切割位置至关重要：基于眼球解剖标志的小鼠视网膜空间定位解剖与分析指南

本解剖方案的目的是提供一种标准化的方法，利用眼内解剖标志（如直肌、脉络膜裂和S-视蛋白梯度）对小鼠视网膜进行拓扑定位。这些技术的主要优势在于能够可靠且准确地识别分离后小鼠视网膜的背侧、腹侧、鼻侧和颞侧极点。首先，在角膜背侧靠近角膜-巩膜交界处、且位于鼻侧和颞侧睑裂之间的位置确定一个点。

用加热的烧灼笔触碰角膜，时间少于1秒，以产生用于定位的灼伤标记。对另一只眼睛重复此操作。背侧灼伤标记的存在有助于识别上直肌。

进行去核操作时，使用弯头镊子轻轻将眼球从眼窝中推出，并从下方夹住眼球。然后，在缓慢将眼球从眼窝中提起的同时，轻柔地左右移动，直至眼球完全脱离眼窝。将带有附着直肌的眼球转移至含有解剖培养基的培养皿中。

若同时处理双眼，务必记录清楚左眼和右眼。在解剖显微镜下，目视定位角膜背侧的灼伤部位，并识别与其相关的上直肌。使用解剖剪或20号针头，在灼伤标记处穿刺角膜。

然后，朝向视神经方向在眼球上做一深部减压切口，以分离上方肌肉。此处显示的是带有此切口的分离视网膜，以及带有此切口的重建视网膜。使用两把镊子，轻轻撕开穿刺形成的小孔，开始分离视网膜，直至部分视网膜暴露出来。

然后，将视网膜从巩膜上仔细分离，直至完全去除巩膜。去除虹膜、晶状体、玻璃体及任何残留结构，直至视网膜完全游离。存在背部烧灼痕迹可帮助识别鼻侧和颞侧的脉络膜裂。

若操作右眼，鼻侧脉络膜裂位于烧灼点右侧，而颞侧脉络膜裂位于烧灼点左侧。这与操作左眼时相反。利用脉络膜裂这一解剖标志来确定视网膜方位时，需在眼球后部定位并识别脉络膜裂。

将眼球调整至背侧灼伤标记位于上方极点的位置，就像眼球仍在小鼠体内时的方位一样。然后使用解剖剪刀或20号针头，在背侧灼伤标记所在位置对眼球进行一次穿刺。接着，从该穿刺点向视神经方向、背侧角膜灼伤所在位置做一浅层减压切口。

然后，朝视神经方向做两个减压深切口。一个切口沿眼球后部的颞侧脉络膜裂线，将解剖剪的刀片与其对齐；另一个切口沿眼球后部的鼻侧脉络膜裂线，将解剖剪的刀片与其对齐。这些切口在此处展示于一个分离并重建的视网膜上。

完成这些切口后，使用两把镊子轻轻撕开穿刺孔，直至部分视网膜暴露。用解剖剪刀在视网膜上做四个减张切口，使其能够平铺。将视网膜节细胞面朝上，用镊子轻轻按压视网膜的每个角，将其固定在硝酸纤维素膜上。

然后，用镊子将固定好的视网膜浸入24孔板第一孔中的一毫升4%多聚甲醛溶液内。将24孔板置于室温下的水平摇床上，准确固定视网膜40分钟。固定后，将视网膜转移至第二孔中，该孔内含有1毫升0.1摩尔的磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下洗涤15分钟。

洗涤完成后，将已固定的视网膜转移至第五孔中，孔内含1毫升封闭液，并在4摄氏度下孵育过夜。次日，向封闭液中加入兔抗S-视蛋白一抗，稀释比例为1:500，在4摄氏度下孵育3天。3天孵育结束后，在室温下将视网膜依次放入6个含有1毫升PBS的孔中，每孔10分钟，共洗涤6次，以去除多余的未结合一抗。

然后将洗涤后的视网膜放入含有新鲜封闭液的孔中，并加入驴抗兔Alexa 594二抗。在4°C条件下避光孵育过夜。孵育结束后，用PBS如前所述洗涤视网膜六次。

用镊子将已固定的视网膜转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。轻轻将镊子尖端插入视网膜与硝酸纤维素膜之间，逐步分离视网膜，直至其完全脱离膜。将一块玻璃载玻片浸入PBS中，然后将视网膜漂浮于载玻片上，并用镊子轻轻推动，直至视网膜牢固黏附于玻璃表面。

用封片剂覆盖载玻片上的视网膜，并加盖一张1.5盖玻片。将载玻片放入载玻片托盘中，在室温下静置1小时。1小时后，将载玻片托盘置于4摄氏度环境中。

载玻片加盖盖玻片后静置24小时，使用指甲油密封载玻片四周，以防止干燥。此图为从右眼分离的视网膜，经免疫染色标记S-视蛋白后，使用落射荧光显微镜成像的结果。需要注意的是，该视网膜中的切口是任意的，因为视网膜的拓扑方向可通过S-视蛋白的梯度来确定。

随后可使用 ReadiStruct 软件对获取的视网膜图像进行数字重建。在此图像中，原始切面以伪红色显示。请注意，该程序的输出文件未能正确对齐视网膜。

在视网膜经过自定义的 MatLab 代码处理后，将视网膜旋转，使S-视蛋白染色浓度最高的区域位于底部，并确定为视网膜腹侧。该图像显示的是左眼的视网膜。颞极位于腹极逆时针90度处，鼻极位于腹极顺时针90度处。

一旦掌握，这些解剖技术若操作得当，仅需几分钟即可快速完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用上直肌、脉络膜裂或S-视蛋白梯度作为解剖标志，准确且可靠地定位小鼠视网膜。