一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

本实验的总体目标是观察高频刺激对神经发生过程中神经元活动的影响。该方法有助于回答有关高频深部脑刺激的细胞与分子机制中的关键问题，例如神经元活动的诱导以及海马体中的神经发生。该技术的优势在于，能够展示高频TBS对成年大脑中神经元活动及神经发生的强大作用。

尽管该方法可为研究高频TBS对小鼠齿状回的影响提供见解，但也可应用于其他系统，例如基底神经节和丘脑下区域，以研究临床脑部疾病。开始此操作时，将麻醉后的小鼠放置于立体定位仪上。将耳杆与小鼠头部对齐，并轻轻收紧以固定居中的头部。

捏住小鼠耳前的皮肤，切除颅骨上方约一平方厘米的皮肤。然后用棉签去除覆盖在颅骨上的肌肉和其他附着组织，暴露颅骨表面。接着，涂抹过氧化氢溶液以干燥颅骨，从而识别矢状缝和人字缝线。

然后，确定前囟和后囟。以前囟点作为原点来设定核团的位置。随后，利用这两个点将颅骨在水平面上调平。

确保这两个点在背腹平面上的高度几乎相同。此外，确保颅骨在内外侧平面上保持水平。接下来，将自制的双通道铜丝微电极安装到立体定向手术架的旋转电极夹持器上。

将电极置于前囟正上方，并设为原点位置。然后，轻柔移动电极至颅骨上方的正确位置，避免接触颅骨。使用立体定位手术仪上的数字显示屏确定前后、内外侧和背腹方向的位置。

确定电极插入的合适位置后，用黑色标记笔标记该位置。随后，使用背腹向立体定位调节装置将电极夹持器抬高。然后，用70%乙醇对钻头进行消毒。

使用手持式显微操作仪辅助的钻头，在标记位置精确钻孔。手术过程中使用无菌棉签止血。持续钻孔直至暴露硬脑膜。

使用弯针清除钻孔过程中产生的任何骨碎片，并在硬脑膜上打一个小孔，注意不要损伤下方的软脑组织。为确认钻孔已准确位于目标位置，可将电极 lowered 以确保其能顺利通过钻孔，且不接触任何障碍物。若未检测到阻力，应缓慢将电极插入至颅骨表面至目标深度的位置。

然后，使用小刮刀涂抹牙科水泥，以固定电极位置。待水泥变稠后，将其塑形，包裹插入的电极及其他骨螺钉，形成一个平整光滑的保护帽。接着，将电极从电极夹持器上取下。

将小鼠从立体定位仪中取出，并放回温暖的笼子中。让小鼠自由活动，在笼中恢复两天。进行刺激时，通过导线将植入的电极连接至可编程刺激器。

设置软件界面。然后，将高频刺激（HFS）参数设定为六组，每组包含六个脉冲串，每个脉冲串包含六个脉冲，频率为 400 赫兹，刺激强度为 200 毫安。按照设定的时间持续给予高频刺激。

对于对照组，将电极植入小鼠体内但不施加任何刺激。对于CFAS染色，对实验组小鼠每天进行两次刺激。对于BrdU标记，分别对急性刺激组和慢性刺激组施加适当的刺激。

在刺激过程中，确保小鼠处于清醒状态。注意确保导线没有扭曲。刺激结束后，小心地将电极针从记录系统的连接器电极夹中拔下。

对于CFAS和Notch1染色，在最后一次HFDBS处理约三小时后，通过注射戊巴比妥使小鼠达到手术麻醉水平。对于BrdU标记，在最后一次HFDBS刺激约12小时后，每隔两小时向对照组和刺激组小鼠注射一次BrdU，共注射六次。末次注射后36小时，用戊巴比妥深度麻醉小鼠，随后经心脏灌注50毫升冷PBS，接着灌注50毫升冷的4%多聚甲醛。

去除头部，并在皮肤上做切口以暴露颅骨。用镊子轻轻敲除部分颅骨，小心取出整个脑组织。随后将脑组织在4%多聚甲醛中后固定两天，再于4°C条件下过夜转移至30%蔗糖溶液中。

使用冷冻切片机将脑组织切成20微米厚的冠状切片。用毛笔将切片转移并贴附到载玻片上，并在-20摄氏度下保存。随后，将载玻片转移至不含固定剂的正常PBS溶液中。

用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，重复三至四次，以去除多余的固定剂。对于 BrdU 标记组，将切片在 37 摄氏度下与 2 摩尔 HCl 孵育 30 分钟，然后用 0.1 摩尔硼酸缓冲液冲洗。10 分钟后，再用 PBS 清洗切片两次，每次 5 分钟。

随后，将切片在封闭液中室温孵育1小时。然后，将切片在封闭液中与抗CFAS多克隆抗体、抗Notch1抗体或抗BrdU抗体于4°C孵育过夜。用PBS洗涤切片三次，每次10分钟，随后在室温下与Alexa Fluor 568标记的抗兔、Alexa Fluor 488标记的抗山羊或Alexa Fluor 488标记的抗大鼠二抗孵育1小时。

用 PBS 每次 10 分钟，共洗涤三次。随后，使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂覆盖免疫标记的脑切片。让切片自然风干，并在 4 °C 避光保存。

此处展示的是在 DG 中生成 BrdU 标记的增殖神经元的 HFS 治疗实验范式。动物被分为急性和慢性两组，接受不同模式的刺激。随后，两组动物均在第六天注射 BrdU。第八天，动物被麻醉并灌注，以制备冷冻切片。

以下是海马齿状回（DG）在高频深部脑刺激（HFDBS）后BrdU免疫荧光染色的图像。对神经元生成的定量分析表明，急性刺激未能增强DG区的神经发生，而慢性刺激则显著上调了神经发生。与对照组相比，慢性刺激组在同侧和对侧半球中BrdU标记细胞的数量均显著增加。

这些是HFDBS后PP亚区的BrdU免疫荧光染色图像。对神经元生成的定量分析表明，PP区的急性或慢性刺激均未能显著增强神经发生。无论是否进行HFS处理，BrdU标记细胞的数量均相对稳定。

在尝试此操作过程中，重要的是要牢记准确定位电极，并成功实施刺激。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员开展模型中的高频刺激研究奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对脑深部核团进行高频刺激。