外周相关蛋白血浆膜分型的测定
June 15th, 2018
在这里, 我们提出了一个协议, 以进行定量分析的血浆膜协会的水平荧光标记的外围相关蛋白。该方法是以等离子体膜荧光标记细胞中所观察到的细胞膜和胞质成分的计算分解为基础的。
这种方法可以帮助回答细胞生物学中的关键问题，包括揭示细胞信号通路。所以这种技术的主要优点是它实际上不需要任何复杂的显微镜方法。它也非常快速，因此可用于实时观察细胞中蛋白质的分布。
由于光衍射导致质膜和细胞质荧光在显微镜下混合，因此外周相关蛋白膜分配的评估和定量很复杂。按照文本方案中的说明，从制备生物材料开始此过程。通过应用适合研究材料的染色方案，用 FM 4-64 染料对制备的材料进行染色。
对于烟草 BY-2 细胞，用 0.2 μL 10 毫摩尔 FM 4-64 二甲基亚砜溶液对 200 μL 细胞悬液进行染色。要捕获每个细胞的一个赤道共聚焦切片，请为用作蛋白质标签的发色团和 FM 4-64 设置连续双通道扫描。此外，请设置更高的光学分辨率。
一个示例设置是一个 63 倍油浸物镜，数值孔径为 1.3，图像尺寸为 1， 024 x 1， 024 像素。安装 Fiji ImageJ Distribution 和所需的宏外围设备。在斐济，选择插件，然后选择宏，然后在主菜单中安装，并使用 ImageJ 宏外围设备指定下载文件的路径。
安装 R Project 软件和所需的软件包。运行 R 图形用户界面，选择包，然后在主菜单中安装包，并指定最近的存储库以及要安装的包 ggplot2。下载 R Package 外围设备。
通过选择包，然后从本地文件安装包来安装它们。处理细胞质标志物的共聚焦图像。为此，请使用插件将图像导入斐济，然后使用 bioformats，然后从 Fiji 菜单中使用默认设置导入 bioformats importer。
为分析设置运行 import options 宏。单击菜单工具 peripheral protein 菜单后，通过选择相同的项目来激活宏。在场 gaussian blur radius 像素中定义适当的值。
这会影响图片平滑和杂色减少。较低的值就足够了，不会导致任何图像信息丢失。现在，在字段配置文件 line width 像素中设置一个值。
较粗的线条会导致轮廓曲线的平滑度更高。建议使用 10 像素的默认值。设置图像标题，按示例分隔符和导出项目的定义进行解析。
单击 OK（确定）。在下一个对话框窗口中检查标题解析，然后单击 OK 或 back to reset。接下来，在处理后的图像中对质膜区域进行线性选择并测量荧光分布。为此，请从 Fiji 工具栏中选择 Fiji 工具的直线。
单击图像并在质膜区域上拖动一条线。该线必须从细胞外间隙开始，并应垂直于质膜。选择皮质细胞质层较厚、更均匀的区域。
线性选择的最佳长度为 5 到 10 微米。通过单击 Fiji 工具栏中的 take profile 工具来运行 take profile 宏。将对两个通道中的荧光曲线进行自动测量，数据将显示在结果窗口中。
根据单个信号的可变性，取每个单元的配置文件的代表性编号。运行绘图剖面数据宏，以图形方式可视化测量的剖面。在调用的宏对话框窗口中设置参数。
保持 Use filtering for input data 复选框未选中。通过单击相应的单选按钮，指定是应从结果窗口中的单个 CSV 文件的最新数据创建绘图，还是从指定目录中的所有 CSV 文件创建绘图。通过选中相应的复选框来指定将用于绘图的分组因子。
如果所有剖面都应显示在唯一图中，请选择因子 I。如果所有数据都应绘制在单个绘图中，请保持未选中复选框。单击 OK（确定）。在下一个对话框窗口中指定用于保存结果或最终数据导入的路径和文件名。
通过单击对话框窗口中的 OK 确认分析，其中显示了执行的 R 代码。如果某些绘制的配置文件在细胞外或细胞内空间有过多的信号，请运行配置文件过滤设置宏。然后在调用的宏对话框窗口中设置参数。
对于每个通道，在文件中设置适当的强度阈值，删除细胞外或细胞内信号过多的测量值。指定将在 X 坐标小于或大于 X 坐标处应用强度阈值的区域，然后单击 OK（确定）。再次运行绘图剖面数据宏，并选中 Use filtering for data input 复选框。现在添加之前保存的文件中的数据。
确保已成功删除所有异常配置文件，否则，请改进过滤参数。运行 create model 宏，根据校准数据创建质膜和细胞质荧光分布的模型。按照文本协议中的详细说明在调用的宏对话框窗口中设置参数后，单击 OK。在下一个对话框窗口中指定输入文件路径和名称，并通过在显示已执行 R 代码的对话框窗口中单击 OK 来确认分析。
接下来，处理表达目标蛋白质的细胞的图像。像以前一样导入图像并设置分析。平滑和线宽应相同。
继续测量配置文件。通过绘图检查截面的准确性，并根据需要设置过滤，如前所述。运行 calculate distribution 宏以计算质膜和细胞质中的蛋白质分配。
指定输入数据和模型源，并最终设置数据筛选。保持该复选框处于激活状态，以删除残差变异性大于所需结果筛选的结果。指定最大允许残差可变性的阈值，该阈值可能无法通过单个轮廓测量的信号分解来解释。
选择可用于创建箱形图的样本分组因子。单击 OK，指定输入或输出路径，然后在显示已执行 R 代码的对话框窗口中单击 OK，以确认分析。这里显示的是表达植物蛋白的 FM 4-64 染色细胞的图像，植物蛋白通过 N-肉豆蔻酰化和与磷酸肌醇的静电相互作用与质膜相关。
这些相互作用在实验上受到渥曼青霉素的干扰。通过甘氨酸在作为 N-肉豆豆酰化位点的第二个氨基酸位置的突变来测试 N-肉豆蔻酰化的重要性。通过截断蛋白质的 N 末端结构域来测试去除两种质膜结合能力的效果。
所得箱形图显示 N-肉豆蔻酰化位点突变后和药物治疗后质膜亲和力降低。它们的相互效应与去除 N 末端结构域的效果相当。观看此视频后，您应该对如何按正确的顺序执行分析的主要步骤以及如何设置其参数有很好的了解。
在此分析之后，可以执行方差分析等统计方法对获得的数据进行统计评估。虽然这种方法是为植物悬浮细胞开发的，但它也可以应用于其他细胞或具有光滑且清晰可区分的质膜的组织。
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概述
本文介绍了一种用于定量分析带荧光标签的外周相关蛋白质与质膜结合的协议。该方法允许在不需要复杂显微镜的情况下，实时观察蛋白质分布。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
- 蛋白质分析
背景
- 理解细胞信号传导途径在细胞生物学中至关重要。
- 光衍射使得膜分区的评估变得复杂。
- 荧光标记用于可视化蛋白质定位。
- 该方法简化了蛋白质分布的分析。
研究目的
- 提供一个快速有效的蛋白质定位分析协议。
- 实现对细胞中蛋白质分布的实时观察。
- 解决蛋白质膜结合定量化的挑战。
使用的方法
- 根据协议准备生物材料。
- 用FM 4-64染料染色。
- 荧光信号的计算分解。
- 蛋白质分布的实时观察。
主要结果
- 该方法能够有效地定量质膜结合。
- 实时观察提供了对蛋白质动力学的洞察。
- 通过计算方法解决了光衍射的挑战。
- 该协议适用于各种生物材料。
结论
- 该协议提供了一种研究蛋白质定位的简单方法。
- 它增强了对细胞信号传导途径的理解。
- 该方法易于使用，不需要高级显微镜。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation. This microscopy-based workflow provides rapid, reproducible quantification of protein localization dynamics, supporting predictive confidence in pathway interrogation and compound mechanism studies. The method's compatibility with diverse cell types and its integration with open-source analytical tools position it as a reusable capability for portfolio-wide R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of protein-membrane interactions critical for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing membrane-associated versus cytoplasmic protein pools.
- Facilitates evaluation of mutant proteins, inhibitor effects, and signaling pathway perturbations.
- Provides rapid feedback for hypothesis-driven target triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative fluorescence profiles for assay development.
- Enables reproducible measurement of subtle and dynamic changes in protein localization.
- Supports screening of compound libraries for effects on membrane association.
- Allows platform reuse across multiple protein targets and cell systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by quantifying protein localization changes in response to perturbations.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for membrane-associated targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative localization data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a standardized approach for quantifying protein partitioning at the plasma membrane, supporting both mechanistic studies and screening workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying membrane versus cytoplasmic localization.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs suitable for compound and mutant screening.
- Analytics: Generates fluorescence intensity profiles and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Enables alignment with biomarker strategies by quantifying dynamic localization changes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, open-source workflow adaptable across targets and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes quantification and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust localization data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-associated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to confocal imaging platforms and computational infrastructure (ImageJ, R).
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters.
- Adaptable to various cell types with smooth, distinguishable plasma membranes.
- Limited to non-neighboring cell membranes and may require optimization for specific biological contexts.
