一种基于移液枪头的细胞接种至液滴微流控平台的方法

将该方法与基于液滴的微流控技术相结合，有助于回答系统免疫学领域中的关键问题，例如编码单个细胞或病原体之间的细胞异质性及细胞间通讯。我们所开发的这一技术的主要优势在于，这种吸头加载方法能够实现稀有细胞在液滴中的封装，其封装比例与预测的百分比分布高度一致。对该方法的可视化演示对于理解如何使用移液吸头将细胞加载至特定液滴以及如何从液滴中回收细胞至关重要。

进行水相液滴生成的尖端加样时，首先将三毫升表面活性剂加入两毫升氟化油中，并将油相混合物吸入一个2.5毫升的注射器中。去除注射器中的任何气泡，并将注射器连接至一段适当长度的聚四氟乙烯（Teflon）管。另取两个样品注射器，装入适量的生物相容性矿物油，并将注射器连接至另一段适当长度的聚四氟乙烯（Teflon）管。

接下来，从固化的EDMS平板上打取一个直径为五毫米的聚二甲基硅氧烷（PDMS）塞，并在塞子中心打一个直径为一毫米的孔。将该塞子紧密插入200微升移液器吸头的顶端，并将连接至生物相容性矿物油注射器的管路插入塞子中。缓慢按压注射器推杆，用矿物油充满移液器吸头，排出所有残留空气。

将样品注射器和氟化油注射器小心地安装到注射泵上。当所有空气完全排出后，将每个移液枪头插入样品溶液中，并吸取约 100 µL 的细胞样品至枪头内。接着，将含有样品的两个移液枪头插入 PDMS 芯片的两个内侧入口，同时将装有油相混合物的管路插入外侧入口。

根据指示设置注射泵的流速，并输入并设定每支注射器的尺寸。启动泵，使样品溶液流经装置的内通道，油相流经装置的外通道。当液滴形成稳定后，将一段适当长度的管路插入出口，开始收集液滴，并将液滴收集到锁紧管中。

当所有液滴收集完毕后，在液滴上方加入 200 微升不含血清的 RPMI 培养基，并将样本置于锁管盖上有孔的位置，孵育适当的实验时间。进行乳液破乳时，首先将 2 毫升 PFO 加入 8 毫升氟化油中，然后使用注射器从液滴收集管底部移除多余的油相。接着向乳液中加入 100 微升 20% PFO 溶液，以释放包封的细胞进入水相，并轻轻敲击管壁以混匀。

请务必注意，PFO 可能对细胞有害，因此应尽量减少与 PFO 的接触。一到两分钟后，以尽可能低的相对离心力离心 30 秒，立即吸取 550 微升水相层，转移至含有 500 微升冰冷 PBS（添加 2% 胎牛血清，即 FCS）的新密封管中。

让残留的油相沉降至新的锁管底部，小心将含有细胞的水相950微升转移至另一新锁管中。注意确保油相不随水相一同转入新锁管。随后通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于300微升新鲜冷的含2% FCS的PBS中。

采用上述演示的加样方法，可获得与统计学预测值相符的Jurkat T细胞包封率。值得注意的是，即使对于倾向于聚集的贴壁细胞（如肿瘤细胞）或稀有细胞（如浆细胞样树突状细胞），包封效率也得到显著提高。在本代表性包封过程中，使用超低凝胶温度琼脂糖再生液滴，并在生成后凝胶化形成琼脂糖水凝胶微珠，从而允许后续通过显微镜和流式细胞术进行下游分析。

显微分析显示，在不同组合下实现了细胞配对，表明该方法具有高通量的细胞配对能力。通过对同一群水凝胶微珠进行流式细胞术分析，发现可根据前向散射和侧向散射的明显差异，将不含细胞的微珠与含细胞的微珠区分开来。事实上，对不含细胞的微珠群体设门后，未检测到荧光信号，证实了细胞未被包封；而对含细胞的微珠群体设门后，则显示出多个亚群的存在，提示不同标记的Jurkat T细胞已被成功包封。在使用该方法时，需注意细胞浓度是一个限制性因素，必须优化细胞浓度以确保高效的细胞包封与细胞配对。

通过该方法，不仅能够以高效率将一个或两个细胞包裹在液滴中，还可以包裹多个细胞或多种细胞类型，从而更准确地模拟细胞微环境。该技术将为免疫学及相关领域的研究人员提供支持，有助于稀有细胞群体的最佳利用及其在液滴中的高效包裹，以在无干扰的环境中研究细胞行为。