Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

这种方法可以帮助回答细菌细胞生物学领域的关键问题，例如细胞如何复制它们的 DNA，它们如何生长，以及它们如何分裂。该技术的主要优点是可以在显微镜下监测活细菌细胞至少 24 小时，并且该技术不需要特殊设备。虽然这种方法可以深入了解粘球菌黄球菌的生长和分裂，但它也可以很容易地应用于其他生长缓慢的细菌。

首先，将单个黄原体菌落重悬于 500 微升 1% CTT 中，补充有抗生素，在无菌管中，然后将整个悬浮液转移到含有 5 毫升 1% CTT 的 50 毫升锥形瓶中。通过将 1 克琼脂糖与 80 毫升 TPM 缓冲液和 20 毫升 1%CTT 培养基混合，制备含有 0.2% CTT 的 1% 琼脂糖显微镜溶液。将溶液微波加热，直到琼脂糖熔化。

在培养皿中加入大约 60 毫升熔融琼脂糖，并冷却至室温。使用前，将琼脂糖垫在 32 摄氏度下预热至少 15 分钟。接下来，将无菌玻璃盖玻片放在中间有孔的塑料或金属框架上，然后用胶带将盖玻片固定在框架上。

在盖玻片上加入 10 至 20 微升指数生长的 M.xanthus 细胞。要将荧光微球添加为细胞的基准标记物，请使用 TPM 缓冲液将微球稀释至 1：100。彻底摇动磁珠悬浮液，向细胞中加入 5 至 10 μL。

从预热的 1% 琼脂糖大垫中，切出一个大约与盖玻片大小相同的小垫，并将其放在细胞顶部。然后将盖玻片放在垫的顶部，以防止蒸发并将细胞保持在潮湿的环境中。在延时显微镜记录之前，将显微镜样品在 32 摄氏度下孵育 15 至 20 分钟，让细胞附着在琼脂糖垫的底部。

要进行延时显微镜检查，请打开显微镜并启动显微镜控制软件。选择正确的物镜和反射镜和滤光片，以获取相差图像以及绿色荧光、红色荧光或黄色荧光蛋白的图像。将一滴优质浸油滴到物镜镜头和在 32 摄氏度预孵育的样品底部。

将孔面朝向物镜，将装有样品的金属框架放在显微镜载物台上，然后将样品牢固地固定在载物台支架上。通过将载物台沿 Z 方向移近物镜来聚焦细胞。当物镜上的油和样品接触时，沿 X/Y 方向移动载物台。

切换到 Metamorph 软件并打开 Acquire 工具。在 设置 下拉列表中选择 相差 并将 曝光时间 设置为 100 毫秒。单击 Show Live，将 Cell 带入焦平面，然后在 X/Y 方向上移动舞台，直到在视野中可以看到多个单个单元格。

确保至少有一个荧光微球位于观察区域内，以便稍后对齐采集的图像。接下来，打开显微镜控制软件的 Multi-Dimensional Acquisition 向导，设置延时实验，允许显微镜根据需要采集多个波长和载物台位置的图像。在 Main 选项卡中，激活 Time-lapse 和 Multiple Wavelengths。

其他选项卡将显示在窗口的左侧。单击 保存 选项卡和 选择目录 在计算机硬盘驱动器上选择一个空文件夹来保存采集的图像，然后激活 如果文件存在则递增基本名称 以确保连续的数据集不会覆盖前面的数据集。为实验指定一个带有日期的名称以及实验的菌株名称或标题。

单击延时选项卡以调整延时参数，然后将 时间间隔 设置为 20 分钟，将 持续时间 设置为 24 小时。时间点的数量会自动改变。现在，单击 Wavelengths 选项卡。

通过更改数字，选择在每个时间点为每张图像采集的波长数。选择允许每个波长的单独硬件记忆 AF 位置。点击 First Wavelength 选项卡。

在 Illumination 下拉列表中，选择 Phase Contrast。选择 100 毫秒进行曝光，然后在 Acquire 下拉列表中，选择 Every Time Point。通过选择 从不 并在 自动聚焦 的下拉列表中选择 每次采集 ，在下拉列表中停用 自动曝光。

设置每个波长的曝光，如刚才使用以下参数演示的那样。然后，要从多个舞台位置采集图像，请在 Main 选项卡中激活 Multiple Stage Positions。单击 Stage 选项卡，然后单击 Live 按钮查看视野。

沿 X/Y 方向移动舞台，直到 ROI 位于视野中。通过单击加号，将 X 和 Y 坐标保存在 Stage 选项卡中。再次沿 X/Y 方向移动舞台，直到找到新的 ROI，然后单击加号再次保存坐标。

继续作，直到保存所需的片段数。通过单击不同的保存的 X 和 Y 位置再次检查细胞是否聚焦，然后单击 AFC 按住开始硬件自动对焦，以在整个实验过程中保持保存的 Z 位置恒定。单击"采集"，在显微镜控制软件的"多维采集"向导中开始延时记录。

检查单元格在延时录制的前几个时间点之后是否仍然清晰对焦，以最大限度地提高图像质量并在需要时重新聚焦。要生成延时短片并执行图像对齐，请启动图像分析和处理软件。通过单击"查看多维数据"、"选择基本文件"、"选择目录"，然后打开包含多维数据的文件夹，以堆栈形式打开图像。

检查数据集，然后单击 View （查看）。数据集将从 Time Point One 一直显示为单张图像。激活用于创建堆栈的波长，然后选择堆栈中应包含的所有图像，然后单击 Load Images。

对所有波长重复此步骤并保存已完成的堆栈。激活需要校正偏差的图像堆栈。使用 Apps、Auto Align 打开对齐工具。

选中 堆栈 作为图像的源，选中 第一平面/时间点 作为参考平面，然后使用 源堆栈 按钮选择堆栈并单击 应用。自动对齐完成后，保存对齐的堆栈。要生成 MOV 或 AVI 格式的电影，请打开 制作电影 功能 堆栈， 制作电影.

使用 源堆栈 按钮，然后选择输出格式、帧速率、帧数，然后单击 优惠.在这个使用运动型 DK1622 野生型细胞进行的延时实验中，每 5 分钟采集一次相差图像，持续 24 小时。正如预期的那样，细胞是运动的，并且主要成群移动。

在非运动 Delta-mgIA 细胞的相差活细胞成像中，在微菌落形成过程中跟踪单个细胞的生长和分裂。当每 5 分钟采集一次图像，持续 24 小时时，可以在单细胞分辨率下量化 235 加或负 50 分钟的划分时间。为了研究细胞在长期追踪 yfp 标记蛋白的同时是否正常生长，追踪了表达 ParB-YFP 的 M.xanthus 细胞。

ParB-YFP 最初在亚极细胞区形成单簇。在细胞分裂之前或之后不久，细胞簇复制，一个细胞簇保留在旧细胞极，第二个细胞簇转移到新的细胞极。在该实验中，表达 FtsZ-gfp 的非运动细胞在中细胞处显示出 FtsZ-gfp 的强烈积累，这决定了细胞分裂的位置。

FtsZ-gfp 在中细胞形成一个簇，主要在较长的细胞中。细胞分裂 2 小时后，FtsZ-gfp 在子细胞的中细胞中积累。一旦掌握了这项技术，就可以在黄瘤粘球菌以及任何其他生长缓慢的细菌上常规进行。

为细菌设置此程序时，重要的是要调整琼脂平板中生长培养基的组成，以满足该细菌的特定生长要求。对于任何细菌，确定最佳成像条件（例如曝光时间、光强度和成像频率）以避免光毒性都很重要。此外，对于任何荧光标记的蛋白质，都需要调整成像条件以避免光毒性和光漂白。