一种利用阿米巴进行的快速基于图像的细菌毒力检测方法

该方法有助于解答细菌致病性研究领域中的关键问题，例如细菌细胞在何时表达杀伤宿主的毒力效应因子，以及附着于表面的植入性细菌亚群具有何种毒力状态？该技术的主要优势在于快速、可定量，且宿主细胞相对易于操作。我们最初产生该方法的想法，是源于观察到铜绿假单胞菌中附着于表面的植入性亚群具有不同的杀伤宿主表型。

按照文本方案所述，首先将大肠杆菌BR菌株过夜培养。然后将大肠杆菌培养物恢复至室温。使用木棒将阿米巴接种到750 µL的培养物中。

立即将700 µL的阿米巴-大肠杆菌混合物加入GYP平板中。倾斜平板，使菌液在平板表面均匀铺开。然后将平板置于可保持高湿度的盒子中。

将培养皿置于盒内，22 °C 条件下孵育四至五天。孵育结束后，使用无菌的移液器吸头从培养皿的一半区域收集变形虫孢子。然后在 1 mL PS 培养基中，用移液器反复吹打吸头上的变形虫，使其重新悬浮。

将接种混合物转移至含有25 mL添加了抗生素-抗真菌溶液的PS培养基的250 mL锥形瓶中。在22 °C、100 rpm的摇床中培养变形虫。将铜绿假单胞菌过夜培养后，用PSB培养基在6 cm培养皿中稀释菌液。

然后将培养物置于摇床上，设置转速为100 rpm，37 °C振荡培养。首先将50 mL含1%琼脂的DB缓冲液加入250 mL锥形瓶中，用微波炉加热熔化。向15 mL熔融琼脂中加入15 µL钙黄绿素AM，轻轻混匀。将熔融的琼脂混合物倒入12 cm × 10 cm的玻璃培养皿中，在室温下静置10分钟，使琼脂完全凝固。

接下来，使用金属尺和打印好的网格将凝固的琼脂垫切割成较小的 1.5 × 1.5 cm 片段。确保凝胶在使用前始终保持湿润。随后，为分离附着在表面的细胞，从培养皿中移除液体培养基。

然后用 1 mL 发育缓冲液洗涤培养皿，以去除浮游细胞。为检测表面附着细菌的毒力，从先前获得的表面附着细菌细胞中加入 10 µL 变形虫细胞。为分离浮游细胞，将 10 µL 培养物转移至新的培养皿中。

接下来，通过将 10 L 的阿米巴细胞与先前获得的浮游细菌混合，检测浮游细胞的毒力。立即将小块琼脂置于培养皿表面相应的细菌-阿米巴混合物上。然后，用移液器轻轻吸去多余液体，并让培养皿干燥 20 分钟。

用盖子盖住培养皿，并在室温下额外孵育 40 分钟。最后，使用荧光显微镜至少采集 100 个阿米巴细胞的图像。在本方案中，检测了浮游态和表面附着态铜绿假单胞菌细胞的毒力。

表面附着的野生型铜绿假单胞菌导致阿米巴呈现圆形细胞形态并伴有钙黄绿素荧光，表明阿米巴已被杀死。与浮游细胞相比，表面附着的野生型铜绿假单胞菌具有较高的宿主杀伤指数。浮游细胞被阿米巴吞噬，表现为阿米巴细胞形态不规则且钙黄绿素荧光较弱。

进行该实验操作时，重要的是要记得使用新鲜的钙黄绿素AM（calcein AM）储备液和阿米巴细胞，并密切监测阿米巴细胞的光密度。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如转录谱分析），以回答更多科学问题，例如：浮游状态和表面附着亚群中的阿米巴激活了哪些基因？观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展基于快速成像的毒力测定实验。