使用缺氧条件下培养的细胞中内源性核蛋白进行免疫共沉淀实验

该方法有助于解答缺氧研究领域中的关键问题，例如在缺氧条件下转录因子与其转录共调节因子之间的内源性及天然相互作用。该技术的主要优势在于，缺氧细胞在缺氧条件下收获，并采用核组分进行共免疫沉淀。本方案使用在四个10厘米培养皿中培养的人胚胎肾293A细胞。

每皿接种 3 至 5 × 10⁶ 个细胞，加入 10 毫升含 10% FBS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素和链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。接种后 24 小时，当细胞融合度达到 80% 至 90% 时，将两皿细胞放入培养箱手套箱内的低氧亚室中，于 37 °C、1% 氧气和 5% CO₂ 条件下孵育 4 小时。

将另外两个培养皿保持在常氧条件下。在收获低氧处理的细胞前一天，将装有100毫升DPBS的未加盖实验玻璃试剂瓶放入低氧亚室中，使其在低氧条件下预平衡24小时。在收获细胞前约一小时，将装有冰块的冰盒放入已平衡至1%氧气和5%二氧化碳的厌氧手套箱的处理室中。

将装有预平衡缺氧DPBS的瓶子从缺氧亚室转移至处理室，并置于冰上。缺氧处理4小时后，将细胞从缺氧亚室转移至已预平衡为1%氧气和5%二氧化碳的处理室中。用抽吸法去除培养基，并用10毫升移液管加入10毫升冰预冷的预平衡缺氧DPBS，冲洗细胞一次。

使用5毫升移液管加入5毫升冰上预冷且预先平衡的DPBS，用细胞刮刀刮取细胞以使其脱离。倾斜细胞培养板，用10毫升移液管收集脱离的细胞，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。将装有细胞的管子置于冰上保存。

打开手套箱中处理室与缓冲室之间的门，这两个腔室均已预先平衡至1%氧气和5%二氧化碳环境。将装有经低氧处理的细胞并置于冰上的15毫升锥形管从处理室转移至缓冲室。打开缓冲室的门，将细胞完全移出手套箱。

通过在4°C、1000 × g条件下离心5分钟，分别收集低氧细胞和常氧细胞的沉淀。本实验将使用核提取试剂盒。首先，用移液器反复吹打数次，将每份细胞沉淀轻轻重悬于500 µL裂解缓冲液NL中，该缓冲液中添加有1×蛋白酶抑制剂混合物和0.1 mol DTT。

向细胞悬液中加入25微升NP去垢剂溶液，最大速度涡旋振荡10秒。在4摄氏度下以1000 × g离心5分钟。保留上清液和细胞核沉淀。

按照文本方案中所述收集并储存上清液后，加入500 µL裂解缓冲液NL重悬含有细胞核的沉淀，裂解缓冲液NL中需添加1×蛋白酶抑制剂混合物和0.1 mol/L DTT，并在最大转速下涡旋振荡5秒。用移液器反复吹打数次，将核沉淀重悬于50 µL提取缓冲液NX1中，NX1中需添加1×蛋白酶抑制剂混合物。冰上孵育30分钟。

每五分钟，在最大转速下涡旋振荡10秒。在4°C、12,000 × g条件下离心10分钟。收集上清液，转移至微型透析装置中，每单位最大体积为100微升，用于脱盐。

盖紧微型透析装置，并将其放入浮力装置中。将浮力装置置于含有500毫升预冷透析缓冲液的烧杯中。操作时需小心，避免透析缓冲液直接接触皮肤或吸入，因为其中含有PMSF。

在4 °C条件下轻轻搅拌孵育30分钟。30分钟后，从微型透析装置的角落收集样品，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。在4 °C条件下以12,000 ×g离心10分钟。

将每份上清液各取 25 微升分装至 1.5 微升离心管中，于 -80 摄氏度保存。准备用于免疫沉淀的蛋白 AG Sepharose 微珠。将 50 微升微珠分别加入四个 1.5 毫升微量离心管中，每管加入 500 微升 DPBS 缓冲液。

通过离心收集珠粒。弃去上清液，并将珠粒重悬于100 µL TBS缓冲液中。加入2 µL小鼠单克隆抗ARNT抗体或小鼠免疫球蛋白G，后者通过将0.7 mg小鼠IgG溶解于500 µL TBS缓冲液中配制而成。

将含有珠子的微量离心管放入冷室中，置于试管旋转仪上，于10 rpm条件下孵育2小时。孵育结束后，通过离心收集珠子，并弃去上清液。

将先前制备的200微克核蛋白裂解液溶于800微升免疫沉淀缓冲液中进行稀释。将裂解液与抗体偶联的磁珠在4摄氏度下孵育过夜。次日，在4摄氏度下以3000 × g离心2分钟，使磁珠沉淀。

弃去上清液。向每根离心管中加入1毫升含0.2% NP-40的预冷TBS，离心沉淀。以该方法用含0.2% NP-40的预冷TBS洗涤磁珠三次。

将珠子在50微升Laemmli上样缓冲液中95摄氏度煮沸5分钟。在4摄氏度下以10,000 × g离心珠子5分钟。收集上清液，弃去珠子。

在HEK293A细胞中检测了缺氧处理后HIF-1复合物各组分在亚细胞定位中的表达水平。与预期一致，总HIF-1α水平在缺氧条件下上调，而总细胞裂解液中的ARNT水平无明显变化。此外，缺氧诱导了HIF-1α和ARNT在细胞核中的聚集。

使用暴露于常氧或低氧条件下的 HEK293A 细胞核提取物进行共免疫沉淀实验。如图所示，在低氧条件下 HEK293A 细胞的核提取物中，HIF-1a 与 ARNT 发生了共免疫沉淀，表明 HIF-1a 在低氧条件下与 ARNT 相互作用。该技术建立后，为低氧研究领域的科研人员探索内源性核蛋白-蛋白相互作用及其在低氧条件下的变化奠定了基础。