数据库引导流式细胞术评价骨髓细胞成熟
2018年11月3日
mds 诊断是困难的, 在没有形态学标准或非信息细胞遗传学。mfc 可以帮助优化 mds 诊断过程。为了对临床实践有用, mfc 分析必须基于具有足够特异性和敏感性的参数, 数据应在不同的操作人员之间重现。
这种方法可以帮助回答骨髓疾病诊断中的关键问题，如骨髓发育不良综合征或其他血液疾病，这些疾病在骨髓细胞系的成熟异常下进化。这种技术的主要优点是，它降低了调查员在分析和解释中的主观性。这种方法可以提供洞察哪些是骨髓发育最歧视性的参数。
它允许定量与正常骨髓细胞群的差异。演示这个程序的将是蒂普哈尼·皮科特，一个来自我们实验室的博士后研究员。首先将600微升的原细胞样品与10毫升的洗涤缓冲液混合在15毫升锥形管中，用于两次离心和每次洗涤10毫升新鲜洗涤缓冲液。
第二次洗涤后，将颗粒重新悬浮在400微升的新鲜洗涤缓冲液中，将350微升的细胞悬浮液转移到5毫升聚丙烯FACS管中，内含整个骨干抗体面板。彻底混合细胞后，移液器等量的细胞抗体溶液放入三个新的聚丙烯管中，并必要时将每个管中的最终体积与新鲜洗涤缓冲液一起带到200微升。接下来，将适当体积的抗体添加到感兴趣的细胞表面标记物上，混合，在室温下孵育30分钟，防止光线。
在孵育结束时，加入两毫升的解液混合，在室温下孵育10分钟，防止光线。通过离心收集开液细胞，并丢弃每个管中除了最后50微升的上经剂，而不干扰颗粒。用温和的混合将颗粒重新悬浮在剩余的上清液中，并在每个样品中加入两毫升的新鲜洗涤缓冲液。
第二次洗涤后，丢弃上经剂，在每个管中留下大约50微升的剩余体积，而不会干扰颗粒。将颗粒重新悬浮在 200 微升 PBS 中，并混合，立即进行分析。要读取流式圆环仪上的样本，请首先在流式测速仪软件中打开一个新的实验，然后根据名称、样本类型和日期重命名实验。
为三根管创建新的试样，并指定实验布局中每个管中使用的抗体。打开圆度计设置，然后选择应用程序设置，以应用在每月设置中获得的值。打开一个新的全局工作表，并创建适当的点图，用于对单细胞以及粒细胞、单细胞、爆炸和淋巴细胞群进行浇注。
为薪酬控件创建新的全局工作表。然后，以中等采集速率从每个管获取 500，000 个事件，在技术验证后将数据导出为 fcs 3.0 文件。在开始新的分析之前，请下载包含正常骨髓数据的细胞文件，用于嗜中性粒细胞、单细胞和核化红色血统，以及 inp 格式的分析文件。
然后，将数据保存到桌面上。为了将嗜中性粒细胞成熟保存到数据库，首先打开英菲尼科特软件，然后打开与中性粒细胞成熟度数据对应的细胞文件。在 APS 图上绘制成熟路径，将嗜中性粒细胞的成熟路径保存到数据库。
打开必须分析的嗜中性粒细胞血统成熟度的 fcs 文件。从配置文件选项卡上传嗜中性粒细胞成熟度 inp 文件。此血统的分析分为三个步骤。
从选择 CD34 阳性、中性粒细胞承诺的爆炸开始。为此，使用七个门的交点，允许选择CD34阳性、CD117阳性、HLADR低、CD10负、CD13阳性、CD11 b阴性事件。继续分析，选择CD117阳性，CD34阴性中性粒细胞前体。
继续分析，选择更成熟的嗜中性粒细胞。接下来，显示单细胞血统细胞的分析。在 APS 图上绘制成熟路径。
验证指示成熟感的箭头是否从不成熟的单细胞、CD14 阴性、IREM2 阴性方向定向到成熟单核细胞、CD14 阳性、IREM2 阳性。将单核血统的成熟路径保存到数据库。打开必须分析的单核血统成熟度的 fcs 文件。
上传轮廓进行单核血统分析。要识别单核血统细胞，请使用四个门的交点，允许选择 CD64 正高、CD117 阳性、CD117 阴性、HLADR 阳性事件。将这些事件分配给总体层次结构树中的单核选项卡。
打开必须保存在 NRC 数据库中的 NRC cyt 文件。在 APS 图上绘制成熟路径，将成核红细胞成熟路径保存到数据库。打开必须分析的 fcs 文件。
从配置文件上传成核红细胞的分析模板。此血统的分析分为两个步骤。从选择CD34阳性，红机器人承诺爆炸开始。
在这里，使用七个门的交点，允许选择CD34正、CD117阳性、HLADR低、CD105阳性、CD33负、CD36阳性、CD71阳性事件。将这些事件分配给总体层次结构中的 NRC 选项卡。从可见性中去除 CD34 正红环形机器人承诺的爆炸。
要识别更成熟的红体细胞，请使用四个门的交点，允许识别CD45阴性和低，侧散低，CD36正高，和CD71正高。然后，从核红细胞中去除 CD36 高侧散射低血小板，并将此总体分配给 NRC 选项卡。要评估骨髓室中的骨髓成熟，请打开与必须评估的案例中感兴趣的血统对应的细胞文件。
在总体层次结构树中，仅对分配给中性粒细胞选项卡的事件保持可见。在 APS 图上绘制成熟路径，并加载与中性粒细胞在正常骨髓中成熟对应的数据库，并比较数据。如果数据至少部分兼容，软件将创建一个规范化的成熟度差异图和一个参数带，以可视化成熟度差异。
要比较骨髓室中的单核成熟度，对于来自正常骨髓的新病例，包括单核细胞数据库中的数据，打开与单核细胞系对应的细胞文件。仅保持在人口层次结构树中分配给单核子选项卡的事件可见，并在 APS 图上绘制成熟路径。加载与正常骨髓中单细胞成熟对应的数据库，并比较数据。
要比较骨髓室中成核红细胞成熟，对于新病例，使用 NRC 数据库中包括的正常骨髓数据，打开与 NRC 血统对应的细胞文件。仅使总体层次结构树中分配给 NRC 选项卡的事件可见。并在 APS 图上绘制成熟路径。
加载与正常骨髓中 NRC 成熟度对应的数据库，并比较数据。然后，要可视化新文件和数据库中包含的数据之间的差异的重要性，请单击规范化的成熟差异并缩放。请记住，在流式细胞学数据分析中使用分层分类算法的方法具有高度主观性，本质上是不准确的，因为它们不计算细胞总体重叠。
对疑似为MDS的新病例的评估，可对骨髓正常成熟数据库进行鉴定，以便识别中性粒细胞、单细胞和NRC血统的异常表达成熟抗原，即使在没有细胞学或细胞学异常的情况下。在尝试此程序时，重要的是要记住以标准化的方式获取流式细胞测量数据，执行每月细胞计设置、每日检查、使用前严格移液抗体以及尊重染色时间。按照此过程，可以执行其他方法（如指南针）来比较不同组的情况，并回答其他问题，例如特定案例组的最终类型印记是什么。
在开发后，这项技术为有兴趣探索骨髓细胞成熟模式的研究人员铺平了道路，在克隆造血体具有不确定潜力的情况下，可以确定最终的细胞变化，这些变化与消化不良过程可靠相关。请注意，使用健康捐赠者的数据数量增加来更新数据库可能会提高分析的稳健性。
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概述
本文讨论了使用多参数流式细胞术（MFC）来增强骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断过程。它强调了在临床应用中MFC分析的特异性和灵敏度的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 血液学
- 髓系疾病
- 诊断技术
背景
- 没有形态学标准，MDS诊断具有挑战性。
- 无效的细胞遗传学使诊断过程复杂化。
- MFC可以潜在地改进MDS诊断过程。
- 操作者之间数据的可重复性至关重要。
研究目的
- 评估MFC在诊断髓系疾病中的有效性。
- 确定骨髓增生异常的最具区分性的参数。
- 减少分析和解释中的主观性。
使用的方法
- 将原代细胞样本与洗涤缓冲液混合。
- 进行离心以进行样本制备。
- 量化与正常髓系细胞群体的差异。
- 由博士后研究员示范程序。
主要结果
- MFC提供了髓系细胞群体差异的见解。
- 该技术减少了研究者的主观性。
- 它允许对区分参数进行量化。
- 数据的可重复性对临床实用性至关重要。
结论
- MFC可以提高MDS的诊断准确性。
- 特异性和灵敏度对临床应用至关重要。
- 需要进一步验证以广泛应用于临床。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
