Name: 酶联免疫吸附法表征小鼠胸腺依赖性和胸腺独立免疫球蛋白同种反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 学习使用酶联免疫吸附法表征小鼠胸腺依赖性和胸腺独立性免疫球蛋白同种反应。该方法可定量检测B细胞活化与体液免疫应答，为免疫学研究提供可靠数据支持。

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本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R01 CA158402（P. Xie）和 R21 AI128264（P. Xie），美国国防部资助项目编号 W81XWH-13-1-0242（P. Xie），新泽西癌症研究所通过美国国家癌症研究所资助项目编号 P30CA072720 提供的试点奖（P. Xie），Busch 生物医学资助（P. Xie），Victor Stollar 研究员奖（A. Lalani），以及 Anne B. 和 James B. Leathem 研究员奖（S. Zhu）。

本方案遵循罗格斯大学机构动物研究伦理委员会的指导原则。所有小鼠的使用均符合美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案许可。
1. 小鼠的准备及 naive 小鼠血清的采集
<ol>
	<li>将所有用于免疫实验的小鼠饲养在特定病原体阴性动物设施中。</li>
	<li>使用性别匹配、年轻成年（8–12 周龄）的基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠进行免疫研究，这些小鼠应具有相同的父母和共同的饲养笼盒。</li>
	<li>按照图1所示安排免疫和血清采集时间表。</li>
	<li>在免疫前 7 天（-7 天）采集每只小鼠的初始血清。按照下文第 4 步详述的眶后采血和血清制备操作步骤进行。</li>
</ol>
2. TNP-多糖（一种TI抗原）和TNP-KLH（一种TD抗原）的制备
<ol>
	<li>将抗原粉末充分溶解于无菌 PBS（pH 7.4）中，配制终浓度为 0.5 mg/mL 的 TNP-多糖储备液和 1 mg/mL 的 TNP-KLH 储备液。将每种抗原储备液以 0.5 mL/管分装至无菌微量离心管中，于 -80 °C 长期保存。避免抗原分装液反复冻融。</li>
	<li>在注射当天，根据待注射小鼠数量计算所需 TNP-多糖（50 µg/100 µL/小鼠）或 TNP-KLH（100 µg/100 µL/小鼠）的体积。在室温（RT）下解冻相应数量的 TNP-多糖或 TNP-KLH 分装液。</li>
	<li>对于 TNP-KLH 注射，首先将佐剂明矾（40 mg/mL）用 3 倍体积的无菌 PBS 稀释，使其终浓度为 10 mg/mL。稀释前确保明矾佐剂混合物充分悬浮均匀。</li>
	<li>取步骤 2.3 中的 10 mg/mL 明矾佐剂悬液与解冻后的 TNP-KLH 溶液（1 mg/mL）等体积混合，加入 5 mL 聚丙烯管中，充分混匀，并于 37 °C 孵育 30 分钟。该 TNP-KLH/明矾混合物需在注射前新鲜配制。</li>
</ol>
3. 小鼠免疫
<ol>
	<li>进行腹腔内（i.p.在生物安全柜中使用1 mL胰岛素注射器，通过皮下注射TNP-多糖或TNP-KLH/氢氧化铝以免疫小鼠。将针头以约30°角插入每只小鼠的右下腹区域，以避免注入内脏器官。</li>
	<li>注射 i.p. 第0天每只小鼠注射100 µL TNP-多糖用于TI抗原免疫（图1A).</li>
	<li>注射 腹腔注射 每只小鼠在第0天注射200 µL TNP-KLH/氢氧化铝混合物（于步骤2.4中新鲜配制），用于TD抗原免疫。在第21天重复相同注射，作为加强免疫，用于记忆研究图1B).</li>
	<li>注射后，将每只小鼠放回其笼中，并将所有注射过的小鼠置于无特定病原体条件下饲养。</li>
</ol>
4. 眶后静脉采血及血清制备
<ol>
	<li>在不同时间点采集小鼠血清：对于TNP-多糖免疫，分别在第-7天和第7天采集小鼠血清图1A）；对于TNP-KLH/氢氧化铝免疫，在第-7、7、14和28天采集小鼠血清（图1B).</li>
	<li>对于眶后静脉丛采血，将每只小鼠置于生物安全柜中，用 5% 异氟烷麻醉 1–2 分钟25对每只小鼠进行足底反射测试，以确保麻醉充分。</li>
	<li>用一只手握住麻醉后的小鼠，以食指和拇指向后牵拉眼球周围的皮肤，使眼球突出于眼窝外25将一支未涂肝素的巴斯德吸管或毛细管以45°角插入眼球下方眼窝内侧角落25.</li>
	<li>施加轻柔的向下压力，同时轻轻旋转移液器或试管，刺入静脉并收集150–200 µL血液至移液器或试管中。立即将血液转移至无菌的1.5 mL离心管中，并将小鼠放回笼中恢复。</li>
	<li>让血液样本在室温下静置1–2小时以凝固。</li>
	<li>将凝固的血液样本在13,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。将位于血凝块上层的澄清血清转移至新的无菌 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>重复步骤4.6一次，以去除残留的血凝块并收集澄清的血清。</li>
	<li>将血清分装至无菌的1.5 mL离心管中，每管50 µL，并将血清于-80 °C保存。</li>
	<li>在不同时间点交替从双眼取血，确保每只眼睛在整个实验过程中最多取血两次。在末次取血时，安乐死前从每只小鼠收集最多1 mL血液。使用5% CO2 随后进行颈椎脱位处死。 
	注意：可收获脾脏B细胞用于流式细胞术分析 体外 培养研究。我们还从脾细胞中提取基因组DNA，以验证每只小鼠的基因型。</li>
</ol>
5. 小鼠Ig同种型特异性ELISA
<ol>
	<li>在进行ELISA之前准备缓冲液和溶液。
	<ol>
		<li>准备500 mL偶联缓冲液（PBS，pH 7.4）。</li>
		<li>准备500 mL洗涤液（PBS-T（含0.05% Tween 20），pH 7.4）。</li>
		<li>准备100 mL封闭缓冲液（含1% BSA的PBS，pH 7.4，4 °C保存）。</li>
		<li>准备1 L底物缓冲液（1 M二乙醇胺，pH 9.8（将97 mL二乙醇胺溶于1 L H2O中，用10 M HCl调节pH）并含0.5 mM MgCl2）。用铝箔包裹瓶子以避光保护底物缓冲液。4 °C保存。</li>
		<li>准备100 mL终止液（3 M NaOH）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被ELISA板：
	<ol>
		<li>进行总血清Ig同型ELISA时，用10 µg/mL的同型特异性多克隆山羊抗小鼠Ig（M、G1、G2a、G2b、G3、A或E）抗体溶于偶联缓冲液（PBS）中，以每孔100 µL包被96孔免疫板。</li>
		<li>进行TNP特异性Ig同型ELISA时，用10 µg/mL的TNP(38)-BSA溶于PBS中，以每孔100 µL包被96孔免疫板。</li>
		<li>进行高亲和力TNP特异性Ig同型ELISA时，用10 µg/mL的TNP(3)-BSA溶于PBS中，以每孔100 µL包被96孔免疫板26。将板在4 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被孵育后，用每孔200 µL PBS-T洗涤板2次。每次洗涤后弃去洗涤缓冲液，并将板拍干（将每块板倒扣在纸巾堆上轻拍）。</li>
	<li>封闭板：向已包被的板中每孔加入200 µL封闭缓冲液（含1% BSA的PBS），在室温下孵育1小时。</li>
	<li>在板封闭的同时，在另一块未经处理的96孔板中，用封闭缓冲液稀释Ig同型标准品和血清样品，每孔150 µL。
	<ol>
		<li>将Ig同型标准品配制成250 ng/mL作为起始标准浓度（St01），并进行7至10次1:2倍比稀释（St02至St07或St10，图2A）。</li>
		<li>将小鼠血清样品以1:100或1:500作为起始稀释倍数，对总Ig同型每份样品进行3或4次1:10倍比稀释，对TNP特异性Ig同型每份样品进行1:5倍比稀释（图2A）。对于IgE ELISA，将小鼠血清样品以1:2作为起始稀释倍数，并对每份样品进行3次1:5倍比稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭结束后，用每孔200 µL PBS-T将第5.4步中的板洗涤3次，每次洗涤后拍干。</li>
	<li>将第5.5步中稀释的Ig同型标准品（适用于捕获和检测抗体）及稀释的血清样品各100 µL/孔转移至第5.6步准备的板中。将板连同样品和标准品在4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用每孔200 µL PBS-T洗涤板3次，每次洗涤后拍干。</li>
	<li>在每块板中，每孔加入100 µL用封闭缓冲液稀释的10 µg/mL适当碱性磷酸酶（AP）标记的同型特异性山羊抗小鼠Ig（M、G1、G2a、G2b、G3、A或E）抗体。</li>
	<li>将板与AP标记抗体在室温下孵育1–2小时。检测IgE时，在37 °C孵育1–2小时。</li>
	<li>通过将两片5 mg磷酸酶底物片剂溶解于10 mL底物缓冲液中，配制1 mg/mL的底物溶液。</li>
	<li>每块板用每孔200 µL PBS-T洗涤5次，每次洗涤后拍干。</li>
	<li>向每块板每孔加入100 µL底物溶液。在室温下显色反应，通常仅需几分钟。</li>
	<li>使用酶标仪及其配套软件在405 nm处读取每块板。
	<ol>
		<li>点击 &#34;Settings&#34; 设置波长 &#34;Lm1&#34; 为 &#34;405 nm&#34;，然后点击 &#34;OK&#34;。</li>
		<li>点击 &#34;Template&#34;，根据96孔板设置分配 &#34;Blank&#34; 孔、&#34;Standards&#34; 孔和 &#34;Unknown&#34; 孔。</li>
		<li>对于 &#34;Standards&#34; 孔，点击 &#34;Series&#34;，将 &#34;First Sample&#34; 设为 &#34;St01&#34;，选择 &#34;Start From&#34; 为 &#34;Top&#34;，并将 &#34;Replicates&#34; 设为 &#34;2&#34;。勾选 &#34;Sample Descriptor&#34;，输入 &#34;Standard Value&#34;：选择 &#34;Units&#34; 为 &#34;ng/mL&#34;，设置 &#34;Starting value&#34; 为 &#34;250&#34;，设置 &#34;Step by&#34; 为 &#34;2&#34;。点击 &#34;OK&#34;。</li>
		<li>当最高浓度标准品的光密度（OD）达到约1时，点击 &#34;Read&#34; 读取板。</li>
		<li>点击 &#34;File&#34; 菜单，然后点击 &#34;Save&#34; 保存文件。</li>
		<li>当最高浓度标准品的OD405分别接近约1.5、2和2.5时，点击 &#34;Read&#34; 再次读取板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过每孔加入25 µL 3 M NaOH终止反应。每次完成一个板的第5.12至5.15步。</li>
	<li>使用酶标仪配套软件分析ELISA数据：
	<ol>
		<li>检查读取文件中Ig同型标准品的OD405值，选择标准品具有良好线性范围的一次读数进行详细数据分析。</li>
		<li>选择四参数拟合程序绘制标准曲线。检查标准曲线的相关系数（R2），其值必须 &#62; 0.98，以确保数据质量良好。</li>
		<li>检查各样品的OD405值是否随稀释倍数增加而降低。通过点击 &#34;Unknowns&#34; 获取所有稀释样品孔的浓度。</li>
		<li>为每个样品选择一个OD405值落在Ig同型标准曲线线性范围内的适当孔用于浓度计算。</li>
		<li>使用公式计算各样品的血清Ig同型浓度：血清Ig浓度 = 所选孔浓度 × 稀释倍数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的软件绘制图表并进行统计分析9,10,11。绘制血清Ig同型水平的垂直散点图，以比较同一时间点的Ig应答。对于TD记忆应答研究，绘制时间进程应答曲线，以观察加强免疫前后Ig同型应答的变化。使用误差线表示每组样品的标准差（SD）。比较两种基因型小鼠之间的Ig同型应答时，使用双尾非配对t检验确定统计学显著性。将p值 &#60; 0.05视为差异显著。</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文描述了利用ELISA法对小鼠TD和TI Ig同种型应答进行表征的实验方案。成功实施本方案需要使用表1中列出的材料，包括ELISA检测板、免疫原性抗原、小鼠Ig同种型特异性抗体及标准品。应注意避免使用经组织培养处理的ELISA板。标准品和血清样本的稀释应在单独的未经处理的板（圆底板）中进行，然后加入ELISA板中。采用本方案，我们 consistently 获得了具有高特异性和高灵敏度的可靠结果。
本方案中的关键步骤包括抗原免疫、眶后取血以及Ig同种型特异性ELISA。对于TD抗原免疫，TNP-KLH/氢氧化铝混合物应充分重悬，以确保注入正确剂量的抗原/佐剂。在眶后取血过程中，若血液在移液管或毛细管中发生凝固，应立即更换新的移液管或毛细管。ELISA中使用的缓冲液和试剂应为澄清溶液，不得含有沉淀物，否则可能导致假阳性结果，并出现异常的OD405值。此外，在ELISA的各个步骤中均应避免产生气泡，因为气泡也可能导致假阳性或假阴性结果，并引起OD405值异常。通过设置样本重复孔分析，可将这些偶发性误差降至最...

B淋巴细胞是体液免疫中的主要参与者，也是哺乳动物体内唯一能够产生抗体（也称为免疫球蛋白，Ig）的细胞类型1,2。B细胞分泌的抗体通过多种机制（包括中和作用、调理作用和补体激活）对入侵的病原体提供强有力的防御，从而产生保护性免疫3。B细胞只有在特定B细胞被完全激活后才能分泌抗体，而这一过程通常需要两个不同的信号3。信号1由抗原（Ag）直接与初始B细胞表面表达的B细胞受体（BCR）结合而传递3。根据信号2的来源不同，B细胞的激活可分为胸腺依赖性（TD）和胸腺非依赖性（TI）两种类型3,4。在TD抗原应答中，信号2由活化的同源CD4辅助性T细胞（TH）提供，这些T细胞表达CD154，即B细胞上共刺激受体CD40的配体1,2,3。在TI抗原应答中，信号2来源于B细胞上Toll样受体（TLR）的激活（对于TI-1型抗原）或BCR的广泛交联（对于TI-2型抗原）3,4。1型TI（TI-1）抗原是TLR的微生物配体，包括细菌脂多糖（LPS）、病毒RNA和微生物CpG DNA4,5。2型TI（TI-2）抗原具有高度重复的结构，能够通过BCR的多次交联向B细胞传递持久且持续的信号4,6。典型的TI-2抗原包括肺炎球菌多糖和半抗原偶联的多糖6,7。TD和TI抗原均可引发强烈的抗原特异性IgM应答，并在抗原呈递细胞（APC）如树突状细胞（DC）的帮助下诱导产生类别转换的抗体（IgG、IgA和IgE）1,2,3。此外，在APC的帮助下，TD和TI抗原均能诱导记忆性免疫应答，但TD抗原在诱导记忆B细胞生成方面效率更高3,8。
在此方案中，通过腹腔内（i.p.) 分别用半抗原偶联的模型抗原2,4,6-三硝基苯基-钥孔血蓝蛋白（TNP-KLH）和TNP-多糖（中性、高度分支且高分子量）进行免疫9,10,11TD抗原通常与佐剂联合使用，以增强抗体的产生12在此实验方案中，TNP-KLH 与明矾（alum）共同注射，明矾是免疫学研究中常用的佐剂12其他可使用的佐剂示例包括完全或不完全弗氏佐剂（CFA 或 IFA）、单磷酰脂质A/海藻糖二分枝酰基海藻糖（MPL-TDM）&#34;Ribi&#34; 佐剂）和CpG寡脱氧核苷酸， 等等。13,14免疫后，在不同时间点采集小鼠血清，采用Ig同种型特异性的酶联免疫吸附试验（ELISA）定量血清中TNP特异性抗体。9,10,11.
ELISA 是一种基于微孔板的检测方法，广泛用作医学诊断工具以及生物医学研究中的分析手段15,16。它可用于检测和定量分析抗体、激素、细胞因子、趋化因子以及各种抗原等分析物。etc。ELISA 可以采用多种不同形式进行，包括直接法、间接法、夹心法和竞争法 ELISA15,16。通常情况下，该方法首先将抗原固定在固相表面（通常为 96 孔微孔板），然后与一抗孵育。孵育后，洗去未结合的一抗。在直接 ELISA 中，一抗直接偶联到一种酶（通常为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶），该酶可裂解显色底物，产生可见的颜色变化，通过分光光度计等信号检测仪器进行测定15,16。相反，如果使用酶标二抗来结合一抗，则称为间接 ELISA15,16。直接 ELISA 操作更快，而间接 ELISA 灵敏度更高15,16。在夹心 ELISA 中，微孔板包被一种&#34;捕获&#34;抗体，用于固定样本中目标抗原，随后通过另一种&#34;检测&#34;抗体以直接或间接方式检测被捕获的抗原15,16。由于抗原被两种不同的抗体识别，夹心 ELISA 具有高特异性。在竞争 ELISA 中，样本中的抗原与固定在板上的抗原竞争结合一抗，然后通过测定底物信号的减弱程度来定量样本中抗原的浓度15,16。竞争 ELISA 可采用上述直接或间接模式进行，适用于仅含有一个表位的小分子抗原的检测15,16。
检测抗体的替代技术包括放射免疫测定法（radio-immunoassay, RIA）、电化学发光（electrochemiluminescence, ECL）测定法和表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）测定法17。RIA 是最早开发的免疫测定方法，利用放射性标记试剂以高特异性和高灵敏度检测抗原（或抗体）的存在18,19。然而，由于放射性毒性、处置成本、试剂保质期以及操作放射性物质所需的特殊许可等问题，ELISA 成为更优且更便捷的常规检测技术20,21。ECL 是一种高灵敏度的检测方法，通过电流在电极表面激发稳定的前体物质，产生高活性物种，从而启动化学发光反应，可用于测定分析物（如抗原或抗体）的含量22。然而，ECL 需要专用仪器，因此其应用不如 ELISA 广泛23。SPR 是一种直接检测方法，可用于测量配体（e.g.，抗体）与固定在传感器芯片表面的分子（e.g.，抗原）之间的结合情况24。SPR 能够非常特异地实时检测分子相互作用，且无需像 ELISA 那样使用标记试剂。然而，SPR 同样需要专用设备，且灵敏度低于 ELISA17。鉴于这些替代方法的局限性，ELISA 是本实验方案中最适合且最便捷的技术。本文描述了夹心 ELISA 在总 Ig 同种型水平分析中的应用，以及间接 ELISA 在抗原特异性 Ig 同种型分析中的操作步骤。

<table><tbody><tr><td>VersaMax 可调式微孔板读板仪</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>用于读取微孔板的设备</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>微孔板读板仪配套软件</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>用于绘图和统计分析的软件</td></tr><tr><td>TNP-AECM-多糖（FICOLL）</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>用于免疫的TI抗原</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>用于免疫的TD抗原</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10（偶联比例：38）</td><td>TNP特异性ELISA包被抗原</td></tr><tr><td>TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10（偶联比例：3）</td><td>用于高亲和力TNP特异性Ig检测的包被抗原</td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>用于免疫的氢氧化铝佐剂</td></tr><tr><td>Falcon 聚丙烯管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>用于TNP-KLH/氢氧化铝的孵育</td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>用于小鼠腹腔注射</td></tr><tr><td>Immuno 96孔平底板</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>用于ELISA实验</td></tr><tr><td>未处理96孔微孔板，圆底</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>用于标准品和样品的系列稀释</td></tr><tr><td>磷酸酶底物，5 mg片剂</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>AP底物</td></tr><tr><td>二乙醇胺</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>AP底物缓冲液的组分</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>小鼠IgM捕获抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>小鼠IgG1捕获抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>小鼠IgG2a捕获抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>小鼠IgG2b捕获抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>小鼠IgG3捕获抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>小鼠IgA捕获抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>小鼠IgE捕获抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>小鼠IgM检测抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>小鼠IgG1检测抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>小鼠IgG2a检测抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>小鼠IgG2b检测抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>小鼠IgG3检测抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>小鼠IgA检测抗体</td></tr><tr><td>AP-山羊抗小鼠IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>小鼠IgE检测抗体</td></tr><tr><td>小鼠IgM标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>TNP特异性IgM，克隆&amp;nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>小鼠IgG1标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>TNP特异性IgG1，克隆&amp;nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>小鼠IgG2a标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>TNP特异性IgG2a，克隆&amp;nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>小鼠IgG2b标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>TNP特异性IgG2b，克隆&amp;nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>小鼠IgG3标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>KLH特异性IgG3，克隆&amp;nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>小鼠IgA标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>矿物油诱导的IgA，克隆&amp;nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>小鼠IgE标准品</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>TNP特异性IgE，克隆&amp;nbsp; C38-2</td></tr></tbody></table>

利用酶联免疫吸附测定法表征小鼠胸腺依赖性和非胸腺依赖性免疫球蛋白同种型应答

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

抗体，也称为免疫球蛋白（Ig），由分化的B淋巴细胞、浆母细胞/浆细胞在体液免疫中分泌，可通过多种机制对入侵的病原体提供强有力的防御。疫苗接种的主要目标之一是诱导产生具有保护作用的抗原特异性抗体，以预防危及生命的感染。胸腺依赖性（TD）和胸腺非依赖性（TI）抗原均可引发强烈的抗原特异性IgM应答，并在抗原呈递细胞（APCs）的协助下，诱导发生同种型转换的抗体（IgG、IgA和IgE）的产生以及记忆B细胞的形成。本文描述了一种利用酶联免疫吸附测定（ELISA）在小鼠中表征TD和TI Ig同种型应答的实验方案。在该方案中，通过腹腔内注射在小鼠中诱导TD和TI Ig应答。腹腔注射分别使用佐剂中的半抗原-偶联模型抗原TNP-KLH（在铝佐剂中）和TNP-多糖（在PBS中）进行免疫。为诱导TD记忆应答，在首次相同抗原/佐剂免疫后3周给予TNP-KLH铝佐剂加强免疫。在免疫前后不同时间点采集小鼠血清。随后分别采用Ig同型特异性的夹心ELISA和间接ELISA定量总血清Ig水平及TNP特异性抗体。为准确测定每种Ig同型的血清浓度，需将样本适当稀释，使其处于标准曲线的线性范围内。采用本方案，我们始终获得具有高特异性和灵敏度的可靠结果。当与其他互补方法（如流式细胞术）联合使用时， 体外 脾脏B细胞培养与免疫组化染色（IHC），该方案将使研究人员能够全面理解特定实验条件下的抗体应答。

我们已采用本方案研究免疫系统关键调控因子TRAF3在TI和TD Ig同种型应答中的作用9,10,11。TRAF3直接或间接调控多种先天性和适应性免疫受体的信号转导，包括TNF受体超家族、Toll样受体以及T细胞受体/CD28等27,28。我们假设TRAF3在不同免疫细胞亚群中发挥着不同的作用，以调控抗体应答。为验证该假设，我们利用条件性TRAF3基因敲除小鼠，分别在B细胞、T细胞或髓系细胞中特异性缺失Traf3基因，检测其TI和TD Ig同种型应答9,10,11。TI和...

本文介绍了一种利用酶联免疫吸附试验（ELISA）在小鼠中表征T细胞依赖性和非T细胞依赖性免疫球蛋白（Ig）同种型应答的实验方案。该方法可单独使用，也可与流式细胞术联合应用，有助于研究人员鉴定小鼠在接受T细胞依赖性和非T细胞依赖性抗原免疫后，B细胞介导的Ig同种型应答的差异。

抗体，也称为免疫球蛋白（Ig），由分化的B淋巴细胞、浆母细胞/浆细胞在体液免疫中分泌，提供一种……

该方法有助于解答免疫学领域中关于抗原免疫诱导的依赖性与非依赖性抗体应答，以及B细胞活化和生发中心反应的关键问题。该技术的主要优势在于，能够提供可靠且定量的Ig同种型应答测量结果，并可直接比较小鼠中B细胞活化与体液免疫应答。进行TNP-多糖抗原免疫时，为每只小鼠准备一支1毫升胰岛素注射器，装入100 µL新鲜配制的抗原溶液，将针头以约30度角插入每只动物的右下腹区域，以避免刺入下部器官。所有小鼠注射完成后，将动物放回笼中，并在无特定病原体环境中饲养。在适当的实验时间点，通过眶后静脉丛采血，从每只免疫动物采集150至200 µL血液，于室温下静置1至2小时使样本凝固。孵育结束后，离心已凝固的血液样本，将每份血凝块上层的澄清血清转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。经过第二次离心以去除任何残留的血凝块后，将50微升血清转移至单独的无菌1.5毫升微量离心管中，于-80摄氏度保存。包被前，用适当浓度的小鼠Ig同型特异性捕获抗体对单个96孔免疫板进行包被，用于总血清Ig同型检测；或用TNP-38BSA抗原包被用于TNP特异性Ig同型检测；或用TNP-3BSA抗原包被用于高亲和力TNP特异性Ig同型检测，并将包被后的板在4摄氏度孵育过夜。次日早晨，每孔加入200微升洗涤缓冲液，洗涤两次。每次洗涤后，弃去洗涤缓冲液，并将酶标板在叠放的纸巾上轻轻拍干。接着，每孔加入 200 微升封闭缓冲液，在室温下封闭 1 小时。在封闭酶标板的同时，于另一块未经处理的 96 孔板中，按每孔 150 微升的量，配制相应的标准品、血清稀释液和封闭缓冲液，具体操作如图所示。然后按照演示方法用洗涤缓冲液洗涤ELISA板，并向ELISA板的相应孔中各加入100微升稀释后的Ig同种型标准品和血清样本。在4摄氏度下孵育过夜后，按照演示方法洗涤平板，然后每孔加入100微升用封闭缓冲液稀释的适当碱性磷酸酶标记的同种型特异性抗体，室温孵育1至2小时。孵育结束后，洗涤平板，并向每孔加入100微升 freshly prepared底物溶液。在室温下监测反应在接下来几分钟内的变化。当反应足够明显可分析时，将板放入微孔板读数仪中，点击设置，将波长设定为405纳米。点击确定，然后点击模板，根据96孔板的设置指定相应的空白孔、标准品孔和未知样品孔。当最高浓度的标准品达到约1、1.5、2和2.5的光密度值时，点击“读取”以读取酶标板，并在每次分析后保存所得数据文件。在未进行免疫的情况下，与性别和年龄相匹配的B细胞特异性TNF受体相关因子3（B-TRAF3）充足同窝对照小鼠相比，B细胞特异性TNF受体相关因子3（B-TRAF3）基因敲除小鼠的血清基础水平中IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA均有所升高。在使用TNP-多糖或TNP-KLH免疫后第7天，如上所述进行分析，胸腺非依赖性免疫球蛋白同型对免疫的应答结果显示，

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科研

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免疫学与感染

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