一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

该方法可以回答干细胞和癌症研究领域中的一些关键问题，例如干细胞异质性的特征是什么，以及如何分离对治疗敏感的癌细胞。本研究的主要优势在于，它将技术上稳健的单细胞基因表达分析与分选技术相结合，从而实现对目标亚群的进一步下游表征。尽管该方法可用于研究癌症和干细胞的异质性，但它也能提供关于基因启动状态和谱系潜能的深入见解。

开始实验方案时，在无RNA/DNA的实验台上，准备足够用于96孔的裂解缓冲液，并额外增加10%的量。将390微升无核酸酶水、17微升10% NP-40、2.8微升10毫摩尔dNTP、10微升0.1摩尔DTT以及5.3微升RNase抑制剂混合均匀。涡旋振荡后离心收集管内液体。随后，向96孔PCR板的每孔中加入4微升裂解缓冲液，并用粘性密封膜密封板子。

离心培养板，使液体聚集于管底。细胞分选前将培养板置于冰上，最多保存24小时。流式细胞分选仪正确设置后，通过分选至少100个目标细胞至含有100 µL染色缓冲液的新的微量离心管中，对目标细胞群进行重新分析。

通过记录分选后的样本，使用流式细胞分选术（FACS）分析分选细胞，并确保细胞最终进入分选门。然后，将液滴对准96孔板的A1孔中心，设置单细胞分选程序。当液滴居中后，在空的96孔板边缘的所有孔中分选50至106微米的微粒，以确保每个孔的中心位置均能接收到一个细胞。

从培养板上移除粘性封膜。将单个 Lin-CD34+ CD38- 细胞分选至 96 个孔中的 92 个孔中。在 FACS 分选软件中启用索引分选功能，以保存每个单细胞的 CD45RA、CD49F 和 CD90 免疫表型谱。

分别分选10个和20个细胞至两个孔中，作为PCR扩增的线性对照，通常使用H1和H2孔。保留两个孔不加入任何细胞，作为空白模板对照，通常为H3和H4孔。使用透明粘性封板膜密封板孔，并在300 ×g条件下离心1分钟。

将培养板置于干冰中快速冷冻，随后在零下80摄氏度保存。通过加入632.5 µL的2倍反应混合液、101.2 µL Taq/SuperscriptIII、151.8 µL引物混合液以及0.7 µL spiked in对照RNA，配制逆转录和特异性靶标扩增混合液。

涡旋振荡溶液，并短暂离心以将液体收集至管底。将混合物置于冰上保存，直至准备加入样品。接着，将裂解板在冰上解冻。

向92个孔中加入8.75 µL先前配制的反转录和特异性靶标扩增混合液，包括线性对照和无模板对照。向剩余的4个孔中加入8.75 µL无反转录对照混合液。然后用透明粘性封板膜密封反应板，并离心收集液体至管底。

按照预扩增程序在PCR仪中运行反应板，进行逆转录和特异性靶标扩增。通过移液将三微升（3 µL）的检测加样试剂加入96孔板的每个孔中，制备检测加样板。向检测加样板的各个孔中分别加入三微升（3 µL）的每种引物。

用封板膜密封反应板并离心。离心后，取一个96孔板，向其中每个孔加入8 µL无核酸酶水，制备稀释板。然后向稀释板中每孔加入2 µL扩增后的样品。

用封板膜密封培养板。涡旋振荡培养板10秒以混匀。然后离心培养板。

接下来，通过将 352 微升预混液与 35.2 微升上样试剂仔细混合，制备样品上样混合液。取 3.3 微升上样混合液分装至 96 孔板的每个孔中，制备样品上样板。将稀释后样品中的 2.7 微升加入至样品上样板的每孔中。

用粘性封膜将板密封后离心。取出一个新的 96×96 微流控芯片。用带针帽的注射器穿刺进样口以进行准备，确保其可被顺利移动。

将注射器中的全部液体加入每个阀中，同时将芯片倾斜至45度并下压阀门。使用IFC控制器对芯片进行预启动。从检测加样板的每个孔中吸取4.25 µL液体，分别加入每个检测入口，并避免产生气泡。

如果孔中出现气泡，需用移液枪头将其去除。继续从样本加样板的每个孔中吸取4.25 µL样本，依次加入每个样本进样口，注意避免产生气泡；若出现气泡，应立即用移液枪头清除。使用集成流体回路控制器（Integrated Fluidics Circuit controller）或IFC控制器加载芯片。

检查芯片是否均匀，所有腔室是否均已加样。用胶带轻触芯片表面以去除灰尘。最后，将芯片放入多重微流控基因表达平台中运行。

一次成功的运行所生成的热图显示，各样本间的表达分布均匀，信号强度约为7到25个CT值。加标对照RNA的扩增曲线证实，所有孔的表达量均接近10个CT值，变异极小或无变异，表明所有细胞的预扩增和qPCR反应均成功。主成分分析（PCA）通过降维来可视化细胞群之间的相似性，可用于区分分子特征不同的细胞簇，在此识别出四个亚群。

为了确定不同分子簇细胞的免疫表型，将索引FCS文件载入FlowJo。打开脚本编辑器并粘贴索引脚本，然后点击运行。此时，每个细胞将被分配到独立的门中。

将每个细胞添加到布局编辑器中，并根据文件 sample_complete_data.xls 中提供的 SCXV 分子定义分组对细胞进行着色。FACS 图显示了造血干细胞标志物 CD90 和 CD45RA 的细胞表面标志物表达情况，可用于区分不同簇并分离这些细胞簇以进行功能分析。通过此流程，可进一步开展其他技术操作，例如对新发现的亚群进行 RNA 测序，或开展体外和体内实验，以回答更多科学问题，例如：导致这种异质性的分子机制是什么？该亚群在功能上有何差异？

这一策略为研究人员不仅研究正常和恶性造血过程中的异质性，而且前瞻性地分离所发现的亚群以进一步深入研究铺平了道路。