义的稀有细胞的信号。通过将FACS索引分选与单细胞基因表达分析相结合，可以在不丧失单细胞分辨率的前提下对细胞群体进行研究，同时还能捕获细胞表面标志物表达处于中间水平的细胞，从而评估连续性表面标志物表达的相关性。本文中，我们描述了一种将单细胞逆转录定量PCR（RT-qPCR）与FACS索引分选相结合的方法，以同时表征细胞群体内的分子异质性和免疫表型异质性。
与单细胞RNA测序方法相比，采用qPCR结合特异性靶标扩增可对低丰度转录本进行更稳健的检测，减少数据丢失，且不受细胞间测序深度差异的干扰。此外，通过将单个细胞直接按索引分选至裂解缓冲液中，该方法可将cDNA合成与特异性靶标预扩增步骤合二为一，并实现后续获得的分子特征与细胞表面标志物表达之间的关联分析。该方法最初用于研究造血单细胞，但也已成功应用于其他细胞类型。
综上所述，本文所述方法能够对一组预先选定的基因进行高灵敏度的 mRNA 表达检测，并有望开发出用于后续分离分子特征 distinct 亚群的实验方案。

本方案快速、易于操作且高度可靠。图1展示了实验设置的总体概览。从单细胞分选、靶标特异性扩增、基因表达检测到初步分析，整个流程可在三天内完成。图2展示了以热图形式呈现的分析结果示例，该数据来源于对慢性髓系白血病（CML）患者或年龄匹配的健康对照者的96个细胞，使用96对引物进行的单细胞基因表达分析的初步结果。通过层次聚类分析，可根据基因表达特征将分析的细胞划分为四个亚群。热图可视化是一种便捷的方式，既能概览数据，也可用于识别并排除应从分析中剔除的孔（例如，对照孔）。图2B为主成分分析（PCA），通过降维方法展示各组细胞之间的相似性，其中异常值可被轻松识别。为分析单个基因在各簇中的分布情况及其差异，小提琴图（violin plots）十分有用。图2C展示了四个代表性基因的表达情况：标记所有白血病细胞的融合基因BCR-ABL...

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。

免疫表型特征分析和分子分析长期以来被用于界定异质性并定义不同的细胞群体。FACS 是……

该方法可以回答干细胞和癌症研究领域中的一些关键问题，例如干细胞异质性的特征是什么，以及如何分离对治疗敏感的癌细胞。本研究的主要优势在于，它将技术上稳健的单细胞基因表达分析与分选技术相结合，从而实现对目标亚群的进一步下游表征。尽管该方法可用于研究癌症和干细胞的异质性，但它也能提供关于基因启动状态和谱系潜能的深入见解。开始实验方案时，在无RNA/DNA的实验台上，准备足够用于96孔的裂解缓冲液，并额外增加10%的量。将390微升无核酸酶水、17微升10% NP-40、2.8微升10毫摩尔dNTP、10微升0.1摩尔DTT以及5.3微升RNase抑制剂混合均匀。涡旋振荡后离心收集管内液体。随后，向96孔PCR板的每孔中加入4微升裂解缓冲液，并用粘性密封膜密封板子。离心培养板，使液体聚集于管底。细胞分选前将培养板置于冰上，最多保存24小时。流式细胞分选仪正确设置后，通过分选至少100个目标细胞至含有100 µL染色缓冲液的新的微量离心管中，对目标细胞群进行重新分析。通过记录分选后的样本，使用流式细胞分选术（FACS）分析分选细胞，并确保细胞最终进入分选门。然后，将液滴对准96孔板的A1孔中心，设置单细胞分选程序。当液滴居中后，在空的96孔板边缘的所有孔中分选50至106微米的微粒，以确保每个孔的中心位置均能接收到一个细胞。从培养板上移除粘性封膜。将单个 Lin-CD34+ CD38- 细胞分选至 96 个孔中的 92 个孔中。在 FACS 分选软件中启用索引分选功能，以保存每个单细胞的 CD45RA、CD49F 和 CD90 免疫表型谱。分别分选10个和20个细胞至两个孔中，作为PCR扩增的线性对照，通常使用H1和H2孔。保留两个孔不加入任何细胞，作为空白模板对照，通常为H3和H4孔。使用透明粘性封板膜密封板孔，并在300 ×g条件下离心1分钟。将培养板置于干冰中快速冷冻，随后在零下80摄氏度保存。通过加入632.5 µL的2倍反应混合液、101.2 µL Taq/SuperscriptIII、151.8 µL引物混合液以及0.7 µL spiked in对照RNA，配制逆转录和特异性靶标扩增混合液。涡旋振荡溶液，并短暂离心以将液体收集至管底。将混合物置于冰上保存，直至准备加入样品。接着，将裂解板在冰上解冻。向92个孔中加入8.75 µL先前配制的反转录和特异性靶标扩增混合液，包括线性对照和无模板对照。向剩余的4个孔中加入8.75 µL无反转录对照混合液。然后用透明粘性封板膜密封反应板，并离心收集液体至管底。按照预扩增程序在PCR仪中运行反应板，进行逆转录和特异性靶标扩增。通过移液将三微升（3 µL）的检测加样试剂加入96孔板的每个孔中，制备检测加样板。向检测加样板的各个孔中分别加入三微升（3 µL）的每种引物。用封板膜密封反应板并离心。离心后，取一个96孔板，向其中每个孔加入8 µL无核酸酶水，制备稀释板。然后向稀释板中每孔加入2 µL扩增后的样品。用封板膜密封培养板。涡旋振荡培养板10秒以混匀。然后离心培养板。接下来，通过将 352 微升预混液与 35.2 微升上样试剂仔细混合，制备样品上样混合液。取 3.3 微升上样混合液分装至 96 孔板的每个孔中，制备样品上样板。将稀释后样品中的 2.7 微升加入至样品上样板的每孔中。用粘性封膜将板密封后离心。取出一个新的 96×96 微流控芯片。用带针帽的注射器穿刺进样口以进行准备，确保其可被顺利移动。将注射器中的全部液体加入每个阀中，同时将芯片倾斜至45度并下压阀门。使用IFC控制器对芯片进行预启动。从检测加样板的每个孔中吸取4.25 µL液体，分别加入每个检测入口，并避免产生气泡。如果孔中出现气泡，需用移液枪头将其去除。继续从样本加样板的每个孔中吸取4.25 µL样本，依次加入每个样本进样口，注意避免产生气泡；若出现气泡，应立即用移液枪头清除。使用集成流体回路控制器（Integrated Fluidics Circuit controller）或IFC控制器加载芯片。检查芯片是否均匀，所有腔室是否均已加样。用胶带轻触芯片表面以去除灰尘。最后，将芯片放入多重微流控基因表达平台中运行。一次成功的运行所生成的热图显示，各样本间的表达分布均匀，信号强度约为7到25个CT值。加标对照RNA的扩增曲线证实，所有孔的表达量均接近10个CT值，变异极小或无变异，表明所有细胞的预扩增和qPCR反应均成功。主成分分析（PCA）通过降维来可视化细胞群之间的相似性，可用于区分分子特征不同的细胞簇，在此识别出四个亚群。为了确定不同分子簇细胞的免疫表型，将索引FCS文件载入FlowJo。打开脚本编辑器并粘贴索引脚本，然后点击运行。此时，每个细胞将被分配到独立的门中。将每个细胞添加到布局编辑器中，并根据文件 sample_complete_data.xls 中提供的 SCXV 分子定义分组对细胞进行着色。FACS 图显示了造血干细胞标志物 CD90 和 CD45RA 的细胞表面标志物表达情况，可用于区分不同簇并分离这些细胞簇以进行功能分析。通过此流程，可进一步开展其他技术操作，例如对新发现的亚群进行 RNA 测序，或开展体外和体内实验，以回答更多科学问题，例如：导致这种异质性的分子机制是什么？该亚群在功能上有何差异？这一策略为研究人员不仅研究正常和恶性造血过程中的异质性，而且前瞻性地分离所发现的亚群以进一步深入研究铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

一种组合单细胞法表征人茎和祖种群的分子和免疫表型异质性

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。...

通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。...

长期与短期造血干细胞的分离方法

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。...

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。...

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

本方案描述了采用单细胞分选方法对人源间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的应用。具体而言，当单细胞分选与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从异质性细胞群体中获得纯度达99%的免疫表型细胞。...

从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

本文所述方案可通过单细胞质谱流式细胞术对肌肉干细胞和祖细胞进行鉴定和高维分析，并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行纯化，以深入研究其功能。该方法可用于研究疾病模型中的再生动态，并评估药物干预的效果。...

利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

了解单细胞基因表达分析与荧光激活细胞分选相结合的方法，用于表征人干细胞和祖细胞的分子与免疫表型异质性。该技术可揭示细胞异质性并分离特定癌症细胞群体。

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

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