基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

该方法有助于解答髓系疾病（如骨髓增生异常综合征）或其他伴有髓系细胞谱系成熟异常的血液系统疾病诊断中的关键问题。该技术的主要优势在于能够降低研究者在分析和判读过程中的主观性。该方法可揭示哪些参数对骨髓增生异常综合征最具鉴别意义。

它能够量化与正常髓系细胞群体之间的差异。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Tiphanie Picot 演示。首先，在一个 15 毫升的锥形管中，将 600 微升的原代细胞样本与 10 毫升洗涤缓冲液混合，每次洗涤使用 10 毫升新鲜洗涤缓冲液，共进行两次离心。

第二次洗涤后，将沉淀重悬于400微升新鲜洗涤缓冲液中，取350微升细胞悬液转移至一个5毫升聚丙烯FACS管中，该管内已含有完整的骨干抗体组合。充分混匀细胞后，将细胞-抗体混合液等量分装至三个新的聚丙烯管中，并根据需要以新鲜洗涤缓冲液补足每管终体积至200微升。接着，加入针对目标细胞表面标志物的适量抗体，混匀后于室温避光孵育30分钟。

孵育结束后，加入2毫升裂解液，混匀，在室温下避光孵育10分钟。通过离心收集裂解后的细胞，弃去每管上清液，仅保留最后50微升，注意不要扰动沉淀。用剩余的上清液轻柔重悬沉淀，并向每个样品中加入2毫升新鲜洗涤缓冲液。

第二次洗涤后，弃去上清液，每管中保留约50微升残留液体，注意不要扰动沉淀。用200微升PBS重悬沉淀，并混匀，立即进行分析。在流式细胞仪上检测样本时，首先在流式细胞仪软件中新建一个实验，并根据样本名称、样本类型和日期对实验重新命名。

为三个试管创建新的样本，并在实验设计中注明每个试管所使用的抗体。打开流式细胞仪设置，选择应用设置，以应用每月校准所获得的数值。新建一个全局工作表，并创建适当的散点图，用于圈定单细胞以及粒细胞、单核细胞、原始细胞和淋巴细胞群体。

为补偿对照创建一个新的全局工作表。然后，在技术验证后，以中等采集速率从每支试管中采集 500,000 个事件，并将数据导出为 fcs 3.0 文件。在开始新分析之前，下载包含正常骨髓数据的 cyt 文件，这些数据涵盖中性粒细胞、单核细胞和有核红细胞系，以及 inp 格式的分析文件。

然后，将数据保存到您的桌面。为了将中性粒细胞成熟过程保存至数据库，首先打开 Infinicyt 软件，然后打开对应的中性粒细胞成熟数据的 cyt 文件。在 APS 图上绘制成熟路径，并将中性粒细胞的成熟路径保存至数据库。

打开需要分析的中性粒细胞谱系成熟过程的 fcs 文件。从“profiles”选项卡上传中性粒细胞成熟过程的 inp 文件。该谱系的分析分为三个步骤。

首先选择 CD34 阳性、中性粒细胞定向的原始细胞。为此，使用七个门控的交集，以筛选出 CD34 阳性、CD117 阳性、HLADR 低表达、CD10 阴性、CD13 阳性、CD11b 阴性的细胞事件。随后继续分析，选择 CD117 阳性、CD34 阴性的中性粒细胞前体细胞。

继续对更成熟的中性粒细胞进行分析。接着，展示单核细胞系细胞的分析结果。在APS图上绘制其成熟路径。

确认指示成熟方向的箭头从不成熟的单核细胞（CD14阴性、IREM2阴性）指向成熟的单核细胞（CD14阳性、IREM2阳性）。将单核细胞系的成熟路径保存至数据库中。打开需要分析的单核细胞系成熟过程的fcs文件。

上传用于单核细胞系分析的配置文件。为了鉴定单核细胞系细胞，使用四个门控的交集，以选择 CD64 高表达阳性、CD117 阳性、CD117 阴性以及 HLADR 阳性的事件。将这些事件分配至细胞群层级树中的单核细胞标签页。

打开需保存在NRC数据库中的NRC细胞文件。在APS图上绘制有核红细胞的成熟路径，并将该成熟路径保存至数据库中。打开待分析的fcs文件。

从配置文件中上传有核红细胞的分析模板。该谱系的分析分为两个步骤，首先选择 CD34 阳性、定向分化的红系原始细胞。

此处，使用七个门的交集来选择 CD34 阳性、CD117 阳性、HLADR 低表达、CD105 阳性、CD33 阴性、CD36 阳性、CD71 阳性的细胞事件。将这些事件分配至群体层级中的 NRC 选项卡。从视野中移除 CD34 阳性的红系定向原始细胞。

为了鉴定更成熟的红系细胞，使用四个门控的交集，以区分CD45阴性、CD45低表达、侧向散射低、CD36高表达以及CD71高表达的细胞。然后，从有核红细胞中去除CD36高表达且侧向散射低的血小板，并将该细胞群分配至NRC标签页。为了评估骨髓区室中的髓系成熟情况，打开需要评估病例中对应谱系的cyt文件。

仅保留群体层级树中分配给中性粒细胞标签的事件可见。在APS图上绘制成熟路径，并加载对应于正常骨髓中中性粒细胞成熟的数据库，进行数据比较。如果数据至少部分兼容，软件将生成标准化的成熟差异图和参数带，以可视化成熟差异。

为了比较新病例与正常骨髓样本中单核细胞在骨髓区室内的成熟情况（包括单核细胞数据库中的数据），打开对应于单核细胞系的cyt文件。仅保留细胞群层级树中分配至单核细胞标签的事件可见，并在APS图上绘制其成熟路径。加载正常骨髓中单核细胞成熟的相应数据库，并进行数据比对。

为了将新病例的骨髓腔内有核红细胞成熟情况与NRC数据库中正常骨髓的数据进行比较，请打开对应于NRC谱系的cyt文件。仅保留群体层级树中分配给NRC标签的事件可见，并在APS图上绘制成熟路径。

加载与正常骨髓中NRC成熟过程相对应的数据库，并进行数据比较。然后，点击“标准化成熟差异”并放大，以可视化新文件与数据库中数据之间的差异显著性。请记住，在流式细胞术数据分析中使用层次分类算法的方法具有高度主观性且本质上不准确，因为这类方法未考虑细胞群体间的重叠。

将疑似骨髓增生异常综合征（MDS）的新发细胞减少症病例与髓系正常成熟数据库进行比对，可识别中性粒细胞、单核细胞及无核红细胞（NRC）谱系中异常表达的成熟抗原，即使在无细胞形态学或细胞遗传学异常的病例中亦可实现。在实施该流程时，需注意以标准化方式获取流式细胞术数据，每月进行流式细胞仪设置校准，执行每日质控检查，使用抗体前严格混匀，并严格遵守染色时间。完成该流程后，可进一步采用其他方法（如compass）对不同病例组进行比较，以回答更多问题，例如特定病例组最终的典型免疫表型特征是什么。

该技术问世后，为研究克隆性造血潜能未定患者中髓系细胞成熟模式的研究人员铺平了道路，有助于可靠地识别与发育异常过程明确相关的最终典型改变。请注意，通过增加健康供体的数据量来更新数据库，可能有助于提高分析的稳健性。