你在哪里切的问题: 眼地标性小鼠视网膜空间定位的解剖与分析指南
August 4th, 2018
该协议提供了一个全面的解剖和分析指南, 使用深眼地标, s-视蛋白免疫组化, Retistruct 和自定义代码, 以准确和可靠地定向孤立的小鼠视网膜在解剖空间。
该解剖方案的目的是为使用眼部解剖标志（如直肌、脉络膜裂和 S-视蛋白梯度）提供一种标准化的方法，用于小鼠视网膜的地形方向。这些技术的主要优点是它们提供了一种可靠的方法来准确识别离体小鼠视网膜的背侧、腹侧、鼻极和颞极。首先确定角膜背侧靠近角膜巩膜边界以及鼻眦和颞眦之间的一个点。
用加热的烧灼笔触摸角膜不到一秒钟，以创建烧伤痕迹以进行定向。对第二只眼睛重复上述步骤。背侧烧伤的存在可以识别上直肌。
对于眼球摘除术，使用弯曲的镊子轻轻地将眼睛从眼窝中推出，并从下方抓住眼球。然后，慢慢地将地球仪从眼窝中取出，同时轻轻地从左向右移动，直到地球仪从眼窝中释放出来。将带有附着的直肌的球体转移到含有解剖培养基的培养皿中。
如果使用双眼工作，请确保跟踪哪只眼睛是左眼，哪只眼睛是右眼。在解剖镜下，目视定位角膜背侧烧伤并确定与之相关的上直肌。使用解剖剪刀或 20 号针头，在烧伤痕迹处穿刺角膜。
然后，朝向视神经方向对眼球进行深缓解切割，以将上部肌肉一分为二。此处显示了具有此切口的孤立视网膜，此处显示了具有此切口的重建视网膜。使用两组镊子开始隔离视网膜，轻轻撕开穿刺形成的孔，直到部分视网膜暴露出来。
然后，将视网膜与巩膜分开，直到巩膜完全去除。去除虹膜、晶状体、玻璃体和任何剩余结构，直到视网膜完全隔离。背侧烧伤的存在可以识别鼻和颞部脉络膜裂。
如果用右眼工作，鼻脉络膜裂位于烧伤的右侧，颞部脉络膜裂位于烧伤的左侧。这与使用左眼相反。要使用脉络膜裂标志物来识别视网膜方向，请定位并识别眼睛后部的脉络膜裂。
调整地球的方向，使背侧烧伤痕位于上极，就像眼睛仍在小鼠中一样。然后，使用解剖剪刀或 20 号针头在眼球上穿刺一次，首先是背侧烧伤所在的位置。接下来，朝角膜背侧烧伤所在的视神经做一个浅的缓解切口。
然后，朝视神经做以下两个深缓解切口。一种是将解剖剪刀的刀片与眼睛后部的颞部脉络膜裂线对齐，另一种是将解剖剪刀的刀片与眼睛后部的鼻脉络膜裂线对齐。这些切口显示在分离和重建的视网膜上。
进行这些切割后，使用两组镊子轻轻撕开穿刺孔，直到露出部分视网膜。使用解剖剪刀在视网膜上做四个缓解切口，使其平放。用镊子轻轻将视网膜的每个角压在膜上，将视网膜神经节细胞面朝上安装在硝酸纤维素膜上。
然后，使用镊子将镶固的视网膜浸入 24 孔板的第一个孔中所含的一毫升 4% 多聚甲醛中。将 24 孔板置于室温下的定轨摇床上，并固定视网膜 40 分钟。固定后，将视网膜转移到板的第二个孔中，该孔中装满 1 毫升 0.1 摩尔 PBS，并在室温下洗涤视网膜 15 分钟。
洗涤完成后，将镶固的视网膜转移到含有 1 毫升封闭溶液的第五个孔中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将兔抗 S-视蛋白一抗以 1 至 500 的浓度添加到封闭液中，并在 4 摄氏度下孵育 3 天。孵育 3 天后，将视网膜上多余的一抗洗涤 6 次，依次放入 6 个填充有 1 毫升 PBS 的孔中，每个孔在室温下 10 分钟。
然后将洗涤过的视网膜放入装有新鲜封闭溶液的孔中，并加入驴抗兔 Alexa 594 二抗。将视网膜与二抗在 4 摄氏度下孵育过夜。孵育后，像以前一样在 PBS 中洗涤视网膜六次。
使用镊子将已安装的视网膜转移到含有 PBS 的培养皿中。轻轻地将镊子尖端插入视网膜和膜之间，直到视网膜不再附着，从而将视网膜从硝酸纤维素膜中释放出来。将玻璃显微镜载玻片浸入 PBS 中，将视网膜漂浮在载玻片上，用镊子轻轻刺激，直到视网膜粘在玻璃上，将视网膜安装在载玻片上。
用安装介质覆盖载玻片上的视网膜，并放置 1.5 盖玻片。将玻片放入玻片托盘中，在室温下静置一小时。一小时后，将载玻片托盘置于 4 摄氏度。
盖玻片 24 小时后，使用指甲油密封载玻片的侧面以防止干燥。这是从右眼分离的视网膜的一个例子，它经过免疫染色以标记 S-视蛋白并用落射荧光显微镜成像。重要的是要注意，该视网膜中的切口是任意的，因为地形方向可以通过 S-opsin 梯度来识别。
然后可以使用 ReadiStruct 软件对采集的视网膜图像进行数字重建。在此图像中，原始剪切是伪彩色红色。请注意，此程序的输出文件未正确对齐 Retina。
在通过自定义 mat 实验室代码运行视网膜后，视网膜旋转，以便将最高浓度的 S-视蛋白染色放置在底部并被识别为腹侧视网膜。这张图片显示了左眼的视网膜。颞极位于与腹极逆时针 90 度的位置，鼻极位于与腹极逆时针 90 度的位置。
一旦掌握，如果作得当，这些解剖技术可以在短短几分钟内相当快地完成。观看此视频后，您应该对如何使用上直肌、脉络膜裂或 S-视蛋白梯度作为标志来准确可靠地定位小鼠视网膜有一个很好的了解。
概述
本协议提供了一种利用眼部地标和免疫组织化学分析分离的小鼠视网膜的解剖和分析指南。关键技术包括通过特定的解剖特征和S-视蛋白梯度识别背侧和腹侧极点。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 免疫组织化学
背景
- 研究侧重于使用既定的眼部解剖地标来精确定位视网膜。
- 识别解剖地标对于提高视网膜相关研究的准确性的重要性。
- 免疫组织化学在可视化视网膜结构中的应用。
- 研究中解剖协议的标准化以实现研究的可重复性。
研究目的
- 提供一种可靠的方法来识别特定的视网膜方向。
- 利用解剖地标，如S-视蛋白梯度进行视网膜分析。
- 提高神经科学中分离视网膜研究的准确性。
使用的方法
- 本研究主要采用分离小鼠视网膜的解剖技术。
- 小鼠视网膜作为模型系统，重点关注眼部地标的使用。
- 文本中没有提到多组学工作流程。
- 协议概述了视网膜的去核、解剖、固定和染色的具体步骤。
- 关键的方法学细节包括使用烧灼笔进行标记和免疫染色技术。
主要结果
- 研究成功地展示了具有准确解剖定位的视网膜结构的分离。
- 它突出了S-视蛋白梯度在识别视网膜极性方面的实用性。
- 提供了视网膜解剖的机制洞见，并有清晰的程序步骤。
- 结论强调了视网膜研究中技术标准化的重要性。
结论
- 本协议促进了视网膜定位和分析的精确性提高。
- 结果能够更好地进行视网膜响应和结构的生物力学和生理评估。
- 对视觉科学和解剖研究未来研究的重要影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate spatial orientation of the mouse retina is critical for reproducible analysis in visual neuroscience, enabling reliable comparison of cell density gradients, directional tuning, and degeneration patterns across studies. Standardizing orientation methods using deep ocular landmarks reduces variability and supports mechanistic de-risking in target validation pipelines. This protocol enhances predictive confidence by ensuring consistent anatomical alignment, a prerequisite for translational biomarker alignment and preclinical model reproducibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal cell type gradients and pathway-specific functional assays through precise dorsal-ventral and nasal-temporal orientation.
- Operational Value: Reduces ambiguity in phenotypic screening by establishing a repeatable reference frame for directional tuning and topographic analyses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay standardization by ensuring consistent retinal flat-mount orientation, critical for quantitative immunohistochemistry and imaging-based readouts.
- Operational Value: Facilitates scalable workflows through reliable dissection and fixation steps compatible with multi-well plate processing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables alignment of degeneration patterns with anatomical axes, improving translational biomarker relevance in retinal disease models.
- Operational Value: Promotes cross-study comparability by minimizing orientation-related noise in preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into early discovery workflows by providing a standardized orientation step prior to immunohistochemistry, imaging, and functional assay execution, ensuring data integrity from target validation through preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate spatial mapping of retinal structures and cell-type distributions.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible retinal isolation and orientation, reducing technical variance in compound screening.
- Analytics: Generates quantifiable spatial data via S-opsin gradient analysis, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by ensuring consistent anatomical reference points for degeneration and regeneration studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and orientation platform applicable across multiple retinal neuroscience projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in retinal orientation-dependent assays.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability through standardized dissection, fixation, and staining protocols.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by minimizing biological noise in early-stage retinal target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by ensuring data comparability across studies and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and ocular anatomy identification.
- Dependent on access to cautery tools, dissection microscopes, and immunohistochemistry reagents.
- Necessitates standardization of landmark identification across teams to ensure inter-laboratory consistency.
- Adaptation to alternative model systems may require validation of conserved ocular landmarks.
- Relies on computational tools (Retistruct, custom code) for S-opsin-based orientation, adding bioinformatics dependency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Using the Superior Rectus Muscle Landmark to Identify Retinal Orientation
2:36
Using the Choroid Fissure Landmark to Identify Retinal Orientation
4:06
Labeling the S-opsin Gradient in the Mouse Retina
7:02
Results: Using the S-opsin Gradient to Identify All Four Poles of the Retina
8:09
Conclusion
