利用酶联免疫吸附测定法表征小鼠胸腺依赖性和非胸腺依赖性免疫球蛋白同种型应答

该方法有助于解答免疫学领域中关于抗原免疫诱导的依赖性与非依赖性抗体应答，以及B细胞活化和生发中心反应的关键问题。该技术的主要优势在于，能够提供可靠且定量的Ig同种型应答测量结果，并可直接比较小鼠中B细胞活化与体液免疫应答。进行TNP-多糖抗原免疫时，为每只小鼠准备一支1毫升胰岛素注射器，装入100 µL新鲜配制的抗原溶液，将针头以约30度角插入每只动物的右下腹区域，以避免刺入下部器官。

所有小鼠注射完成后，将动物放回笼中，并在无特定病原体环境中饲养。在适当的实验时间点，通过眶后静脉丛采血，从每只免疫动物采集150至200 µL血液，于室温下静置1至2小时使样本凝固。孵育结束后，离心已凝固的血液样本，将每份血凝块上层的澄清血清转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。

经过第二次离心以去除任何残留的血凝块后，将50微升血清转移至单独的无菌1.5毫升微量离心管中，于-80摄氏度保存。包被前，用适当浓度的小鼠Ig同型特异性捕获抗体对单个96孔免疫板进行包被，用于总血清Ig同型检测；或用TNP-38BSA抗原包被用于TNP特异性Ig同型检测；或用TNP-3BSA抗原包被用于高亲和力TNP特异性Ig同型检测，并将包被后的板在4摄氏度孵育过夜。次日早晨，每孔加入200微升洗涤缓冲液，洗涤两次。

每次洗涤后，弃去洗涤缓冲液，并将酶标板在叠放的纸巾上轻轻拍干。接着，每孔加入 200 微升封闭缓冲液，在室温下封闭 1 小时。在封闭酶标板的同时，于另一块未经处理的 96 孔板中，按每孔 150 微升的量，配制相应的标准品、血清稀释液和封闭缓冲液，具体操作如图所示。

然后按照演示方法用洗涤缓冲液洗涤ELISA板，并向ELISA板的相应孔中各加入100微升稀释后的Ig同种型标准品和血清样本。在4摄氏度下孵育过夜后，按照演示方法洗涤平板，然后每孔加入100微升用封闭缓冲液稀释的适当碱性磷酸酶标记的同种型特异性抗体，室温孵育1至2小时。孵育结束后，洗涤平板，并向每孔加入100微升 freshly prepared底物溶液。

在室温下监测反应在接下来几分钟内的变化。当反应足够明显可分析时，将板放入微孔板读数仪中，点击设置，将波长设定为405纳米。点击确定，然后点击模板，根据96孔板的设置指定相应的空白孔、标准品孔和未知样品孔。

当最高浓度的标准品达到约1、1.5、2和2.5的光密度值时，点击“读取”以读取酶标板，并在每次分析后保存所得数据文件。在未进行免疫的情况下，与性别和年龄相匹配的B细胞特异性TNF受体相关因子3（B-TRAF3）充足同窝对照小鼠相比，B细胞特异性TNF受体相关因子3（B-TRAF3）基因敲除小鼠的血清基础水平中IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA均有所升高。在使用TNP-多糖或TNP-KLH免疫后第7天，如上所述进行分析，胸腺非依赖性免疫球蛋白同型对免疫的应答结果显示，髓系细胞特异性TRAF3基因敲除小鼠的胸腺非依赖性TNP特异性IgG3水平显著升高，同时胸腺依赖性TNP特异性IgG2b水平也较同窝对照小鼠升高。

此外，对胸腺依赖性小鼠在TNP-KLH免疫后产生的初次及记忆免疫应答的评估表明，T细胞特异性TRAF3基因敲除小鼠中存在部分降低的胸腺依赖性IgM初次应答，以及受损的IgG1初次应答和记忆应答。在进行该实验操作时，需注意ELISA检测具有检测限，通常由标准曲线的线性范围决定，因此可能需要对样本进行多个稀释度的检测。在完成该操作后，可进一步采用流式细胞术或L spot等其他互补方法，以在特定实验条件下全面了解抗体应答情况。