基于气相色谱-质谱 (gc-ms) 的新陈代谢的果蝇幼虫样品的制备

这种方法可以回答代谢领域的关键问题，例如癌代谢物 L2-羟基戊二酸是如何在健康细胞中合成的。该技术的主要优点是它允许用户以灵敏且可重现的方式直接测量 100 多种代谢物。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为该方案需要高效的样品处理，并且对水蒸气极为敏感。

要开始该方案，将 1 毫升冰冷的 0.9% 氯化钠加入含有先前制备的幼虫的 1.5 毫升试管中。盖上盖子，垂直翻转试管以彻底清洗幼虫，然后将试管放在冰上 30 秒。幼虫会沉到管底，但酵母会保持悬浮状态。

一旦所有幼虫都形成松散的颗粒，使用 1 毫升移液器去除氯化钠溶液。将样品在 4 摄氏度下以 2， 000 g 离心 1 分钟。使用 200 微升移液器去除所有残留溶液，并立即将样品冷冻在液氮中。

使用耐乙醇标记物标记 2 mL 螺口盖微珠管的侧面。接下来，使用能够准确测量 0.01 毫克的分析天平对标记的珠管的质量进行去皮。使用长镊子从液氮杜瓦瓶中取出 1.5 mL 样品管。

戴上丁腈手套，抓住冷冻管，将其倒置，然后用力敲打管盖，使冷冻沉淀脱落。立即将沉淀物倒入预先去皮的 2 毫升螺旋盖珠管中。必须快速处理样品，以确保内源性代谢途径不会被重新激活。

快速测量幼虫颗粒和珠管的总质量。立即将样品管放入液氮中。将样品管放入负 20 摄氏度的台式冷却器中。

向每管中加入 0.8 毫升预冷的 90% 甲醇，每毫升含 2 微克琥珀酸-D4 酸。将样品放回负 20 摄氏度的台式冷却器中。将 0.8 毫升预冷的 90% 甲醇（每毫升含 2 μg 硫辛酸-D4 酸）加入空珠管中，设置阴性对照。

然后，使用位于 4 摄氏度温度控制室中的珠磨机均质器，以每秒 6.45 米的速度将样品均质化 30 秒。将均质化的样品放回负 20 摄氏度的台式冷却器中，并将冷却器转移到负 20 摄氏度的冰箱中至少一小时。孵育后，将试管在 20， 000 g 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟，以去除所得沉淀物。

将 600 μL 上清液转移到新的 1.5 mL微量离心管中，不要干扰沉淀。打开所有样品管，并将它们放入真空离心机中。在室温下干燥样品，直到去除所有溶剂。

如果干燥的样品储存在零下 80 摄氏度，请将未开封的样品管放入真空离心机中并干燥 30 分钟。在无水吡啶中制备 40 毫克/毫升的盐酸甲氧基拉敏 （MOX） 溶液。将 MOX 和吡啶储存在干燥器中。

接下来，使用热风枪干燥 1 毫升玻璃注射器约 5 秒钟。将注射器的针头插入无水吡啶瓶中。取出 1 毫升吡啶，加入含有 40 毫克 MOX 的微量离心管中。

协议的这一部分对水极为敏感。所有试剂在使用前必须储存在干燥器中。此外，用户必须确保样品与大气水蒸气的暴露程度最低。

然后，用氩气冲洗无水吡啶瓶。密封瓶子，然后将其放回干燥器。将试管在 35 摄氏度的热混合器中以 600 rpm 的速度孵育 10 分钟，将 MOX 溶解在吡啶中。

接下来，向干燥的样品中加入 40 微升 40 毫克/毫升的无水吡啶溶液中的 MOX。涡旋样品 10 秒钟，然后短暂离心。然后，在热混合器中孵育样品。

20， 000 g 或最大速度离心样品 5 分钟以去除颗粒物质。将 25 μL 上清液转移到带有 250 μL 去活玻璃微量内插管的自动进样器样品瓶中。加入 40 微升含有 1% TMCS 的 MSTFA。

在自动进样器样品瓶上盖上盖子，然后使用压接工具密封样品瓶。将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时，并以 250 rpm 的速度振荡。最后，在进样前，使用机器人自动进样器将 3 微升先前制备的脂肪酸甲酯标准品 （FAMES） 溶液添加到自动进样器样品瓶中。

与对照幼虫相比，乳酸脱氢酶突变幼虫的气相色谱-质谱法显示乳酸、丙酮酸和 L2-羟基戊二酸的显着变化。使用该方案生成的 GC-MS 谱图显示出许多可见特征和明显的海藻糖峰，海藻糖通常代表幼虫样品中的最大峰。主成分分析或 PCA 清楚地表明，敲除组和野生型组彼此分开，并且两组中都没有异常值。

在尝试此程序时，请务必记住在匀浆之前保持样品冷冻，并在整个过程中保持所有试剂干燥。