Name: 体内高分子量截离法从脑间质液中提取大细胞外蛋白的微透析方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习使用高分子量截留探针进行体内微透析技术，从清醒自由活动小鼠的脑间质液中采集大分子细胞外蛋白。该方法可实时监测神经信号传导和废物清除动态，为神经科学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了文部科学省创新领域研究项目（脑蛋白老化与痴呆控制）（15H01552）以及青年科学家研究项目（B）（16K20969）的资助。作者感谢David M. Holtzman博士和John R. Cirrito博士在本方法开发过程中提供的技术指导。

所有动物实验均经东京大学医学研究生院机构动物护理和使用委员会审查并批准。
1. 术前准备
<ol>
	<li>手术开始前，用70%乙醇擦拭所有物品以维持无菌条件。&#160;建议使用加热垫提供保温支持。</li>
	<li>通过腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果。&#160;建议在麻醉诱导时使用缓释型美洛昔康，并在恢复期每12小时给予一次丁丙诺啡，持续至少24小时&#160;。</li>
	<li>使用手术剪刀剃除毛发。利用耳杆和鼻夹将小鼠固定在小鼠与新生大鼠适配器上。 
	注意：此步骤中必须确保小鼠头部牢固固定，不得左右移动。</li>
	<li>在麻醉期间，于眼睛表面涂抹兽用眼膏以防止干燥。</li>
</ol>
2. 用于导管套管植入的立体定位手术
<ol>
	<li>将小鼠和新生大鼠适配器安装到立体定位仪上。使用手术刀在颅骨上方的皮肤上做矢状切口。用湿润的棉签擦去颅骨上的血液和结缔组织。</li>
	<li>使用脑图谱确定目标脑区的坐标。在开始测量前，确保中线笔直，以便钻头在前后方向移动时始终位于中线缝线上。 
	注：本文使用坐标（前后方向：-3.1 mm，内外侧方向：-2.5 mm，背腹方向：-1.2 mm，12度）定位后部海马区。</li>
	<li>调平颅骨前后方向
	<ol>
		<li>将钻头安装在立体定位架的操纵臂上。降低钻头直至其轻轻接触λ点，记录其腹侧坐标。对bregma点重复此操作。 
		注：当颅骨调平后，bregma点的垂直测量值应与λ点相等。若不相等，需相应调整鼻夹高度。颅骨调平后，记录bregma点的前后方向和内外侧坐标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调平颅骨左右方向
	<ol>
		<li>将钻头从bregma点移至坐标（前后方向：-3.1 mm，内外侧方向：+2.0 mm），降低钻头至颅骨表面并记录垂直坐标。然后对坐标（前后方向：-3.1 mm，内外侧方向：-2.0 mm）重复此操作。 
		注：若颅骨已调平，则距中线等距两点的垂直测量值应相等。若不相等，需调整耳棒高度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在目标坐标（前后方向：-3.1 mm，内外侧方向：-2.5 mm）小心钻出骨孔，用于植入引导套管。若骨孔直径不足以植入引导套管，可再钻一个与原孔重叠的新孔。在右侧（对侧）顶骨上钻另一个孔，植入骨螺钉，以帮助在步骤1.10中固定牙科水泥（见图1B）。</li>
	<li>用刀片从1.5 mL离心管盖子背面切下一个圆形锁紧片，制成一个“冠状环”。该环用于防止牙科水泥扩散至皮肤。将其放置在颅骨上，使步骤2.5中钻出的骨孔位于环内（见图1）。</li>
	<li>将引导套管安装在立体定位适配器的短臂上，并用帽状螺母固定，组成立体定位组件。将立体定位适配器的长臂安装在电极夹上，并将其固定在立体定位仪的操纵臂上（见图1A）。</li>
	<li>将立体定位组件在操纵臂上旋转12度（见图1B）。将引导套管移至步骤1.6中钻出的骨孔位置，缓慢将其插入脑组织，下降1.2 mm。 
	注：探针角度针对海马区特定设计；其他脑区可能需要不同角度或无需倾斜。请参考脑图谱获取精确坐标。务必干燥颅骨表面，否则水泥无法牢固粘附，水泥帽可能脱落。</li>
	<li>在冠状环内添加牙科水泥，完全覆盖引导套管的金属部分和骨螺钉，确保其固定牢固。若仍有暴露的颅骨区域，需补充牙科水泥。</li>
	<li>等待牙科水泥完全干燥（约12–20分钟）。从电极夹上取下立体定位适配器。取下帽状螺母，将立体定位适配器更换为假探针，并重新拧紧帽状螺母。</li>
	<li>将小鼠从立体定位仪上释放，单独饲养于独立笼具中。 
	注：在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。每日检查小鼠状态，直至微透析实验当天。若小鼠表现出疼痛迹象，应给予非甾体抗炎药（如卡洛芬）。进行睡眠-觉醒研究需等待2周，以便小鼠适应新环境10，但其他类型的研究可能只需较短恢复期（例如 1–2天）。</li>
</ol>
3. 微透析装置设置
<ol>
	<li>探针质量检查：用蒸馏水填充一次性1 ml注射器，并使用拜通管将其连接到探针的出口（较短的端口）。用手指盖住通气孔，轻轻推动注射器活塞，将水注入探针。检查水是否从探针入口处渗出，且微透析膜表面无泄漏。
	<ol>
		<li>探针活化：将探针的膜部分浸入乙醇（70–100%）中约两秒钟。然后再次使用注射器向探针内注入蒸馏水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注缓冲液的配制：为避免目标分子黏附于管路，使用人工脑脊液（含1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、3 mM KCl、0.4 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、122 mM NaCl，pH=7.35）将30% BSA溶液稀释至4%，以配制灌注缓冲液。该溶液的电解质浓度与脑脊液相近，应在使用前立即配制。通过孔径为0.1 µm的注射器滤器过滤灌注缓冲液。 
	注意：4% BSA可提高易吸附蛋白的回收率，但可能显著限制化合物的递送，尤其是那些与BSA结合率较高的化合物。在某些情况下使用较低浓度的BSA（如0.15%）是其优势之一3。需注意，BSA在涡旋振荡器或搅拌板上搅动时极易发生聚集，这些聚集物可能堵塞探针或膜孔。配制BSA溶液时应谨慎操作，以减少聚集现象。</li>
	<li>分别准备进样和出样管路（见图1C），并用连接针将两条管路连接。取一次性3 mL注射器，装满灌注缓冲液，使用钝头针将其连接至管路的进样端。启动注射泵，用灌注缓冲液充满整个管路。</li>
	<li>停止注射泵运行，将进样管路与出样管路之间的连接针替换为步骤3.3中已活化的微透析探针（见图1C）。在更换前，请先将探针帽螺母套在探针上。</li>
	<li>将出样管路上的滚轴管安装至滚轴泵上。先以10 µL/min的流速启动注射泵，随后以略低的流速（9.5–9.8 µL/min）启动滚轴泵。务必清除整个管路中的所有气泡，因为气泡进入探针后可能影响回收率。</li>
	<li>按照步骤1.2的方法对步骤1.12中的小鼠进行麻醉，并在其颈部佩戴固定环。取下帽螺母和假探针，缓慢将步骤3.4中的微透析探针经引导套管插入，并拧紧帽螺母。</li>
	<li>将小鼠放入与自由活动系统相连的笼子中，并通过固定环将其与系统连接。持续以步骤3.5中指定的流速运行注射泵和滚轴泵至少1小时。 
	注意：为实现清醒动物脑间质液（ISF）的采集，本文采用自由活动系统，该系统中笼子本身可随动物移动而移动，防止管路扭曲。此外，也可使用各厂商提供的液体旋转接头。</li>
	<li>首先停止滚轴泵，然后停止注射泵。设定所需的流速，使注射泵的运行速度比滚轴泵快20%。 
	注意：例如，若设定流速为1 µL/min，则注射泵应以1.2 µL/min运行。最佳流速需根据每种分子的经验数据确定。</li>
	<li>收集ISF样品：将出样管路的自由端置于冷藏式组分收集器上。 
	注意：合适的样品体积取决于后续分析所采用的检测方法。</li>
	<li>实验结束后取出探针。&#160;（根据需要对小鼠进行麻醉。）&#160; 小鼠恢复处理方式与步骤2.11相同。使用HPLC或ELISA等方法分析所收集的ISF样品。</li>
	<li>微透析结束后清洗整个管路：将探针替换为连接针，重新连接进样与出样管路，然后在整个管路中通入稀释的漂白剂，随后用水冲洗。干燥后保存，以供重复使用。 
	注意：可接受其他类型的管路，但灌注缓冲液中的BSA可能堵塞小直径管路，因此此类管路应视为一次性使用。管路在多次使用后可能出现磨损或堵塞，因此每次使用前必须确保流速稳定一致。</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

作者无披露信息。

使用高分子量截留膜进行微透析时，必须采用推拉模式操作，因此流速的准确性和恒定性至关重要。流速不准确可能导致气泡产生以及样品浓度不一致。如果流速不稳定，请检查所有连接处是否漏液。若问题仍然存在，则可能需要更换新的探针和管路后重新开始实验。
微透析探针由灌注缓冲液持续灌注，因此细胞外分子没有足够时间在灌注液中达到完全平衡。结果，透析液中的浓度远低于其在组织间液（ISF）中的实际浓度。为了估算ISF中分子的真实浓度，常采用零流速法3,5,15。该方法通过改变流速来测定浓度，浓度与流速之间呈反比关系。因此，可通过将指数曲线外推至理论上的零流速，从而确定目标分子的浓度，该点代表分子的完全回收。然而，回收率可能受到多种因素影响，如分子与膜的相互作用、分子的疏水性或其他蛋白的相互作用，需注意的是，理论零流速下的浓度未必完全等同于其在ISF中的真实浓度。
探...

脑间质液（ISF）约占全脑体积的15%–20%，为信号转导、底物运输和代谢废物清除提供了关键的微环境1。因此，从活体动物中采集ISF的能力将对多种生物学过程及疾病机制的研究产生重要意义。体内微透析是少数几种能够从清醒、自由活动的动物脑内采集并定量分析ISF中细胞外分子的方法之一，因而在神经科学研究领域具有重要应用价值2,3。该方法通过将带有半透膜的微透析探针植入脑组织，并以相对缓慢的流速（0.1–5 µL/min）持续灌注缓冲液。在灌注过程中，ISF中的细胞外分子依据浓度梯度被动扩散进入探针，并被收集为透析液。尽管本文主要介绍脑内ISF的采样方法，但其基本原理和操作流程经适当调整后，亦可适用于其他器官。
微透析技术最早于20世纪60年代初期被采用，此后被广泛用于收集脑组织中的小分子物质，包括氨基酸或神经递质。然而，近年来市场上出现了具有高分子量截留膜（100 kDa–3 MDa）的微透析探针，使其应用范围扩展至脑间质液（ISF）中相对较大的蛋白质4,5,6,7。利用这些探针开展的研究发现，一些长期以来被认为仅存在于细胞质内的蛋白质，例如tau蛋白或α-突触核蛋白，实际上在生理条件下也存在于ISF中4,5,8。
使用大截留分子量膜（通常超过 1,000 kDa）的微透析探针时，一个难点是探针内部积聚的压力容易导致超滤引起的液体流失。本文所使用的微透析探针具有独特的结构，可避免这一问题。由于该结构的存在，压力不会积聚，因此使用此类探针进行微透析时，应采用注射泵向探针内灌注（=推，push）和使用滚轴/蠕动泵从探针出口收集透析液（=拉，pull）的&#34;推-拉&#34;模式9（尽管需要推和拉两种泵，但由于探针上设有压力平衡用的通气孔，系统在技术上仅由拉泵驱动）。本文从立体定位手术植入导向套管开始，详细描述如何建立微透析系统，以通过截留分子量为 1,000 kDa 的微透析探针收集脑间质液（ISF）。

<table><tbody><tr><td>Univentor 820 微量采样器</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>带制冷功能的组分收集器</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>滚压泵</td><td>Eicom 微透析</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn 独立系统</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>自由活动系统</td></tr><tr><td>双物种笼具套件</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>AtmosLM 微透析探针（轴长 8 mm，膜长 2 mm）</td><td>Eicom 微透析</td><td>PEP-8-02</td><td>探针、引导套管、假探针和立体定位适配器的轴长应保持一致。</td></tr><tr><td>微透析引导套管（轴长 8 mm）</td><td>Eicom 微透析</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>微透析假探针（轴长 8 mm）</td><td>Eicom 微透析</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>颅骨螺钉</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super Bond C&amp;B 套装</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>牙科水泥</td></tr><tr><td>带数字显示控制台的小动物立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>立体定位装置</td></tr><tr><td>小鼠和新生大鼠适配器</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>小鼠立体定位用标准耳杆及橡胶尖端</td><td>Stoelting</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>30% BSA 溶液</td></tr><tr><td>FEP 管路（70 cm）</td><td>Eicom 微透析</td><td>JF-10-70</td><td>内体积 = 0.5 &amp;micro;L/cm</td></tr><tr><td>特氟龙管路（50 cm）</td><td>Eicom 微透析</td><td>JT-10-50</td><td>内体积 = 0.08 &amp;micro;L/cm</td></tr><tr><td>Byton 管</td><td>Eicom 微透析</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic 鲁尔穿刺接头 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>钝端针头</td></tr><tr><td>滚压管</td><td>Eicom 微透析</td><td>RT-5S</td><td>内体积 = 4 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>螺帽</td><td>Eicom 微透析</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mL 带盖微量离心管</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>组分收集器用管</td></tr><tr><td>立体定位适配器（轴长 8 mm）</td><td>Eicom 微透析</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>连接针</td><td>Eicom 微透析</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>小鼠动物颈圈</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>高速旋转微型电机套件</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>钻机</td></tr><tr><td>荷包牡丹碱</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>用于颅骨螺钉的螺丝刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪毛器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内 微透析法结合高分子量截留探针采集脑组织间液中大分子细胞外蛋白

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

体内 微透析是一种基于透析原理的强大技术，可用于从清醒、自由活动的动物中收集脑间质液（ISF）。尽管微透析是一种成熟的方法，通常用于检测氨基酸或神经递质等相对较小的分子，但近年来也已用于通过使用高分子量截留膜探针来评估ISF中较大分子的动态变化。当使用此类探针时，微透析必须以推-拉模式运行，以避免探针内部积聚压力。本文提供了详细的实验步骤，包括立体定位手术以及如何建立微透析系统以从ISF中收集蛋白质。在微透析过程中，药物可通过全身给药或直接灌注进入ISF。反向微透析是一种将化合物直接注入ISF的技术。将药物加入微透析灌流液缓冲液中，可使其通过探针扩散进入ISF，同时实现ISF的采集。作者以tau蛋白为例，展示了通过反向微透析给予苦味毒素刺激神经元活动后，其水平的变化情况。文中还描述了微透析技术的优点与局限性，并介绍了将其与其他体内 方法结合使用的扩展应用。

在逆向微透析中，为了刺激或抑制神经元活动，已使用毕叩毒素（picrotoxin，GABAA受体拮抗剂）或河豚毒素（tetrodotoxin，Na+通道阻断剂）11,12,13。已有研究表明，神经元活动的增强可促进tau蛋白的释放13,14。与这些先前观察结果一致，在清醒的C57B6/J小鼠中，通过逆向微透析给予50 µM毕叩毒素（PTX）后，采用ELISA法测得的细胞外液（ISF）内源性tau蛋白水平较溶剂对照组（DMSO）升高（详见讨论部分）（图2）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

体内 微透析技术已能够从清醒、自由活动的动物脑组织间液（ISF）中收集存在的分子。为了分析ISF中相对较大的分子，本文重点介绍使用具有高分子量截留膜探针的微透析实验方案。

在体微透析是一种基于透析原理的强大技术，可用于从清醒、自由活动的动物体内采集细胞外液（ISF）。尽管微透析是一种……

该方法有助于解答神经科学研究领域中的关键问题，例如信号转导、底物运输以及脑细胞外间隙中的废物清除是如何发生的。该技术的主要优势在于，它能够对清醒且自由活动动物的脑间质液（ISF）中的大分子细胞外物质进行取样和定量分析。在确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，去除麻醉小鼠颅骨部位的毛发，并使用耳杆和鼻夹将动物牢固地固定在适配器上。将药膏涂抹于动物的眼睛，并将适配器安装到立体定位仪上。使用手术刀在颅骨上方沿矢状方向做皮肤切口，并将钻头安装到立体定位仪操纵臂上。降低钻头直至其轻轻接触λ点，然后将钻头的腹背向（DV）坐标重置为零。然后，将钻头移至前囟，重新设定前后（AP）和内外侧（ML）坐标为零。将钻头从前囟移至垂直位置，降低钻头至颅骨表面，并再次将背腹（DV）坐标设为零。重复上述步骤，对第三个坐标点进行操作后，小心地在目标坐标处钻一个环形骨孔，随后在顶骨对侧再钻第二个孔。将骨螺钉插入第二个孔中，并将1.5毫升微量离心管盖上的锁紧部件放置于颅骨上，使两个环形骨孔位于其圆形范围内。接着，将导向套管置于立体定位适配器的短臂上，并用帽状螺母固定套管。将立体定位仪适配器的长臂固定在电极夹上，并将其连接至立体定位仪操作臂的操纵器。将操作臂上的DV立体定位组件旋转12度，然后将导管套管移至颅骨钻孔位置。随后，缓慢将导管套管向下插入脑内1.2毫米。将牙科水泥添加至牙冠，直至覆盖并固定引导套管的金属部分、骨螺钉以及任何暴露的颅骨，并让水泥干燥。12至20分钟后，从电极夹上取下立体定位适配器，取下帽状螺母，并用假探针替换立体定位适配器。然后重新拧紧帽状螺母，将小鼠从立体定位仪上取下，并将其单独饲养于独立的笼子中。在安装微透析装置之前，用蒸馏水填充一支一次性的一毫升注射器，并使用氟橡胶管将注射器连接至微透析探针的出口。手动封住通气孔，轻轻推动注射器活塞，使水缓慢注入探针内。确认水从探针入口端出现，并观察到微透析膜表面有液体渗出。 为了激活探针，先将探针膜浸入70-100%乙醇中两秒钟，随后用蒸馏水冲洗。将连接针头分别安装在入口和出口管路上，并用一次性三毫升注射器吸取新配制的灌注缓冲液。将装有钝头针的注射器连接至管路的入口端，并使用注射泵将灌注缓冲液充满整个管路。当管路充满时，将进液管和出液管之间的连接针替换为已活化的微透析探针和卡帽螺母，并在滚轴泵的出液管路上安装一段滚轴管。将注射泵的流速设为 10 µL/min，滚轴泵的流速设为 9.5–9.8 µL/min。随后将颈圈套在已植入麻醉状态下导管套管的动物颈部，取下卡帽螺母和假探针。缓慢将微透析探针插入导向套管，并拧紧帽状螺母。然后将小鼠放入与自由活动系统相连的笼子中，并通过颈圈将小鼠固定。至少一小时后，依次停止滚轴泵和注射泵，随后重新启动泵，使注射泵流速比滚轴泵快20%，并将出口管路的自由端置于冷藏式组分收集器上，以收集脑组织间液（ISF）。当获得适当的实验体积后，移除探针，并按照前述方法处理小鼠的恢复。与先前的观察结果一致，当通过反向微透析向清醒的C57B6J小鼠给予50 µM的苦味毒素（Picrotoxin）时，与给予溶剂对照的动物相比，可观察到细胞外间隙内源性tau蛋白水平升高。除了给药应用外，微透析还可与其他体内方法（如脑电图记录或光遗传学技术）结合使用，以进一步探究神经元活动如何影响脑间质液（ISF）中底物浓度的问题。

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

体内高分子量截离法从脑间质液中提取大细胞外蛋白的微透析方法

在自由活动动物的不同脑区中监测细胞外神经递质水平，有助于揭示神经递质释放与行为之间的关联。结合电化学检测的活体微透析技术可提供优异的解剖学和化学分辨率，并可用于研究药理学或生理学干预如何改变基础神经递质传递。...

可存活的啮齿类动物立体定位手术

通过直接向海马内微量注射来调控依赖海马的空间工作记忆，并在清醒、行为正常动物中伴随和随后进行体内微透析以检测代谢物。...

海马区胰岛素微量注射及 在体内的 空间记忆测试期间的微透析技术

该视频展示了使用微透析探针从小鼠脑组织的间质液（ISF）中收集细胞外蛋白质的过程。将带有高分子量截留阈值的半透膜的微透析探针，通过预先植入的导向套管插入麻醉小鼠的脑内。探针连接至泵系统，使生理缓冲液灌注脑组织并与间质液混合。间质液中的蛋白质通过半透膜扩散，进而被收集用于分析。...

从小鼠脑组织间液中进行微透析以分离细胞外蛋白质

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

微透析是神经科学研究中常用的一种技术，因此商用探针需求量很大。本文详细说明了一种探针组装方法，用于构建可靠、同心结构的定制微透析探针，成本低于10美元。...

定制化微透析探针设计

本文介绍了一种分离大鼠脑微血管及制备膜样品的方法。该方案具有明显优势，可从单个动物获得蛋白质产量可观且微血管富集度高的样品。所得样品可用于对脑微血管内皮进行可靠的蛋白质分析。...

一种简单且可重复的制备新鲜分离大鼠脑微血管膜样本的方法

此处，我们介绍一种方法 在体...

在自由活动大鼠脑电图记录期间进行兴奋性氨基酸的微透析

本方案通过微透析系统，对清醒大鼠海马区细胞外液进行详细的实时动态取样。...

使用微透析系统在清醒大鼠中实时动态采集海马区细胞外液

体内，许多中枢神经系统疾病（如胶质母细胞瘤，GBM）所涉及的细胞间通讯极难进行测量和表征。本文介绍了脑部开放流动微透析（cOFM）的操作流程，该方法可用于在GBM的纵向动物模型中采集间质液成分。...

利用脑部开放流式微透析技术在胶质母细胞瘤动物模型中纵向采集间质液

将介绍在麻醉大鼠中使用硅探针进行神经元活动的细胞外记录技术。该技术能够同时从超过100个神经元中获取多个脑区的信息，以单细胞分辨率提供关于多个局部神经回路中神经元集群动态的信息。...

使用硅探针在麻醉大鼠中记录大规模神经元集群活动

学习使用高分子量截留探针进行体内微透析技术，从清醒自由活动小鼠的脑间质液中采集大分子细胞外蛋白。该方法可实时监测神经信号传导和废物清除动态，为神经科学研究提供重要工具。

体内微透析法结合高分子量截留探针采集脑组织间液中大分子细胞外蛋白

探索更多视频

体内 微透析法结合高分子量截留探针采集脑组织间液中大分子细胞外蛋白

探索更多视频

体内微透析法结合高分子量截留探针采集脑组织间液中大分子细胞外蛋白