A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

该方法可以帮助回答细菌发病机制领域的关键问题，例如何时在细菌细胞中表达宿主杀伤毒力效应子，以及表面附着的植入细胞的毒力状态是什么？该技术的主要优点是速度快、定量多，并且宿主细胞相对容易处理。当我们注意到假单胞菌的表面附着种植体亚群具有不同的宿主杀伤表型时，我们首先想到了这种方法。

开始生长大肠杆菌菌株 BR 过夜，如文本方案中所述。然后将大肠杆菌培养物置于室温下。使用木棍，将变形虫接种到 750 升培养物中。

立即将 700 升变形虫大肠杆菌混合物添加到 GYP 板中。倾斜板，将培养物均匀地铺在板表面。然后将板放入保持高湿度的盒子中。

将板放在盒子内，在 22 C 下孵育 4 到 5 天。孵育期结束后，使用无菌移液器吸头从板的一半收集变形虫孢子。然后上下移液，将移液器吸头上的变形虫重悬于 1 mL PS 培养基中。

将接种混合物转移到装有 25 mL PS 培养基的 250 mL 培养瓶中，并补充有抗生素抗真菌溶液。在 22 C 的旋转振荡器中以 100 rpm 的速度生长变形虫。将铜绿假单胞菌培养过夜后，在 6 cm 培养皿中用 PSB 培养基稀释培养物。

然后在 37 °C 下设置为 100 rpm 的台式旋转器上摇动培养物，首先在 250 mL 烧瓶中微波加入 50 mL 1% 琼脂的 DB 缓冲液中。将 15 L 钙 AM 添加到 15 mL 熔融琼脂中，轻轻混合。将熔融琼脂混合物倒入 12 x 10 cm 的玻璃板中，让琼脂在室温下凝固 10 分钟。

接下来，使用金属尺和印刷网格将凝固的琼脂垫切成更小的 1.5 x 1.5 厘米的部分。确保凝胶保持水合状态，直到准备好使用。接下来，要分离附着在表面的细胞，请从培养皿中取出液体培养基。

然后用 1 mL 显影缓冲液洗涤培养皿以去除浮游细胞。为了测定表面附着的细菌细胞的毒力，从先前获得的表面附着的细菌细胞中加入 10 L 变形虫细胞。要分离浮游细胞，请将 10 L 培养物转移到新鲜的培养皿中。

接下来，通过将 10 L 变形虫细胞与先前获得的浮游细菌混合来测定浮游细胞的毒力。立即将小琼脂垫放在培养皿表面适当的细菌变形虫混合物上。然后，轻轻吸取多余的液体，去除多余的液体，让培养皿干燥 20 分钟。

盖上盖子，在室温下再孵育 40 分钟。最后，使用荧光显微镜获取至少 100 个变形虫细胞的图像。在该方案中，测定了浮游和表面附着的铜绿假单胞菌细胞的毒力。

表面附着的野生型 铜绿假单胞菌 杀死了变形虫，表现为圆形变形虫细胞形状和钙黄绿素荧光的存在。与浮游细胞相比，表面附着的野生型 铜绿假单胞菌 具有较高的宿主杀伤指数。浮游细胞被变形虫消耗，表现为无定形的变形虫细胞形状和相对较少的钙黄绿素荧光。

在尝试此过程时，重要的是要记住使用新鲜的钙黄绿素 AM 和变形虫细胞库存，并密切跟踪变形虫的光密度。按照此程序，可以执行其他方法（如转录分析）以回答其他问题，例如哪些基因在浮游和表面附着的亚群中被激活？观看此视频后，您应该对如何进行基于图像的快速毒力测定有很好的了解。