Name: 高频刺激激活小鼠齿状回的侵袭方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学习高频刺激技术在小鼠海马齿状回中激活神经元并促进神经发生的方法。该方案结合c-fos、Notch1免疫荧光染色与BrdU标记，为研究深部脑刺激机制及神经可塑性提供重要实验框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究受到国家自然科学基金（项目编号：31522029、31770929 和 31371149，负责人：Haitao Wu）、国家重点基础研究发展计划（“973”计划，项目编号：2014CB542203，负责人：Haitao Wu）以及北京市科学技术委员会项目（项目编号：Z161100000216154，负责人：Haitao Wu）的资助。作者感谢武海涛实验室全体成员给予的鼓励与讨论。作者特别感谢刘振威在装置调试过程中提供的帮助。

动物实验程序遵循中国北京基础医学研究所（中国北京）的机构指南以及中国政府关于实验动物护理和使用的法规。小鼠（成年雄性，26 ~ 30 g）饲养于恒温23 °C环境中，并自由获取水和食物 随意摄取在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养（光照开启时间为上午7:00）。所有实验操作均在光照周期内进行。
1. 手术准备
注意：自定义电极采用 Halpern 报告中所述方法稍作修改后自行制备23。
<ol>
	<li>使用2根铜微丝（外径为200 µm）作为平行双极电极。将电极相互缠绕，形成用于刺激的圆柱形电极。 
	注意：此处电极在PP或DG内的长度根据核团的解剖深度进行调整。</li>
	<li>使用环氧乙烷消毒柜对电极进行灭菌。操作和储存自制的双通道微丝电极时应避免任何污染。在任何外科植入手术前，电极必须严格灭菌。</li>
	<li>对手术器械进行高压灭菌。</li>
	<li>手术前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（20 - 50 mg/kg），使小鼠达到外科麻醉水平。</li>
	<li>向小鼠注射无菌普鲁卡因青霉素G混悬液（75,000 U，肌内注射）和镇痛剂（卡洛芬，0.05 - 1&#160;mg/kg，皮下注射），分别以降低感染和疼痛的风险24。</li>
	<li>动物麻醉后，在双眼涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。通过夹捏脚趾时动物的反射情况判断镇静和麻醉深度，仅在无反应时开始手术。 
	注意：兽用眼膏是防止眼睛干燥的另一种选择。</li>
	<li>使用电动剃毛器或剃须刀片剃除小鼠头部顶部大部分毛发，用70%酒精和碘伏溶液交替擦拭三次对剃毛区域进行消毒，并在碘伏干燥后开始手术。</li>
</ol>
2. 高频刺激手术25,26
注意：在此步骤中，将电极单侧植入背侧齿状回（DG）或内侧内嗅皮层（PP）区域，这些区域是海马体的一部分，在情景学习和记忆中具有关键作用。
<ol>
	<li>将麻醉后的小鼠置于立体定位仪上。为固定小鼠头部，应正确对齐耳杆并迅速安装。轻柔拧紧耳杆，使其支撑居中头部并轻微固定小鼠。</li>
	<li>使用恒温垫将动物体温维持在 37 ± 0.5 °C。</li>
	<li>用镊子夹住小鼠耳前的皮肤，用灭菌剪刀剪开，去除约1厘米的皮肤2 小鼠颅骨顶部的皮肤区域。 
	注意：可在切开的皮肤边缘观察到少量出血。</li>
	<li>用棉签去除颅骨表面的肌肉和其他附着物，暴露颅骨表面。使用棉签和解剖凿彻底清除颅骨表面的所有骨膜、肌腱和结缔组织，以清晰辨认矢状缝和人字缝。</li>
	<li>确定前囟点（bregma）和后囟点（lambda）。前囟点位于颅顶上方中线处冠状缝与矢状缝的交点。后囟点位于人字缝与矢状缝的交汇处。以前囟点作为原点，用于确定其他核团的位置。</li>
	<li>在确定颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）位置后，将这两点调整至水平位置。确保这两点在背腹方向上的高度基本一致（任何误差应 &#60; 0.05 mm）。同时，以相同方式确保颅骨在内侧-外侧方向上保持水平26.</li>
	<li>对于单侧手术，将自制的双通道铜丝微电极安装到立体定向手术架的旋转电极夹持器上。</li>
	<li>首先将电极垂直置于前囟点上方，并设为原点位置。使用数显立体定位仪确定前后（AP）、内外（ML）和背腹（DV）坐标。 
	注意：为防止电极弯曲，操作过程中切勿使电极尖端接触颅骨。</li>
	<li>将电极轻柔地移动至正确位置（图1A，DG 区为 AP-2.1/ML ± 1.0，PP 区为 AP-3.8/ML ± 3.027 颅骨上方无任何接触。确定电极插入位点后，使用背腹向立体定位调节装置抬高电极 holder，并用黑色记号笔标记该位置。 
	注意：相对于立体定位坐标的精确位置可能因小鼠品系、体重和性别而异。应使用同性别成年小鼠以尽量减少位置差异。如有可能，应通过术前解剖学扫描在个体受试者基础上确定目标位置27.</li>
	<li>使用手持式显微操作仪辅助的钻头（钻孔直径 = 0.5 mm）在标记位置精确钻孔。钻孔前用70%乙醇对钻头尖端进行消毒。沿Z轴方向将微型钻头向上移动0.8–1.0 mm穿过颅骨，X-Y位置保持不变。手术过程中使用无菌棉球止血。 
	注意：为避免钻孔过程中过度钻削和产生过多热量，应确保钻速为15,000 - 18,000转/分钟（RPM），并每隔8 - 10秒频繁将钻头从骨窗中退出。</li>
	<li>继续钻孔直至暴露硬脑膜。使用弯针清除钻孔过程中产生的骨屑，并在硬脑膜上刺出一个小孔，注意不要损伤下方的软脑组织。 
	注意：为避免损伤脑组织，弯曲的钝头针也可替换为精细的钝头镊子。</li>
	<li>为确认钻孔是否已准确位于目标位置，需通过调整立体定位手术架降低电极高度，确保电极可顺利穿过颅骨钻孔，且不接触任何障碍物。若条件满足，则将电极缓慢插入至目标深度，从内侧副乳头体（PP）至齿状回（DG）（PP-DG）区域，齿状回（DG）插入深度为1.8 mm，副乳头体（PP）插入深度为3.0 mm。 
	注意：在电极植入过程中，使用无菌棉拭子擦去钻孔处溢出的脑脊液或血液。</li>
	<li>将微丝电极插入颅骨孔后，使用小刮刀取适量牙科水泥固定电极。待水泥逐渐变稠时，将其塑形，包裹电极及颅骨螺钉，形成光滑平整的保护帽。清创并消毒伤口边缘。</li>
	<li>将电极从电极夹持器上取下。将小鼠从立体定位仪上移除，并放回温暖的饲养笼中。 
	注意：手术后，需等待动物从麻醉中充分恢复意识后，方可将其放回笼中。</li>
	<li>让小鼠自由活动，并在笼中恢复2天。然后，将植入小鼠脑内的电极连接至可编程刺激器。 通过 导联。按照所示设置软件界面 图2设置HFS参数为6组，每组6串，每串6个脉冲，频率为400 Hz（图1B，组间间隔100毫秒，系列间间隔20秒28将刺激强度设置为 200 μA。</li>
	<li>按照设定的时间持续给予HFS刺激。每天给予2次刺激，分别在上午8:00和晚上8:00进行。</li>
	<li>对照组小鼠植入电极但不进行刺激。</li>
	<li>对于 c-fos 染色，对实验小鼠进行急性刺激（每天2次）。对于BrdU标记，将实验小鼠分为急性刺激组（每天施加2次）和慢性刺激组（5天内施加10次，每天2次）。在刺激过程中，确保小鼠处于清醒状态。注意确保导线未发生扭转。 
	注意：在实验程序的最后一天，急性刺激组的小鼠被同时进行刺激。</li>
	<li>刺激结束后，小心地将电极针从电极夹持器和记录系统的连接器上断开。</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色与溴脱氧尿苷标记29
<ol>
	<li>对于 c-fos 在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）后约3小时，通过腹腔注射戊巴比妥（20–50 mg/kg，I.P.）麻醉小鼠，使其达到外科手术麻醉水平，随后进行Notch1染色。</li>
	<li>BrdU标记：在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）后约12小时，以2小时为间隔，向对照组和刺激组小鼠分别给予6次BrdU注射（50 mg/kg，溶于0.9%生理盐水，腹腔注射）。末次注射后36小时，通过腹腔注射戊巴比妥（20 - 50 mg/kg）麻醉小鼠，使其达到手术麻醉水平。</li>
	<li>使用手术刀在肋骨处切开，暴露心脏，随后将一根22号钝头灌注针插入左心室。在右心房处做一小切口。经心脏灌注50 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注50 mL冰冷的含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液（pH 7.4）。 
	注意：当小鼠血液被PFA替换时，将PBS切换为PFA 体内 被替换，直至流出液体变澄清。良好的灌注可通过肝脏变清来判断。一旦观察到固定震颤，即应停止灌注。30.</li>
	<li>用眼科剪将小鼠断头，于皮肤上做切口并暴露颅骨。用镊子轻微敲除部分颅骨，小心剥离出完整的小鼠脑组织。将脑组织在4%多聚甲醛中后固定2天，随后转移至4 °C的30%蔗糖溶液中过夜。</li>
	<li>使用冷冻切片机将脑组织切成20 µm厚的冠状切片。用毛笔转移切片并贴附于载玻片上，于-20 °C保存。 
	注意：电极位置错误或机械损伤过重的动物将被排除在后续分析之外。</li>
	<li>将切片转移至不含固定剂的常规 PBS（0.1 M，pH 7.4）中。用 PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，重复 3–4 次，以去除残留的固定剂。对于 BrdU 标记组，将切片在 2 N HCl 中 37 °C 孵育 30 分钟，然后在 0.1 M 硼酸盐缓冲液（pH 8.4，10 分钟）中漂洗。随后用 PBS 洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。 
	注意：随后进行免疫染色。</li>
	<li>用封闭液（1% 正常山羊血清，3% 牛血清白蛋白）孵育切片 &#60;BSA&#62; ，0.5% Triton X-100 和 0.02% 叠氮化钠的 1×PBS 溶液中，室温（RT）孵育 1 小时。</li>
	<li>将切片与抗-c-fos 多克隆抗体（1:500；兔源）、抗 Notch1 抗体（1:50；山羊源）或抗 BrdU 抗体（1:800；大鼠源），加入封闭液中，4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>用 PBS 清洗切片 3 次，然后在室温下用 Alexa Fluor 568 标记的山羊抗兔 IgG（1:500）、Alexa Fluor 488 标记的驴抗山羊 IgG（1:1,000）或 Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠 IgG（1:500）二抗孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤样本 3 次（每次 10 分钟）。使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂覆盖免疫标记的脑切片。将切片自然晾干，避光保存于 4 °C。</li>
	<li>使用高分辨率多通道（连续）扫描共聚焦显微镜，获取脑组织中受刺激侧与未受刺激侧海马区域的图像。对照组与实验组的成像参数应保持一致。</li>
	<li>使用高倍物镜（20倍空气物镜，数值孔径0.45）进行马赛克成像，通过电动载物台获取相邻视野的连续三维（XYZ）图像，并利用适当的软件将这些图像拼接，生成大范围的复合图像。 
	注：拼接功能包含真实的拼接与平滑选项，可优化无缝图像效果。使用拼接功能可快速、简便地制备复合图像，以覆盖大范围区域。</li>
	<li>对于 c-fos 并进行 Notch1 染色，对免疫荧光密度进行阳性核的定量分析21 拼接图像的。在海马齿状回的头侧、背侧和腹侧亚区中随机选择3个区域，以双盲方式测量免疫荧光密度，使用 Image J 软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）31.</li>
	<li>对于BrdU标记，以双盲方式分析穿过背侧海马（相对于前囟-1.7 mm至-2.7 mm）钻孔点周围的脑切片。</li>
	<li>仅计数齿状回（DG）中 BrdU 阳性的神经元。计数时应包括位于颗粒细胞层内 2 个细胞直径范围内的细胞。 
	注意：此处使用40倍空气镜进行计数。每只动物随机选取3–5个脑片进行计数，取平均值并表示为每齿状回（DG）的平均数19.</li>
</ol>

<ol><li>Perlmutter, J. S., Mink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation.</a> Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).</li>
<li>Lozano, A. M., Lipsman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+and+regulating+dysfunctional+circuits+using+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation.</a> Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).</li>
<li>Kohl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+for+treatment-refractory+obsessive+compulsive+disorder%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review.</a> BMC Psychiatry. 14, 214(2014).</li>
<li>Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+effects+of+deep+brain+stimulation+for+treatment-resistant+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression.</a> Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).</li>
<li>Fisher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+the+anterior+nucleus+of+thalamus+for+treatment+of+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).</li>
<li>Greenberg, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+ventral+internal+capsule%2Fventral+striatum+for+obsessive-compulsive+disorder%3A+worldwide+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience.</a> Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).</li>
<li>Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23817213">Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders.</a> Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).</li>
<li>Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15808356">High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less.</a> Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).</li>
<li>Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+accumbens+shell+attenuates+cue-induced+reinstatement+of+both+cocaine+and+sucrose+seeking+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats.</a> Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).</li>
<li>Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reinstatement+model+of+drug+relapse%3A+recent+neurobiological+findings%2C+emerging+research+topics%2C+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research.</a> Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).</li>
<li>Grubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropsychological+safety+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+for+major+depression%3A+effects+of+12-month+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+World+Journal+of+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).</li>
<li>Lyons, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation%3A+current+and+future+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation: current and future clinical applications.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).</li>
<li>McIntyre, C. C., Hahn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+perspectives+on+the+mechanisms+of+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation.</a> Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).</li>
<li>Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sing+the+mind+electric+-+principles+of+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation.</a> European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).</li>
<li>Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+adult+rodent+hippocampal+neurogenesis+by+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation.</a> Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).</li>
<li>Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+changes+in+the+rat+hippocampus+after+deep+brain+stimulation+of+the+anterior+thalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52457(2015).</li>
<li>Hattiangady, B., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+decreased+hippocampal+neurogenesis+in+chronic+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).</li>
<li>Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+temporal+lobe+epilepsy+is+associated+with+severely+declined+dentate+neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).</li>
<li>Madsen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurogenesis+in+a+model+of+electroconvulsive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy.</a> Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).</li>
<li>Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapidly+acquired+and+persistent+spatial+memory+task+that+induces+immediate+early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+and+Brain+Functions%22%5BJournal%5D)">A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression.</a> Behavioral and Brain Functions. 6, 35(2010).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+deficiency+in+postnatal+neural+progenitor+cells+in+the+dentate+gyrus+leads+to+emotional+and+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment.</a> The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).</li>
<li>Alberi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Notch+signaling+in+neurons+requires+Arc%2FArg3.1+and+is+essential+for+synaptic+plasticity+in+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks.</a> Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).</li>
<li>Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-wise+approach+to+deep+brain+stimulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">A step-wise approach to deep brain stimulation in mice.</a> Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).</li>
<li>Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+method+for+evaluating+deep+brain+stimulation+effects+on+intravenous+methamphetamine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53266(2016).</li>
<li>Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+guided+implantation+of+electrodes+into+the+subthalamic+nucleus+of+rats+for+long-term+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53066(2015).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Mouse-Brain-Stereotaxic-Coordinates-Third/dp/0123694604">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6(2007).</li>
<li>McHugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentate+gyrus+NMDA+receptors+mediate+rapid+pattern+separation+in+the+hippocampal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network.</a> Science. 317 (5834), 94-99 (2007).</li>
<li>Gonzalez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+prefrontal+cortex+is+a+crucial+node+of+a+rapid+learning+system+that+retrieves+recent+and+remote+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuromuscular+junction%3A+measuring+synapse+size%2C+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52220(2014).</li>
<li>Pizzolato, G., Mandat, T. <a target="_blank" href="https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnint.2012.00002/full">Deep brain stimulation for movement disorders.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2(2012).</li>
<li>Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+recent+trends+and+further+promising+directions+in+functional+neurosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplement%22%5BJournal%5D)">Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).</li>
<li>Laxton, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+deep+brain+stimulation+of+memory+circuits+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease.</a> Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).</li>
<li>Min, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+induces+BOLD+activation+in+motor+and+non-motor+networks%3A+an+fMRI+comparison+study+of+STN+and+EN%2FGPi+DBS+in+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals.</a> NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).</li>
<li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukurba%2C+KR+%22RNA+sequencing+and+analysis%22">RNA sequencing and analysis</a>. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).</li>
<li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons%3A+activity-dependent+promoters+have+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 37(2014).</li>
<li>Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+after+transient+global+ischemia+in+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils.</a> Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).</li>
<li>Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

自20世纪90年代以来，高频深部脑刺激（HF-DBS）技术已被广泛用作治疗多种神经系统疾病的有效工具。迄今为止，HF-DBS的标志性应用在于治疗帕金森病和原发性震颤，这一进展在临床和科研领域均引起了广泛关注与兴趣。目前，多个研究团队正在开展多种类型的HF-DBS研究，探索其在特定神经及精神疾病治疗中的应用。32,33一些研究目前正处于不同阶段的临床试验中2,34尽管高频深部脑刺激（HF-DBS）应能带来显著益处，但即使在脑内定位完全准确的情况下，仍可能出现刺激相关的副作用，例如情绪和思维的负面改变。 等等。，这些反应是可逆的，通过调整刺激参数可以避免。
除了过去几十年临床试验积累的HF-DBS技术取得的重大进展外，在活体动物中开展HF-DBS研究也为理解电刺激所引发的生理变化和神经生物学机制提供了机会。在本论文中，我们描述了一种改良...

高频深部脑刺激（HF-DBS）是一种用于脑内电刺激的神经外科技术，自19世纪70年代以来不断发展1。20世纪80年代末，高频刺激（HFS）首次被用作帕金森病及其他运动障碍类疾病的潜在治疗干预手段2。在过去的几十年中，HF-DBS被越来越广泛地应用于目前传统治疗策略无法治愈的脑部疾病。特别是由于HFS电极精准度的提高、疗效显著以及副作用极小，过去几十年中接受HF-DBS治疗的脑部疾病种类显著增加3,4,5。例如，HF-DBS已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗帕金森病（PD）、阿尔茨海默型痴呆、原发性震颤及其他类型的运动障碍2,6,7。在帕金森病患者中，接受HF-DBS治疗期间多巴胺能药物的使用量可减少达50%8。除了在运动障碍治疗中取得成功外，HF-DBS在临床中也显示出对精神疾病治疗以及认知增强的强大作用2,9,10,11。值得注意的是，HFS用于治疗其他精神障碍的研究目前正处于不同阶段，为患者带来了巨大希望12。
尽管许多研究已表明，局灶性高频刺激（HFS）在整个大脑中均具有局部和远端效应13，其神经生物学和分子机制仍不明确2,14在临床中，治疗性高频深部脑刺激（HF-DBS）通常长期用于帕金森病和慢性疼痛的治疗。 等等。 关于高频深部脑刺激（HF-DBS）治疗产生疗效的机制，存在多种观点。其中一种可能是，高频刺激（HFS）电流通过反复去极化植入电极周围区域的轴突，从而调节神经元网络活动。此外，HF-DBS 可能改变输出神经元及其投射靶区的放电频率。同时，HF-DBS 还可能引发长期的突触可塑性改变，包括长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD），这些变化可能有助于症状的改善。然而，目前尚不清楚 HFS 是否影响调控成体神经发生等细胞过程的关键分子事件。 体内多项研究表明，啮齿类动物中的高频刺激（HFS）能够模拟临床应用的深部脑刺激（DBS）所产生的类似神经反应。15,16为了理解高频深部脑刺激（HF-DBS）的潜在细胞机制，本研究首先建立了一个 体内 在小鼠中以急性（一天）或慢性（五天）方式进行HFS方法学研究。其次，我们建立了激活分析方法学，以确定HF-DBS干预后神经元活动及神经发生的改变。
由于神经干细胞在胚胎发育期间产生神经元的能力较强，且这一过程在成年期持续进行，海马体齿状回的亚颗粒层是成年神经发生的主要区域之一。神经发生过程受到多种生理和病理因素的影响。在某些癫痫病例中，海马体神经发生显著减少17,18。此外，单次电休克治疗可显著增加齿状回的神经元生成19。这些观察结果表明，电生理活动在调控成年神经发生及海马神经元突触可塑性中起着关键作用。因此，为了进一步阐明高频深部脑刺激（HF-DBS）对神经元活动和神经发生的影响，我们首先开展即刻早期基因（IEG）c-fos的免疫染色实验，该基因是反映经验诱导的短期神经元活动的公认标志物20。同时检测Notch1信号通路，以监测高频刺激（HFS）施加后的信号激活情况21,22。此外，我们还通过多种方式在HF-DBS诱导后进行BrdU标记分析，以检测神经元的生成情况，尽管BrdU染色也可作为胶质发生的一个标志。
在本研究中，采用两种高频刺激（HFS）方法，分别直接和间接靶向激活海马齿状回（DG）。电极可直接植入DG，或植入内侧穿通通路（medial perforant path, PP），后者通过投射激活DG神经元。对于高频深部脑刺激（HF-DBS）的诱导，采用可编程刺激器进行持续刺激。 通过 将固定电极置于小鼠头部。为了确定高频刺激（HFS）对神经元激活和神经发生的影响，我们检测了以下指标的表达水平： c-fos 并通过免疫荧光染色检测海马DG区Notch1的表达以及BrdU掺入阳性神经元的数量，以评估HFS处理后的神经发生情况。特别地，分别比较了高频深部脑刺激（HF-DBS）在急性与慢性刺激模式下，以及直接与间接刺激模式下对DG区神经发生的影响。

<table><tbody><tr><td>脑立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>用于小鼠颅内立体定位植入</td></tr><tr><td>刺激器</td><td>A-M systems</td><td>Model 3800</td><td>MultiStim 8通道可编程刺激器</td></tr><tr><td>牙科钻机</td><td>Saeshin Precision Co., Ltd</td><td>STRONG 90</td><td>用于钻孔和开颅手术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>环钻</td><td>Meisinger</td><td>HM1 005#</td><td>用于钻孔和开颅手术&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1550 数字转换器</td><td>Molecular Devices</td><td>AXON 1550</td><td>高分辨率数据采集</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Cryotome FSE</td><td>用于切割样本的冷冻切片</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV-1200</td><td>日本制造，配备20倍物镜（NA 0.45）</td></tr><tr><td>小鼠手术器械</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08,11254-20,16109-14</td><td>剪刀、镊子、骨剪、持针器等</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>R&amp;D systems</td><td>4579</td><td>腹腔注射剂量为20–50 mg/kg</td></tr><tr><td>青霉素G&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>肌内注射剂量为75,000 U</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1713</td><td>皮下注射剂量为5–10 mg/kg</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>北京索莱宝科技有限公司&amp;nbsp;</td><td>P1110</td><td>组织固定的储存液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>pH 7.4，每瓶500 ml储存</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>由水溶性乙二醇和树脂组成的配方</td></tr><tr><td>抗BrdU抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>稀释比例：1/800</td></tr><tr><td>抗c-fos抗体</td><td>Abcam</td><td>ab209794</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（Alexa Fluor 568）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>驴抗大鼠IgG（Alexa Fluor 488）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-546-150</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>含DAPI的抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>用于DAPI复染</td></tr><tr><td>抗Notch1抗体（C-20）</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-6014</td><td>稀释比例：1/50</td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（Alexa Fluor 488）</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td>稀释比例：1/1000</td></tr></tbody></table>

一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

利用植入电极针对不同脑区进行的高频电刺激（HFS）已被证实是治疗多种神经性和精神类疾病的有效方法。针对脑深部区域的高频刺激，即脑深部电刺激（DBS），在临床试验中正变得越来越重要。近年来，高频脑深部电刺激（HF-DBS）手术领域的进展开始将这种侵入性技术的应用拓展至其他领域，例如重度抑郁症（MDD）、强迫症（OCD）等疾病的治疗。
尽管适应症不断扩展，高频深部脑刺激（HF-DBS）产生有益效应的潜在机制仍不明确。为解决这一问题，一种方法是使用植入式电极，通过高频刺激（HFS）稀疏激活分布于不同区域的神经元亚群。已有报道表明，丘脑前核的高频刺激在临床上可用于治疗难治性癫痫。其潜在机制可能与神经发生增加和神经元活动改变有关。因此，我们感兴趣的是，在小鼠齿状回（DG）中，通过检测高频刺激（HFS）治疗前后神经元活动及神经发生的变化，来探索其生理学改变。
在本文中，我们描述了在小鼠中以急性或慢性方式直接或间接靶向激活齿状回（DG）的高频刺激（HFS）方法。此外，我们还详细阐述了用于制备脑切片的实验方案，以进行c-fos和Notch1免疫荧光染色来监测神经元活动及信号通路的激活，并通过溴脱氧尿苷（BrdU）标记来确定高频深部脑刺激（HF-DBS）诱导后的神经发生情况。HF-DBS处理后神经元活动的激活和神经发生的增加提供了直接的神经生物学证据，并具有潜在的治疗益处。特别是，该方法可经修改后应用于靶向其他感兴趣的脑区，如基底神经节和丘脑下核区域，以针对临床特定的脑部疾病开展研究。

直接对海马齿状回（DG）亚区进行高频深部脑刺激（HF-DBS），或刺激穿通路（PP）亚区以间接激活DG 通过 使用立体定位调整插入电极后，将啮齿类动物用戊巴比妥麻醉，并在最后一次高频深部脑刺激（HF-DBS）刺激后3小时采样。 c-fos 以及 Notch1 免疫染色。对于 BrdU 染色，在 HF-DBS 刺激 1 天或 5 天后，末次注射 BrdU 36 小时，用戊巴比妥麻醉啮齿动物以制备脑切片。 图3 表明表达的 c-fos 在DG同侧显著增加。此外， c-fos 海马齿状回对侧的表达也较无高频深部脑刺激（HF-DBS）刺激的对照组显著上调，后者几乎不表达a c-fos 信号。根据脑切片中Notch1特异性免疫荧光染色结果，如图所示 补充图1我们进一步证明，通过PP神经元去极化诱导，HFS刺激后成年海马齿状回（DG）中的Notch1信号通路亦可被激活（亦参见作为补充材料提供的原始数据）...

本方案展示了如何在小鼠中建立可靠的高频刺激（HFS）方法。通过HFS直接和间接地对海马齿状回中的神经元进行电刺激。 体内神经元活动和分子信号传导通过以下方式检测 c-fos 以及Notch1免疫荧光染色；神经发生通过溴脱氧尿苷标记实验进行定量。

高频电刺激（HFS）是一种通过植入电极作用于大脑不同区域的有效治疗方法，已证实可用于……

本实验的总体目标是观察高频刺激对神经发生过程中神经元活动的影响。该方法有助于回答有关高频深部脑刺激的细胞与分子机制中的关键问题，例如神经元活动的诱导以及海马体中的神经发生。该技术的优势在于，能够展示高频TBS对成年大脑中神经元活动及神经发生的强大作用。尽管该方法可为研究高频TBS对小鼠齿状回的影响提供见解，但也可应用于其他系统，例如基底神经节和丘脑下区域，以研究临床脑部疾病。开始此操作时，将麻醉后的小鼠放置于立体定位仪上。将耳杆与小鼠头部对齐，并轻轻收紧以固定居中的头部。捏住小鼠耳前的皮肤，切除颅骨上方约一平方厘米的皮肤。然后用棉签去除覆盖在颅骨上的肌肉和其他附着组织，暴露颅骨表面。接着，涂抹过氧化氢溶液以干燥颅骨，从而识别矢状缝和人字缝线。然后，确定前囟和后囟。以前囟点作为原点来设定核团的位置。随后，利用这两个点将颅骨在水平面上调平。确保这两个点在背腹平面上的高度几乎相同。此外，确保颅骨在内外侧平面上保持水平。接下来，将自制的双通道铜丝微电极安装到立体定向手术架的旋转电极夹持器上。将电极置于前囟正上方，并设为原点位置。然后，轻柔移动电极至颅骨上方的正确位置，避免接触颅骨。使用立体定位手术仪上的数字显示屏确定前后、内外侧和背腹方向的位置。确定电极插入的合适位置后，用黑色标记笔标记该位置。随后，使用背腹向立体定位调节装置将电极夹持器抬高。然后，用70%乙醇对钻头进行消毒。使用手持式显微操作仪辅助的钻头，在标记位置精确钻孔。手术过程中使用无菌棉签止血。持续钻孔直至暴露硬脑膜。使用弯针清除钻孔过程中产生的任何骨碎片，并在硬脑膜上打一个小孔，注意不要损伤下方的软脑组织。为确认钻孔已准确位于目标位置，可将电极 lowered 以确保其能顺利通过钻孔，且不接触任何障碍物。若未检测到阻力，应缓慢将电极插入至颅骨表面至目标深度的位置。然后，使用小刮刀涂抹牙科水泥，以固定电极位置。待水泥变稠后，将其塑形，包裹插入的电极及其他骨螺钉，形成一个平整光滑的保护帽。接着，将电极从电极夹持器上取下。将小鼠从立体定位仪中取出，并放回温暖的笼子中。让小鼠自由活动，在笼中恢复两天。进行刺激时，通过导线将植入的电极连接至可编程刺激器。设置软件界面。然后，将高频刺激（HFS）参数设定为六组，每组包含六个脉冲串，每个脉冲串包含六个脉冲，频率为 400 赫兹，刺激强度为 200 毫安。按照设定的时间持续给予高频刺激。对于对照组，将电极植入小鼠体内但不施加任何刺激。对于CFAS染色，对实验组小鼠每天进行两次刺激。对于BrdU标记，分别对急性刺激组和慢性刺激组施加适当的刺激。在刺激过程中，确保小鼠处于清醒状态。注意确保导线没有扭曲。刺激结束后，小心地将电极针从记录系统的连接器电极夹中拔下。对于CFAS和Notch1染色，在最后一次HFDBS处理约三小时后，通过注射戊巴比妥使小鼠达到手术麻醉水平。对于BrdU标记，在最后一次HFDBS刺激约12小时后，每隔两小时向对照组和刺激组小鼠注射一次BrdU，共注射六次。末次注射后36小时，用戊巴比妥深度麻醉小鼠，随后经心脏灌注50毫升冷PBS，接着灌注50毫升冷的4%多聚甲醛。去除头部，并在皮肤上做切口以暴露颅骨。用镊子轻轻敲除部分颅骨，小心取出整个脑组织。随后将脑组织在4%多聚甲醛中后固定两天，再于4°C条件下过夜转移至30%蔗糖溶液中。使用冷冻切片机将脑组织切成20微米厚的冠状切片。用毛笔将切片转移并贴附到载玻片上，并在-20摄氏度下保存。随后，将载玻片转移至不含固定剂的正常PBS溶液中。用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，重复三至四次，以去除多余的固定剂。对于 BrdU 标记组，将切片在 37 摄氏度下与 2 摩尔 HCl 孵育 30 分钟，然后用 0.1 摩尔硼酸缓冲液冲洗。10 分钟后，再用 PBS 清洗切片两次，每次 5 分钟。随后，将切片在封闭液中室温孵育1小时。然后，将切片在封闭液中与抗CFAS多克隆抗体、抗Notch1抗体或抗BrdU抗体于4°C孵育过夜。用PBS洗涤切片三次，每次10分钟，随后在室温下与Alexa Fluor 568标记的抗兔、Alexa Fluor 488标记的抗山羊或Alexa Fluor 488标记的抗大鼠二抗孵育1小时。用 PBS 每次 10 分钟，共洗涤三次。随后，使用含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂覆盖免疫标记的脑切片。让切片自然风干，并在 4 °C 避光保存。此处展示的是在 DG 中生成 BrdU 标记的增殖神经元的 HFS 治疗实验范式。动物被分为急性和慢性两组，接受不同模式的刺激。随后，两组动物均在第六天注射 BrdU。第八天，动物被麻醉并灌注，以制备冷冻切片。以下是海马齿状回（DG）在高频深部脑刺激（HFDBS）后BrdU免疫荧光染色的图像。对神经元生成的定量分析表明，急性刺激未能增强DG区的神经发生，而慢性刺激则显著上调了神经发生。与对照组相比，慢性刺激组在同侧和对侧半球中BrdU标记细胞的数量均显著增加。这些是HFDBS后PP亚区的BrdU免疫荧光染色图像。对神经元生成的定量分析表明，PP区的急性或慢性刺激均未能显著增强神经发生。无论是否进行HFS处理，BrdU标记细胞的数量均相对稳定。在尝试此操作过程中，重要的是要牢记准确定位电极，并成功实施刺激。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员开展模型中的高频刺激研究奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对脑深部核团进行高频刺激。

an-invasive-method-for-activation-mouse-dentate-gyrus-high-frequency

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

高频刺激激活小鼠齿状回的侵袭方法

来源：Selvakumar, T., et al., 丘脑前核深部脑刺激后大鼠海马基因表达变化的分析。 J. Vis. Exp.

深部脑刺激对大鼠模型海马神经元活动的影响

来源：Zhao, Z. 等．通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法．J. Vis.

高频刺激增强小鼠齿状回神经元激活与神经发生

本视频展示了一种在遗传工程小鼠模型中通过光敏离子通道调控其GABA能内侧隔核神经元θ振荡的实验方案。通过向海马体传递光脉冲，该方案旨在同步神经元活动并产生θ振荡，并以局部场电位的形式进行记录。...

选择性调控小鼠模型中的θ振荡

本视频展示了对小鼠大脑中处理听觉刺激的特定区域的神经元活动的研究。该技术包括施加一种抑制性神经传递阻断剂，并在药物作用于局部脑区前后，比较神经元对听觉刺激的反应。...

在清醒小鼠中研究抑制性神经递质阻断剂存在下的听觉神经元反应

本视频展示了在小鼠模型的海马体中进行立体定位植入金属丝电极阵列和光学纤维的操作过程。...

将电极阵列和光纤植入小鼠海马体

转基因和基因敲除神经疾病小鼠模型有助于研究基因在正常与异常神经生理功能中的作用。本文描述了可用于研究转基因和基因敲除自由活动小鼠中长时程增强作用的方法，长时程增强是一种可能构成学习与记忆基础的细胞机制。 神经病理学行为学小鼠模型...

自由活动小鼠中穿通通路-齿状回突触的长时程增强

研究表明，阴极经颅直流电刺激可对耐药性癫痫发作产生抑制作用。本研究设计了一种体外实验装置，用于评估小鼠脑片制备中癫痫样活动的直流电刺激与多电极阵列记录，并对直流电刺激参数进行了评价。...

直流电刺激与多电极阵列记录小鼠脑片中类癫痫样活动

本方案描述了使用多叉线性硅探针记录局部场电位的方法。通过电流源密度分析对信号进行转换，可重建小鼠海马中的局部电活动。利用该技术，可在自由活动的小鼠中研究空间受限的脑节律振荡。...

记录行为小鼠海马中空间限制性振荡

本文介绍了两种利用化学遗传学在小鼠中长期无创调控神经元活性的方法。通过滴眼液每日递送氯氮平-N-氧化物（CNO）。我们还描述了两种在饮水中长期给予CNO的方法。这些实现慢性神经元调控的策略所需干预极少，可显著降低动物的应激反应。...

非侵入性策略用于长期调控DREADD控制的神经元活动

本报告描述了基于转基因VGAT-Cre小鼠电点燃建立颞叶癫痫模型的方法。点燃后的VGAT-Cre小鼠可能有助于确定癫痫的病因，并可用于新型疗法的筛选。...

制备并植入电极以电点燃VGAT-Cre小鼠，建立颞叶癫痫模型

提出一种低成本脑电图记录系统，并结合毫米级线圈，用于在活体小鼠大脑中进行经颅磁刺激。in...

低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

学习高频刺激技术在小鼠海马齿状回中激活神经元并促进神经发生的方法。该方案结合c-fos、Notch1免疫荧光染色与BrdU标记，为研究深部脑刺激机制及神经可塑性提供重要实验框架。

一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

探索更多视频