Name: 果蝇蛹中炎症细胞动力学的长期体内追踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习利用果蝇蛹进行伤口修复与炎症反应的活体成像技术，通过激光诱导损伤和延时成像追踪血细胞迁移动态。该方法结合Drosophila的遗传可操作性，为研究先天免疫和创伤愈合机制提供了高分辨率成像方案。

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我们感谢 Martin、Nobes、Richardson 和 Wood 实验室成员的有益讨论。同时感谢英国布里斯托尔大学沃尔夫森生物成像中心（Wolfson Bioimaging Facility）、美国印第安纳大学布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Stock Centre）和维也纳 果蝇 资源中心（用于 果蝇 品系）和 FlyBase（用于最新信息） 果蝇 基因注释）。本工作由P.M.和W.W.的MRC项目资助（MR/J002577/1）、W.W.的惠康信托资深研究员资助以及P.M.的惠康信托研究者奖资助。

该方案包含四个主要的连续步骤：（1）准备 果蝇 品系与分期 果蝇 蛹，（2）蛹的解剖与制片，（3）蛹的损伤处理，（4） 在体 延时共聚焦成像
1. 准备 果蝇 果蝇蛹的品系与发育阶段确定
<ol>
	<li>获取适当的 果蝇 品系（参见引言和 材料表).</li>
	<li>收集适当基因型的年轻健康成虫果蝇。
	<ol>
		<li>使用二氧化碳气体垫短暂麻醉果蝇，并用细毛刷将具有适当基因型或性别的成虫转移至收集管中。</li>
		<li>向每个含有标准果蝇培养基（玉米粉-糖蜜-琼脂混合物，参见 材料表）添加酵母。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获得最佳的蛹代，每天将成虫转移至装有新鲜食物的新试管中，并将所有试管置于25℃条件下培养 &#176;C. 
	注意：如果使用 Gal4-UAS 系统31 用于驱动谱系特异性基因表达时，所有步骤均应在25℃下进行 &#176;C 或以上，因为 Gal4-UAS 系统具有温度敏感性。</li>
	<li>成像前18小时，挑选至少10只新形成的白色未成熟蛹（pre-pupae）图1A）从试剂瓶（vials）中即 0小时（以蛹壳形成后为准，APF），使用镊子或细毛刷将蛹从原培养瓶内壁上轻轻剥离，并小心转移至一个洁净的空塑料培养瓶侧面。 
	注意：三龄游走期rd 三龄幼虫会从培养基中向上爬行以进行化蛹；新形成的白色前蛹因其前端气门外翻且静止不动（与三龄幼虫不同）而易于识别rd 三龄幼虫）。表皮会转变为“蛹壳”（即蛹的外壳），最初质地柔软且呈白色17必须小心避免损伤蛹体，因为这不仅可能引发非预期的损伤诱导性炎症反应，还可能导致显著的发育延迟。</li>
	<li>将所选蛹在25℃的培养瓶中培养至适当的发育阶段（以羽化后18小时为宜，可获得最佳结果） &#176;C. 
	注意：随着蛹的发育，蛹壳会逐渐变暗且更易碎。</li>
	<li>提前准备好下一步所需的其他试剂。制备庚烷胶时，将一段长约20 cm的卷状双面胶带与20 mL庚烷加入50 mL离心管中，用石蜡膜密封，在室温下于实验台上轻轻摇动过夜。</li>
</ol>
2. 准备与解剖 果蝇 蛹
<ol>
	<li>将已分期的 Drosophila 蛹转移至固定在载玻片上的双面胶带上。使蛹的腹面牢固地粘附在胶带上，背面朝上（图1B）。 
	注意：蛹的前端可通过蛹壳前端突出的两个气门来识别。</li>
	<li>在明场解剖显微镜下，使用镊子和显微剪小心地将蛹从其保护性的蛹壳中取出（图1B-D）。
	<ol>
		<li>首先，用镊子在蛹壳最前端区域做一切口（图1B）。确保该区域的蛹壳内部为空腔且无蛹体组织，因为在早期蛹发育过程中，蛹体已在壳内收缩。</li>
		<li>完成初始切口后，使用镊子或显微剪从前往后方向小心撕开或剪开蛹壳（图1C），直至蛹完全脱离棕色不透明且脆性的外壳（图1D）。 
		注意：此阶段的蛹非常脆弱，操作时需避免刺破蛹体表面；一旦刺破，血淋巴会迅速从破损处渗出，易于观察。任何有穿孔（无论多小）的蛹均应弃用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用庚烷胶将蛹固定于玻璃底培养皿中。
	<ol>
		<li>用20 µL移液器吸头将10 µL预先配制好的庚烷胶（见上文第1.6节）以直线形式滴加在玻璃底培养皿上。</li>
		<li>待胶液干燥约5秒后，用镊子小心地将解剖好的蛹转移至庚烷胶上（图1E）。</li>
		<li>为便于后续造伤和成像，建议将蛹排列成一行；初学者可放置约5只蛹，熟练后可处理更多。 
		注意：当使用直立式成像系统时，推荐使用庚烷胶；若使用倒置系统，则非必需。若胶体在成像过程中引起光学畸变，可直接将蛹置于盖玻片上——在大多数情况下，蛹体组织与玻璃之间的自然黏附已足以保证成像稳定，前提是移动成像培养皿时需格外小心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获得最佳效果，应将蛹固定成翅膀平贴于盖玻片，且大部分翅面与盖玻片直接接触（图1F）。可用镊子轻轻滚动蛹体以调整其位置，确保翅膀正确贴附。</li>
	<li>为防止成像期间样本脱水，在完成固定后，将一片浸有蒸馏水的吸水滤纸小心放置于玻璃底培养皿侧边，注意勿扰动蛹体（图1E），然后盖上培养皿盖。 
	注意：此时蛹已准备好进行造伤与成像。</li>
</ol>
3. 激光诱导损伤 果蝇 蛹翅
<ol>
	<li>将装有固定蛹的玻璃底培养皿转移至配备可调谐激光消融系统的宽场显微镜上。
	<ol>
		<li>使用调谐至 435 nm 的脉冲紫外风冷氮泵浦消融激光器——详见材料表11；照明光的确切波长由用户通过合适的染料池进行选择。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用明场光学系统，调节显微镜载物台控制装置，定位待损伤的第一个蛹的翅组织（图1F）。</li>
	<li>为获得最佳效果，在成像和激光消融过程中均使用油浸 40X 或 63X 物镜；确保消融与成像系统所用的浸油介质（油或甘油）保持一致。使用微调焦旋钮将显微镜聚焦于最靠近玻璃盖玻片的蛹翅上皮平面（即聚焦于将要损伤的上皮区域）。</li>
	<li>通过调节显微镜载物台，使蛹翅处于待损伤区域与消融激光已知靶区精确对齐的位置。</li>
	<li>使用安装在显微镜上的能量密度衰减滑片手动调节消融光的功率水平。 
	注意：衰减滑片设有卡位和刻度，可用于识别相对衰减水平，并实现可重复的设置。</li>
	<li>使用外部手动触发控制装置，通过单次短暂触发启动消融激光以制造伤口。观察消融部位是否出现瞬时气泡，因为损伤通常会伴随气泡产生。使用适当的荧光滤光片观察蛹上皮，以确认激光诱导的损伤是否成功。 
	注意：务必避免激光束的意外暴露，因为激光反射可能造成严重的眼部或皮肤损伤。</li>
	<li>若损伤未成功，可调整焦平面（将显微镜焦点略高于或低于当前焦面），并再次单次触发消融。或者，逐步增加衰减滑片的激光功率，直至达到所需的伤口大小。</li>
	<li>如需改变消融激光脉冲重复频率，请使用后部控制面板上的重复频率旋钮（可将频率从每秒不足1个脉冲调节至60 Hz）。为获得最佳损伤效果，将脉冲重复频率设为 40 Hz。</li>
	<li>为产生不同大小的伤口，使用能量密度衰减滑片手动调节消融光的功率水平。</li>
	<li>避免对所有固定好的蛹进行损伤，保留这些未消融的蛹作为无损伤对照组。</li>
	<li>为确保结果一致性，应定期重新校准消融系统（参照相应操作手册），并清洁和更换控制激光输出波长的染料谐振池。</li>
</ol>
4. 体内时间序列共聚焦成像
<ol>
	<li>迅速将玻璃底培养皿转移至合适的显微镜，进行时间序列成像。 
	注意：为了获得最佳效果，应使用配备高灵敏度检测器的高规格共聚焦或转盘显微镜，能够同时检测 GFP 和 mCherry 荧光信号。</li>
	<li>要对整个蛹翅进行成像，请使用低倍率（例如 20倍物镜（20X）图 2A）。为了以高空间分辨率成像伤口修复及伴随的炎症反应，使用油浸 40X（NA 1.3）或 63X（NA 1.4）物镜（参见代表性图像于 图2B- D).</li>
	<li>打开与显微镜配套的图像采集软件。</li>
	<li>使用图像采集软件，开启相应的激光器 例如 使用488 nm和561 nm激光分别激发GFP和mCherry荧光团（通过点击相应选项框），并调整激光功率以及增益/偏移设置，以获得足够强的荧光信号，同时避免像素饱和；采用尽可能低的激光功率（范围为5%–20%），以最大限度减少光漂白和光毒性。</li>
	<li>为了同时捕捉修复中的上皮组织和炎症细胞的募集过程，将显微镜设置为使用控制面板上的精细调焦旋钮记录z轴层扫图像；为获得最佳效果，通过手动点击软件按钮，设置软件记录穿过蛹翅的z轴切片（每3 mm至少一次），从受伤上皮的顶部一直到底部的细胞外空间（含有迁移中的血细胞），以获得较大的z轴层扫范围（约50 -&#160;100 mm</li>
	<li>对于延时成像，在损伤后至少1小时内以固定时间间隔（最短每30秒）采集z轴层扫图像。 
	注意：z轴堆栈间选择的时间间隔需在捕捉快速变化的细胞动态与避免样品光漂白之间进行权衡。</li>
	<li>为同时成像多个蛹（包括未消融的无损伤对照组），请使用连接至显微镜的电动载物台以及成像软件中的多点采集功能。通过载物台位置调节旋钮，在软件中手动设定每只蛹的位置，并为每只蛹手动设置合适的z轴扫描范围（顶部和底部）。</li>
	<li>使用专业图像分析软件（如 ImageJ）在图像采集期间或之后可视化延时图像32) 使用 z 轴堆栈投影或三维重建。例如，用于追踪单个血细胞的运动（如 图 2C’ 以及 D’），使用开源的 ImageJ 插件“TrackMate”或“Manual Tracking”追踪血细胞核（方法发表于 33,34).</li>
	<li>使用光转换探针（如 Kaede）30) 在成像过程中选择性地光转化并标记部分上皮细胞或免疫细胞。
	<ol>
		<li>在成像软件中打开相应的模块以执行光转化（如FRAP，即光漂白后荧光恢复模块），并激活405 nm激光（通过点击软件中相应的选项框）35.</li>
		<li>使用 FRAP 软件中的方形、圆形或手绘选择工具，选取需要进行光转化的细胞。在 FRAP 软件中设置光转化的时间进程（漂白）设置为单次迭代/帧，并将405 nm激光功率设为20%。手动点击 开始实验 进行光转化。</li>
		<li>退出 FRAP 模块（点击 关闭）并返回软件中的原始成像界面；使用488 nm和561 nm激光，按照上述方法设置z轴扫描和延时成像，以观察光转化与非光转化细胞的行为。 
		注意：光转化探针在初始光转化后可保持稳定数小时，从而能够随时间追踪光转化细胞的行为（至少5小时）。例如，可选择性地对伤口处的炎症细胞进行光转化图2F）并追踪它们从损伤部位消退时的行为（图 2G 和 H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性利益冲突。

组织损伤引发的急性炎症反应是一个复杂且高度动态的过程，对于协调受损组织的修复至关重要，包括清除坏死碎片以及抵抗感染。为了充分理解并揭示该反应的基本特征，必须在三维活体样本上进行体内研究，以便准确追踪参与其中的各种细胞谱系随时间变化的精确行为与相互作用。对这些细胞动态进行实时分析，相较于使用传统免疫组织化学技术对固定样本进行静态单时间点观察，能够更详细地表征突变体表型。传统上，利用遗传操作便捷的Drosophila模型开展的大多数活体成像研究均采用果蝇胚胎期，因其相较于后期发育阶段具有更好的光学通透性和更低的运动性4,5。然而，近年来，我们课题组及其他研究团队已将Drosophila蛹期发展为一种新型模型，可用于在体内同时进行高分辨率、长时程的伤口修复与炎症反应成像8,22,23。这一新兴方法在解析炎症细胞行为的基本机制方面展现出广阔的应用前景，并可进一步拓展用于研究组织损伤后其他细胞谱系（如Drosophila脂肪细胞38）的动态行为。
在制备和成像受伤的 Drosophila 蛹过程中，存在多个关键因素将决定上述成像结果的质量。在所述方案中，最具挑战性的步骤可能是对蛹进行精细解剖并在损伤和成像前精确地定位。此发育阶段的蛹极为脆弱，在制备过程中即使发生轻微的意外损伤也会显著影响实验结果；任何可能遭受非故意损伤的蛹都必须从实验中剔除，因为此类损伤可能激活其自身的炎症反应，进而对蛹体内其他部位的免疫细胞行为产生更广泛（甚至系统性）的影响。由于本实验所用蛹正处于持续发育阶段（正在进行显著的组织重排以构建成体组织），在成像过程中偶尔会出现蛹的移动。然而，如果在封片时未将翅膀（或待成像的其他组织）最平坦的表面直接与盖玻片接触，蛹发生滚动的可能性会更高；使用正庚烷胶将蛹固定在盖玻片上可最大程度减少这种不良移动。因此，在将样品于不同显微镜之间转移时，也必须格外小心，避免使蛹脱离其精心对齐的位置；理想情况下，用于造成损伤的激光应连接至同一台显微镜，以便后续进行时间序列成像和光转化操作。
除了幼虫解剖和制片步骤的熟练程度外，所使用的精确基因型 果蝇 蛹的使用数量将对所获得成像数据的质量产生显著影响。例如，转基因拷贝数的多少 Gal4 驱动子和UAS构建体（例如 UAS-GFP 或 UAS-Kaede）在单个蛹期基因型中的拷贝数将决定后续成像过程中的信噪比。通常情况下，拷贝数越多，信号强度越高。 Gal4 或 UAS 构建体存在时，荧光蛋白的总水平越高（例如 组织内的GFP或Kaede）。然而，荧光蛋白的表达水平需谨慎平衡：既要足够提高组织荧光强度，以实现高质量成像（从而可使用较低激光功率，减少光漂白，并支持长时间成像），又要避免荧光蛋白过量表达引发的细胞毒性。每个实验中Gal4和UAS构建体的最佳数量将根据所使用的特定驱动子和荧光蛋白而有所不同。应小心控制蛹的培养温度为25 &#176;C（或更高，最高至29） &#176;C）因为 Gal4-UAS 系统具有温度敏感性，在较低温度下将失效31为了实现对组织或时间特异性的进一步精确控制 Gal4-由Gal4-UAS系统驱动的表达中，也可在蛹的基因型中引入该系统的抑制因子Gal8039Gal80 可用于在特定组织内（使用组织特异性 Gal80）或特定时间点（使用温度敏感型 Gal80）抑制 Gal4 活性。Gal4-UAS 系统还可与其他独立的二元系统（如 LexA-lexAop 和 QF-QUAS 系统）以生成 果蝇 具有多个构建体（例如 荧光蛋白、RNAi品系或其他遗传构建体）在多种不同组织中同时表达39.
使用这种新型的 Drosophila 蛹期模型相较于传统的胚胎模型具有多项优势。与15期胚胎（大多数胚胎损伤研究在此阶段进行）中仅能实现短期成像（最长3小时）相比，蛹期样本可进行显著更长时间的成像（理论上可持续至蛹发育96小时后的成虫阶段）。此外，蛹期组织中存在的血细胞（Drosophila 先天免疫细胞）数量远多于胚胎中的有限数量，这使得我们在使用相同数量的样本时，能够获取更为丰富的血细胞行为成像数据。尤为重要的是，这一点使我们能够应用更复杂的数学模型来分析血细胞行为，从而揭示伤口趋化因子和炎症反应中原本在实验上难以观测到的新特征23。蛹期模型的另一优势在于，RNAi介导的基因敲低效率显著高于早期胚胎阶段，从而可通过Gal4-UAS等二元系统更有效地分析组织或时间特异性的基因失活39。该阶段RNAi的高效性为进一步开展大规模（甚至无偏倚的全基因组范围）RNAi筛选提供了可能，以发现参与伤口修复或炎症细胞行为的新分子。
然而，Drosophila 蛹期显然不能用于研究由胚胎致死性基因突变所导致的表型；因此，对于在胚胎发育过程中发挥关键作用的基因，其功能研究和活体成像仍需在胚胎中进行，除非可通过时间特异性或组织特异性 RNAi 介导的基因敲低，使发育能够延续至蛹期。此外，胚胎仍是研究和活体成像某些免疫细胞行为特征的首选模型，包括免疫细胞从起源部位的发育性扩散、运动过程中的接触抑制，以及在发育过程中组织重塑阶段所产生的凋亡细胞 corpse 的吞噬作用5,8，这些现象在蛹期模型中尚未被观察到。尽管对 Drosophila 幼虫和成虫的研究已为伤口修复与炎症反应的潜在机制提供了重要见解40,41,42,43,44，但在这些阶段开展活体成像研究仍存在困难，主要由于样本本身具有高度活动性。虽然可通过麻醉幼虫以实现短暂的活体成像，但由于麻醉效果具有短暂性，仅能获取伤口修复或炎症反应过程中的短暂时相图像45。最近一项研究已开发出一种改进方案，可实现对幼虫伤口愈合的长期成像46，但其制备与成像过程仍远比胚胎或蛹期更具挑战性。从长远来看，我们预期通过针对不同科学问题选择最合适的发育阶段，对这四种 Drosophila 发育阶段——从胚胎期经幼虫期、蛹期至成虫期（各阶段均具有独特的优势与局限性）——开展的研究，将共同为驱动伤口修复与炎症反应的分子与细胞机制提供互补性的深入认识。
在未来，这种用于损伤及长期成像的方案 果蝇 蛹可轻松用于研究多种与炎症相关的现象，对于揭示伤口炎症反应的新特征具有广阔前景。长期成像结合光转化荧光蛋白（如Kaede）的应用，对于理解先天免疫细胞行为的动态过程具有重要价值，尤其是对目前了解甚少的伤口炎症消退阶段。通过特异性标记单个免疫细胞或其亚群（例如被招募至伤口的细胞），将能够分析免疫细胞在暴露于某一环境信号（如细胞残骸或损伤）后，对其后续接收到的另一信号所产生的反应。炎症行为的 果蝇 血细胞可因先前的经历而发生改变——例如，在发育过程中通过先前吞噬凋亡细胞碎片，它们会被致敏，从而对组织损伤产生更强的响应12 但尚不清楚其他环境信号是否也会诱导类似的启动事件。尽管目前对蛹期伤口的研究主要集中在先天性炎症反应，蛹期翅膀模型也为实时成像和解析上皮伤口修复的潜在机制提供了理想的机会。此外，这种蛹期成像方法还可被改造用于研究其他细胞谱系在组织损伤后的动态行为38，可在蛹翅本身或其他易于接近的蛹组织（如眼睛、腿部或胸部）中进行。最后，通过结合遗传操作的灵活性 果蝇 结合长期蛹期成像的便利性，通过应用无偏倚的全基因组敲低方法，有望发现新的上皮修复或炎症调控因子。

高效且有效的炎症反应对于任何生物体抵抗感染、清除碎片以及协调受损组织的修复都至关重要1。尽管这种反应是大多数组织损伤不可避免的结果，但炎症需要严格调控，因为不适当的炎症反应已与多种人类疾病相关（包括慢性难愈性伤口、过度瘢痕形成以及癌症易感性）1,2,3。鉴于其重要的临床意义，深入理解驱动炎症反应的分子与细胞机制至关重要，这有助于开发新的预后指标和治疗策略，以应对多种慢性炎症性疾病，从而保护修复中的组织免受长期且不必要的炎症损害。
近年来， 果蝇 已成为研究从昆虫到人类保守的炎症反应基本特征的一个成熟且有价值的模型系统4,5目前， 果蝇 相较于其他实验模型（如小鼠或斑马鱼），提供了远为优越的遗传可操作性，可实现精确的时空遗传操控 在体 （在特定发育时间点于特定细胞类型中失活或过表达任何目的基因）以及进行全基因组筛选的便捷性6,7. 传统上，大多数关于伤口愈合和炎症的活体成像研究均在 果蝇 在胚胎阶段已开展过相关实验，因为胚胎处于静止状态（不同于 果蝇 幼虫或成虫）且具有光学通透性，可实现无与伦比的高分辨率 在体 成像8这使得研究人员能够直观地观察到快速而强烈的细胞招募过程 果蝇 先天免疫细胞（血细胞）在胚胎上皮受到机械或激光诱导损伤后向伤口部位的募集9,10,11,12,13,14结合这些活体成像研究与遗传操作，对 果蝇 胚胎研究已揭示了许多控制炎症细胞行为的重要免疫细胞蛋白 在体例如，CED-1 同源物 Draper（一种含 ITAM 结构域的蛋白质）已被鉴定为一种重要的“损伤受体”，可介导招募过程 果蝇 免疫细胞在 H2O2依赖性地迁移至损伤部位15免疫细胞内的 Draper 水平反过来由钙离子诱导的 JNK 信号通路调控，并在吞噬凋亡细胞碎片后其表达水平升高12血细胞的运动还需要复杂的细胞骨架改变，以协调向伤口方向的定向迁移，这一过程依赖于细胞骨架调节因子（如肌动蛋白成束蛋白Fascin）的活性。16 以及Rho家族小GTP酶Rac和Rho9.
果蝇 是一种完全变态昆虫，在胚胎发育完成后，经历幼虫和蛹阶段，最终发育为成虫17。该 果蝇 蛹已被开发为一种额外的模型，用于无创活体成像多种动态细胞事件，包括发育过程中的细胞迁移18细胞分裂19细胞生长20，以及肌肉收缩21最近，它已被确立为研究伤口修复与炎症动态过程的一个新型模型。 在体22,23.
与胚胎阶段一样，Drosophila 蛹在从不透明的蛹壳中仔细解剖出来后，具有不动性和光学通透性18。利用这种光学透明特性，可以实时观察先天免疫细胞（血细胞）在 Drosophila 蛹组织（例如蛹翅）中对组织损伤的 体内 行为22。蛹翅是一种简单的双层结构，由两片大的扁平上皮层组成，其边缘相互连接；这两层上皮之间的细胞外空间充满血淋巴（昆虫血液）以及大量可移动的血细胞24。与胚胎中类似，机械性或激光诱导的翅上皮损伤会迅速引发血细胞向损伤部位的募集23。然而，与早期胚胎阶段相比，蛹期在成像方面具有一些明显优势：受伤的蛹可被长时间成像（至少5小时），可用于实验干预的组织区域更大（例如可制造多个伤口），且此阶段存在的血细胞数量显著更多（从而在数学分析中可提供来自更远距离的更多细胞轨迹，提高统计效力）。此外，RNAi介导的基因失活效率在蛹期显著提高，使得相较于胚胎中更传统的全突变体方法，能够在特定组织或特定时间“敲低”更多基因。
为了在这一新的蛹期模型中追踪伤口再上皮化过程及其伴随的炎症反应的动态变化，必须对两种不同的细胞群体进行标记：蛹期上皮细胞和先天免疫细胞（Drosophila 血细胞）。有多种不同的标记物（材料表）可用于标记这两个细胞群体——具体选择哪种标记物取决于所研究的特定过程。为标记蛹期上皮细胞，通常使用携带普遍表达的GFP标记的E-钙黏蛋白（可标记黏附连接）的 Drosophila 品系，以显示细胞边界的定位；或者 alternatively，使用GFP标记的Moesin蛋白的肌动蛋白结合结构域（可标记肌动蛋白细胞骨架），以观察伤口边缘的收缩性肌动蛋白环和前沿突起结构。为标记 Drosophila 血细胞，可使用血细胞特异性的 srp-Gal425 驱动核RFP表达（用于核追踪）、细胞质GFP或GFP标记的Moesin（分别用于标记细胞质或肌动蛋白细胞骨架），或使用光转换荧光蛋白（如Kaede）。事实上，联合使用多种免疫细胞标记物往往更具优势，可同时分析细胞核运动与细胞形态变化（参见代表性结果）。然而，由于本实验方案涉及使用 Drosophila 蛹，因此只能选用能够存活至蛹期中期的遗传标记组合。此外，胚胎致死品系将不适用。在成像对照（或野生型）蛹时，这通常不会成为问题，但在需要敲低或过表达特定基因以评估其对伤口闭合或炎症影响时，必须充分考虑这一限制。若基因敲低（或过表达）导致早期致死，可使用Gal80ts 构建体，以在发育后期诱导Gal4驱动的基因敲低（参见讨论部分）。
在我们最近的研究中，转入蛹期使我们能够收集到足够的免疫细胞轨迹数据，从而利用复杂的数学建模来分析炎症行为，进而推断出伤口炎症趋化信号的新细节23。例如，该方法揭示伤口趋化因子在炎症组织中扩散速度较慢，约为 200 μm2/min，这一速率远低于此前报道的小分子候选物质（如 ATP 或 H2O2）的扩散速度26,27,28,29；这些小分子“损伤”信号更可能起到许可性信号的作用。此外，通过追踪先天免疫细胞在远离初始伤口后的长期行为，并在不同时间点施加第二次损伤，我们发现了一个暂时性的“脱敏”阶段，在此期间免疫细胞对后续损伤无反应23。通过充分利用蛹期模型的长期成像潜力，结合 Drosophila 的遗传可操作性，可以利用光转化荧光蛋白30特异性地标记仅被招募至伤口部位的免疫细胞群体，并追踪这些特定免疫细胞群体在后续损伤刺激下的行为，而该荧光蛋白可特异性地在免疫细胞谱系中表达23。
本文描述了一种利用活体果蝇蛹在高时空分辨率下可视化伤口修复及其相关炎症反应动态过程的实验方案。 果蝇 蛹。我们提供了一套详细的方法，涵盖初始蛹体准备（解剖与封片）、后续激光介导的损伤以及延时成像所需的各个步骤。我们还描述了光转化荧光蛋白在特异性免疫细胞亚群标记中的应用 在体从长远来看，我们设想这一新方法 果蝇 蛹期模型将为解析组织损伤引发的炎症反应背后复杂的信号动态提供令人振奋的可能性。通过应用更复杂的统计分析方法，研究者可能揭示出那些原本在实验上难以观测到的反应特征，而更高的RNAi效率则有望推动在免疫细胞中开展全基因组范围的筛选应用。 在体 以鉴定调控免疫细胞行为的新因子。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;果蝇 &lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt;品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;泛素化表达的GFP标记E-钙黏蛋白&lt;br/&gt; ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)&lt;/em&gt;</td><td>京都品系中心，DGRC</td><td>#109007</td><td>Ubi-p63E 启动子序列驱动表达 &lt;em&gt;果蝇 &lt;/em&gt;E-cadherin（&lt;em&gt;霰弹枪&lt;/em&gt;C末端带有GFP标签。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;泛素化表达的GFP标记E-钙黏蛋白&lt;br/&gt; ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 印第安纳大学品系中心</td><td>#58742</td><td>Ubi-p63E 启动子序列驱动表达 &lt;em&gt;果蝇 &lt;/em&gt;E-cadherin（&lt;em&gt;霰弹枪&lt;/em&gt;C末端带有GFP标签。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;泛素表达的GFP标记Moesin&lt;br/&gt; P{sGMCA}3.1&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 印第安纳大学品系中心</td><td>#59023</td><td>广泛表达的 sqh 启动子/增强子驱动一段包含肌动蛋白结合序列的Moesin片段的表达，该片段与GFPS65T融合。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;血细胞特异性 serpent-Gal4 驱动子&lt;br/&gt; ；srp-Gal4；&lt;/em&gt;</td><td>由 Katja Bruckner 生成</td><td>由 Katja Bruckner 生成</td><td>Scer\GAL4 与 polyA 尾巴的融合表达由其上游两个基因组序列调控 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; serpent。参考文献：Br&amp;uuml;克内尔，K.，科克尔，L.，杜切克，P.，卢克，C.M.，R&amp;oslash;rth, P., Perrimon, N. PDGF/VEGF 受体调控果蝇血细胞的存活。Dev Cell. 7 (1), 73&amp;ndash;84，doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004)。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-核RFP&lt;br/&gt; w1118;;P{UAS-RedStinger}6&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 印第安纳大学品系中心</td><td>#8545 或 #8547</td><td>UAS 调控序列驱动 RFP 的 DsRed.T4 形式表达，该形式在 C 末端带有一个核定位信号标签</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-细胞质GFP&lt;br/&gt; ;;P{UAS-GFP.S65T}&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 印第安纳大学品系中心</td><td>多种品系可选（例如 #1522）</td><td>通过UAS调控序列表达GFP的S65T变体；该S65T变体具有增强的荧光亮度。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-光可转换Kaede&lt;br/&gt; w1118;; P{UAS-Kaede.A}3&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 印第安纳大学品系中心</td><td>#26161</td><td>Kaede蛋白在合成后发出明亮的绿色荧光，但在紫外光照射下可高效转变为明亮且稳定的红色荧光。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;GFP标记的spaghetti squash&lt;br/&gt; w1118;;P{sqh-GFP.RLC}&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 印第安纳大学品系中心</td><td>#57145</td><td>sqh 编码区在C末端带有 T:Avic\GFP 标签&lt;sup&gt;S65T&lt;/sup&gt; tag，在天然 sqh 启动子的调控下表达。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;果蝇食物培养基成分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>果蝇食物培养基的制备按照标准流程进行（参见 Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1–191 页）。</td></tr><tr><td>玉米</td><td>英国布里斯托尔Wild Oats公司（或同等供应商）</td><td>直接联系供应商</td><td>有机的</td></tr><tr><td>大豆粉</td><td>英国布里斯托尔Wild Oats公司（或同等供应商）</td><td>直接联系供应商</td><td>有机的</td></tr><tr><td>麦芽提取物</td><td>英国布里斯托尔Wild Oats公司（或同等供应商）</td><td>直接联系供应商</td><td>有机的</td></tr><tr><td>糖蜜</td><td>英国布里斯托尔Wild Oats公司（或同等供应商）</td><td>直接联系供应商</td><td>有机的</td></tr><tr><td>Difco 琼脂</td><td>BD Biosciences，Fisher Scientific</td><td>DF0142-15-2</td><td>果蝇食物的制备</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma</td><td>402907</td><td>果蝇食物的制备</td></tr><tr><td>尼帕金</td><td>Sigma</td><td>79721</td><td>果蝇食物制备</td></tr><tr><td>干酵母粉</td><td>Redstar，Dutscher Scientific，英国有限公司</td><td>Redstar，Dutscher Scientific，英国有限公司</td><td>果蝇食物的制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;样品制备与装片&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>七氟烷胶的制备</td></tr><tr><td>细毛松鼠毛画笔</td><td>Daler-Rowney（或同等品牌）</td><td>0 或 1</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>赛默飞世尔科技（或精细科学工具）</td><td>NC9404145</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>用于成像的玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>建议使用35 mm的培养皿，其微孔深度至少为10 mm，盖玻片厚度为0.085–0.13 mm，未包被。使用具有较大微孔的培养皿可在单次实验中固定并成像更多数量的蛹。</td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>Sigma</td><td>51730-5ML</td><td>用于制备庚烷胶</td></tr><tr><td>双面胶带（例如 Scotch）</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG263</td><td>用于制备庚烷胶</td></tr><tr><td>50 ml 离心管（用于庚烷胶）</td><td>Fisher Scientific 公司的 Falcon 管</td><td>14-432-22</td><td>用于制备庚烷胶</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4244</td><td>用于解剖 &lt;em&gt;果蝇 &lt;/em&gt;蛹</td></tr><tr><td>解剖立体显微镜，明场</td><td>徕卡（或同等产品）</td><td>M50</td><td>用于解剖 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 蛹</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>约翰·韦斯国际</td><td>103123</td><td>微型研究用剪刀（直型）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;激光消融与成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氮气消融激光</td><td>光谱物理（或 Andor 等效产品）</td><td>Model VSL-337ND-S</td><td>用于损伤实验时，应将其连接至宽场成像系统</td></tr><tr><td>多激光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>徕卡（或同等产品）</td><td>TCS AOBS SP8 或 SP5-II 激光共聚焦显微镜，连接至 Leica DMi8 倒置落射荧光显微镜（或同等设备）</td><td>理想情况下应包含用于多点及“镶嵌”扫描的电动载物台，以及 &amp;lsquo;杂交&amp;rsquo; GaAsP检测器（可显著提高灵敏度并增强弱信号）</td></tr><tr><td>环境培养箱</td><td>生命成像服务（或同等机构）</td><td>&quot;显微镜温度控制系统&quot;</td><td>连接共聚焦显微镜以在成像期间控制温度</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;图像分析软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FRAP 软件模块</td><td>徕卡（或同等产品）</td><td>共聚焦激光扫描显微镜 FRAP 软件模块</td><td>用于对Kaede等光可转换荧光蛋白进行光转换</td></tr><tr><td>ImageJ（图像分析软件）</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>施耐德, C.A., 拉斯班德, W.S., 埃利塞里, K.W. &quot;NIH Image 到 ImageJ：25 年的图像分析历程&quot;.《自然方法》9，671-675，2012。</td></tr><tr><td>ImageJ 插件 &quot;手动追踪&quot;</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>https://imagej.net/Manual_Tracking</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 插件 &quot;TrackMate&quot;</td><td>ImageJ，NIH</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td>Tinevez, JY.; Perry, N. &amp;amp; Schindelin, J. 等人（2016） &quot;TrackMate：一个开放且可扩展的单粒子追踪平台&quot;方法 115：80-90，PMID 27713081</td></tr><tr><td>Volocity（高性能三维成像软件）</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>IMARIS（图像分析软件）</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS 在细胞生物学研究中的应用</td><td>用于图像分析</td></tr></tbody></table>

长期 活体成像 炎症细胞动态的追踪 果蝇 蛹

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

在组织损伤引发的快速炎症反应过程中，先天免疫系统的细胞会迅速被募集到损伤部位。到达伤口后，先天免疫细胞执行多种重要功能，例如抵抗感染、清除坏死碎片以及促进基质沉积。为了全面理解调控该免疫反应的多样化信号事件，至关重要的是以高时空分辨率在活体中实时观察多种细胞谱系的复杂行为及其相互作用 在体内 并以高时空分辨率进行实时观察。果蝇胚胎的光学通透性和遗传可操作性 果蝇 胚胎已确立 果蝇 作为活体成像和解析炎症细胞行为基本特征的宝贵模型，包括发育过程中细胞扩散机制、凋亡细胞清除等过程&#160;和/或微生物病原体，以及向伤口的募集。然而，最近的研究现已表明，采用果蝇生命周期中更晚的阶段——果蝇蛹期——具有多项显著优势，包括更高的RNAi效率、更长的成像时间以及显著增多的免疫细胞数量。 果蝇 生命周期—— 果蝇 蛹——具有多项显著优势，包括更高的RNAi效率、更长的成像时间以及显著增多的免疫细胞数量。本文描述了一种在活体果蝇蛹中以高时空分辨率成像伤口修复及相关炎症反应的实验方案。 果蝇 蛹。为了追踪再上皮化和炎症的动态过程，我们使用了多种特异性的 在体 上皮和先天免疫细胞的荧光标记。我们还展示了光转换荧光蛋白（如Kaede）在追踪特定免疫细胞亚群行为中的有效性，以观察这些细胞向损伤部位迁移并最终从中消退的过程。

本方案描述了制备 果蝇 用于活体延时成像伤口修复与炎症的蛹 体内利用该方法，可轻松获得多组高分辨率的蛹期伤口闭合及炎症细胞募集的动态影像，并可在创伤后长时间（至少5小时）对蛹体进行成像观察，且光漂白现象不明显。
一种通用方案 果蝇 蛹期样本制备
图1 展示了制备的最佳方法 果蝇 蛹用于 体内 成像 果蝇 白色“预蛹”在蛹壳形成后0小时（APF）收集，此时爬行的幼虫停止运动，呈现典型的蛹体形态，其最前端可见外翻的呼吸附属结构（气门）。图1A）。将白色0小时蛹化前幼虫在25℃下继续培养18小时 25 °C，此时蛹壳已变为棕色（图1B）然后使用精细镊子和/或显微剪刀进行解剖（图1C，以去除保护性的蛹壳，从而暴露出内部光学透明的蛹图1D）。解剖后，蛹的翅膀将可见于蛹胸部的两侧（以蓝色标出， 图1C- D）。在此阶段，其他蛹体部分也清晰可辨，包括复眼、足和腹部（图中标注） 图1D）。腿部也适用于伤口炎症研究，可使用上述相同的激光方法造成伤口。可在成像培养皿中同时固定多个18小时APF的蛹（图1E，使用庚烷胶和浸水滤纸以减少脱水）使翅膀最平坦的部分（蓝色标出）与盖玻片接触图1F）；如果成像显微镜配备了电动载物台，则可以在单次成像期间记录多个蛹，这尤其具有优势。在解剖或制片过程中受损的任何蛹均应弃用（例如 序列中第三个蛹，箭头所示 图1E）。其他身体部位（例如 眼睛和腿部（以粉色标出）也可能接触到盖玻片，可用于损伤处理及后续成像（图1F）。对于研究单个伤口的实验，激光诱导的损伤通常最好施加在翅的中央部位（星号， 图1F），但如果需要研究多个伤口，则可使用其他部位。
无菌性损伤可激活强烈的炎症反应 果蝇 蛹翅
为了观察伤口修复及其伴随的炎症反应 体内 18h APF 时期受损的翅芽 果蝇 蛹使用共聚焦延时显微镜成像（图2A- H）。在此蛹期阶段，翅上皮为单层扁平的细胞（此处利用GFP标记的E-钙黏蛋白标记单个细胞边界，翅边缘以 图2A）。即使在未受伤的翅膀中（低倍镜， 图2A 和 2A'），大量迁移性的天然免疫细胞（血细胞，使用标记 srp-Gal4 驱动的细胞质GFP（绿色）和细胞核RFP（品红色）存在于占据细胞外间隙的血淋巴（昆虫血液）中图2A 和 2A'）。激光诱导蛹翅上皮损伤（伤口边缘以白色标出， 图 2B- D)可刺激血细胞快速迁移到伤口部位（图2B- D 以及免疫细胞核在 图2B-D）。用核标记物对血细胞进行标记（例如 细胞核RFP“red-stinger”）与细胞质或细胞骨架标记物联用（例如 细胞质中的GFP或GFP标记的Moesin）具有显著优势，因其可实现对血细胞核的同步追踪（用于血细胞行为的自动化分析） 例如 迁移速度和方向性）以及血细胞形态的可视化。后者尤为重要，因为它使我们能够判断血细胞是否正在吞噬坏死碎片（图 2C，插图）位于伤口边缘（或感染情况下的微生物）12,23 并使我们能够观察它们在迁移过程中向伤口方向或远离伤口方向移动时，其前沿伸出细长的丝状伪足或片状伪足的突出行为。
使用合适的图像分析软件（见材料表）32 对血细胞核轨迹进行简单追踪，可揭示炎症反应复杂的时空动态特征，这与此前报道的受损胚胎中的现象相似9,36（多色轨迹，图2C' 和 D'）。在损伤后仅30分钟内，靠近损伤部位的血细胞即开始向伤口定向迁移（图2C'）。然而，随着损伤后时间的延长，距离损伤部位更远的血细胞也逐渐启动向伤口的定向迁移（图2D'）。由此可观察到一种从伤口边缘向外扩散的免疫细胞响应“波”，我们推测这反映了伤口趋化因子从损伤部位向外扩散的过程。这类时空动态的免疫细胞行为为我们最近的研究提供了有益的起点，该研究采用了复杂的数学建模方法（“贝叶斯推断”）来推导伤口趋化信号的新特性（详细方法发表于23）。通过将计算模型（将伤口趋化梯度与血细胞迁移偏向性关联）与实际观察到的体内免疫细胞轨迹进行校准，可从血细胞轨迹数据中提取出伤口趋化信号的详细特征（如信号扩散速率、信号来源及信号产生持续时间）23。
此外，通过在免疫细胞谱系中驱动光转化荧光蛋白 Kaede 的表达， srp-Gal4 （绿色， 图2E）我们还能够选择性地标记这群迁移性翅成血细胞中的一个亚群（例如被招募到伤口部位的细胞；E，UV诱导光转化前；F，光转化后）。随后，我们可以随时间追踪这些成血细胞的行为（品红色， 图 2G- H）当它们从伤口部位迁移离开时（箭头， 图 2G 和 H）并比较它们的行为与未发生光转化且未到达损伤部位的细胞有何不同。我们已使用这种方法 体内 一种标记技术，用于证明被募集到初始伤口的血细胞在90分钟后对二次伤口暂时失去敏感性23，尽管这种差异标记技术未来还可能有许多其他富有洞察力的应用（参见讨论部分）。
利用这种方法，我们还可以同时追踪伤口修复或“再上皮化”的时空动态图2B- D）。此处普遍表达的GFP标记的E-钙黏蛋白标记了翅上皮中所有细胞的黏附连接，从而可以随时间追踪单个上皮细胞的形态变化。伤口边缘可轻易识别为完整GFP标记的上皮细胞与无标记碎片之间的交界处（白色虚线， 图2B- D）。对于大多数伤口，损伤后1小时内即开始重新上皮化，伤口边缘向内推进（图 2D）；这种尺寸的伤口通常在受伤后2 - 3小时内愈合23胚胎和蛹期的伤口闭合均由肌动蛋白-肌球蛋白收缩环及富含肌动蛋白的前沿丝状伪足共同驱动23,37；这些细胞骨架动态可通过适当的成像方法在伤口修复过程中直接观察 体内 报告基因，如GFP标记的Spaghetti squash（肌球蛋白调节轻链）或GFP标记的肌动蛋白结合蛋白Moesin23然而，对于某些特别大的伤口，肌动球蛋白环和前沿丝状伪足无法持续存在——这些伤口会变为“慢性”伤口，且无法完全重新上皮化。23 即使经过更长时间（超过 24 小时）的 体内 成像。有趣的是，这些难愈合伤口相关的炎症反应与正常急性伤口的炎症反应存在显著差异23 表明异常的免疫细胞行为可能在临床上可作为有用的预后标志物。未来，将进一步 体内 利用蛹模型进行长期成像（超过24小时）分析慢性伤口，可能为这一致衰性病症提供重要的机制性见解。
<img alt="昆虫蛹壳解剖过程，从解剖前到解剖后的各个阶段，蛹体排列整齐以供成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 果蝇 蛹体用于损伤处理与活体成像的制备 (A) 果蝇 在0小时成蛹前（APF）采集的白色预蛹，其前端由外翻的呼吸附属结构（气门）指示。B) 将白色0 h APF的预蛹在 25 °C，蛹壳呈棕色。解剖应从前端最突出的区域（箭头所示）开始，该区域因气门外翻而无真正的蛹体，使用精细镊子和/或显微剪小心去除保护性的蛹壳C）。蛹的翅膀将可见于蛹胸部的侧面（蓝色轮廓）。(D18小时龄蛹的蛹壳已完全去除，此处的蛹已被滚动 90° 显示侧面，其中待成像的翅以蓝色标出。E-F) 使用正庚烷胶水将五只18小时蛹龄的果蝇蛹固定于成像培养皿内的玻璃盖玻片上，并放置浸水滤纸以减少脱水E）。序列中第三个蛹（箭头所示）应在制备过程中因受损而弃用。将蛹的翅膀最平坦部分（蓝色标出）与盖玻片接触进行封片。F）并在翅中央产生激光诱导的伤口（星号， F），但若需研究多个伤口，则可选用其他部位。（D）经 Weavers 许可改编 等人， 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇伤口愈合中的细胞迁移延时成像；荧光显微镜；GFP/RFP示踪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：对组织损伤引发的炎症反应进行动态 体内 分析。 将从保护性蛹壳中解剖出的蛹固定在玻璃盖玻片上（A），对其进行创伤处理，并随后利用共聚焦延时显微镜成像（B–H）。未受伤的蛹翅低倍视野图像（A，白色轮廓标示翅缘），其中含有大量迁移性血细胞（A'）。通过激光诱导蛹翅上皮损伤（B–D，使用GFP标记的Drosophila E-钙黏蛋白标记细胞边界；白色轮廓标示伤口边缘），可激活快速的炎症反应，多个血细胞（由srp-Gal4驱动表达核定位RFP，品红色，以及胞质GFP，绿色）向伤口部位迁移（B–D；图像来自一段延时录像的代表性帧，每帧为25层、每层3 μm厚的投影图像）。对血细胞运动轨迹的人工追踪（多色轨迹，C' 和 D'）揭示了炎症反应复杂的时空动态特征，这与此前报道的受伤胚胎中的现象相似。血细胞还在伤口部位吞噬坏死的细胞碎片（箭头，C，以及插图）。在免疫细胞谱系中表达光转换荧光蛋白Kaede（绿色，E，使用srp-Gal4）可使被招募至伤口的血细胞（箭头，E）被特异性地标记为品红色（F），并可在其从损伤部位消退的过程中进行长期追踪（箭头，G 和 H）。所使用的蛹基因型如下：（A–D）w1118;ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4&gt;UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) 和 （E–H）w1118;srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III)。图片经Weavers et al., 201623许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种在高时空分辨率下对活体样本进行伤口修复及伴随的炎症反应实时成像的实验方案 在体该方法利用果蝇的蛹期阶段 果蝇 发育阶段适用于长期成像和随时间追踪特定细胞群体，并可与高效的RNAi介导的基因失活技术兼容。

在组织损伤引发的快速炎症反应过程中，先天免疫系统的细胞会迅速被募集至损伤部位。到达伤口后，这些先天免疫细胞执行多种重要功能，例如抵抗感染、清除坏死碎片以及促进基质沉积。为了全面理解调控该免疫反应的多样化信号事件，至关重要的是以高时空分辨率在活体中实时观察多种细胞谱系的复杂行为及其相互作用。果蝇胚胎具有光学通透性和易于进行遗传操作的特性，使其成为活体成像并解析炎症细胞行为基本机制的宝贵模型，这些机制包括发育过程中的细胞扩散、凋亡细胞或微生物病原体的清除，以及向伤口的募集过程。然而，近期研究发现，在果蝇生命周期中更晚的阶段——果蝇蛹期——进行研究具有多项显著优势，包括更高的RNA干扰效率、更长的成像时间以及数量显著增多的免疫细胞。本文介绍了一种在活体果蝇蛹中以高时空分辨率对伤口修复及相关炎症反应进行成像的实验方案。为了同时追踪再上皮化和炎症的动态过程，我们使用了多种特异性的活体荧光标记物，分别标记上皮组织和先天免疫细胞。此外，我们还展示了光转化荧光蛋白（如Kaede）在追踪特定免疫细胞亚群行为中的有效性，可用于观察这些细胞向损伤部位迁移以及随后从损伤部位消退的全过程。

通过利用这一新型蛹期模型的长期成像潜力以及黑腹果蝇（Drosophila）的遗传可操作性，该方法有助于解答伤口愈合与先天免疫领域中的关键科学问题。相较于传统的黑腹果蝇伤口愈合模型，蛹期在活体成像方面具有一些显著优势。例如，蛹期可实现更长时间的连续成像，可用于实验操作的组织区域更大，且此阶段存在更丰富的血细胞（hemocytes）。此外，RNAi介导的基因失活效率在这些蛹期阶段显著提高，使得许多基因能够在特定组织或特定时间被敲低。为准备蛹的收集，使用20只未交配雌蝇和20只雄蝇设置培养管。然后在成像前18小时，从培养管中收集至少10只新形成的白色未成熟蛹。使用镊子或细毛刷将蛹从培养瓶内壁上轻轻剥离，并小心转移至新的果蝇培养瓶侧面。待蛹发育至所需时间点后，将其转移至固定在载玻片上的双面胶带上。随后在明场解剖显微镜下，小心地将蛹从其外壳中取出。将蛹放置在胶带上，使其腹面牢固地粘附于胶带上。使用镊子在蛹壳最前端区域进行第一处切口。确保该区域的蛹壳内部为空腔且无蛹体组织，因为在早期蛹发育过程中，蛹体会在蛹壳内收缩。接下来，使用镊子或显微剪刀沿从头端到尾端的方向小心地撕开或剪开蛹壳，直至蛹体完全脱离棕色、不透明且易碎的外壳。请注意，这些蛹非常脆弱。在此步骤中，必须确保镊子和显微剪刀不会刺破蛹的表面。在移除外层蛹壳时，尽量避免触碰蛹体本身。现在使用庚烷胶将完好的蛹固定在玻璃底培养皿中。首先，取10微升预配的庚烷胶，滴加成一条细线。干燥五秒后，使用镊子小心地将解剖好的蛹转移到胶水上。初学时可排列五只蛹，随着经验积累可增加制备数量。使用镊子轻轻滚动蛹体，将其固定，使翅膀平贴于盖玻片上，并确保大部分翅面与盖玻片直接接触。最后，为防止脱水，在玻璃底培养皿的一侧放置一片浸有蒸馏水的吸水滤纸。然后盖上培养皿，进行激光诱导损伤操作。将固定好的蛹转移至配备可调谐激光消融系统的宽场显微镜上。使用相应的染料池将脉冲式紫外风冷氮泵浦消融激光器调节至所需波长。为获得最佳损伤效果，将脉冲重复频率设置为 40 赫兹。现在使用40倍或63倍物镜和明场调节显微镜载物台控制装置，以定位第一只待损伤果蝇蛹的翅。聚焦于最靠近玻璃盖玻片的蛹翅上皮平面。将待损伤区域与已知的消融激光靶区对齐。为此，请利用显微镜目镜内的十字准线标记。随后通过调节显微镜中能量密度衰减器滑片来调整激光功率。利用定位卡扣以确保设置可重复。现在，通过快速点击手动控制来激活消融激光以制造伤口。随后检查消融部位是否出现短暂的气泡，这是损伤时的正常现象。如果损伤不成功，可尝试调整焦平面。或者，通过调节衰减器滑块逐步增加激光功率，直至达到所需伤口大小。对蛹的翅缘造成伤口后，迅速将玻璃底培养皿转移至合适的显微镜下进行延时成像，然后打开相应的图像采集软件。在软件中打开相应的激光器，并调整其功率以及增益/偏移，以获得足够强的荧光信号，同时避免像素饱和。通常，为尽量减少光漂白，激光功率在5%至20%范围内尽可能低时效果最佳。使用低倍镜对整个蛹翅进行聚焦，或使用高倍镜对伤口部位进行聚焦，以观察伤口修复过程。为了同时捕捉正在修复的上皮组织和炎症细胞的募集过程，首先在控制面板上使用微调焦旋钮，将显微镜设置为记录z轴层扫图像。从受损的上皮组织开始扫描，穿透至下方含有迁移血细胞的细胞外空间。接下来，设置软件以每3微米或更小的间隔对蛹翅进行z轴切片记录。进行延时成像时，至少每30秒记录一次z轴堆栈图像，持续至少一小时。当使用光可转换探针在成像过程中选择性地光转换并标记部分细胞时，需在成像软件中打开相应的模块以执行光转换，并激活405纳米激光。然后，在FRAP软件中使用选择工具圈选需要进行光转换的细胞。接下来，将光转化的时间过程设置为单次迭代帧，并将405纳米激光的激光功率设为20%。然后点击“开始实验”以执行光转化。完成后，退出FRAP模块并返回原始成像界面。将激光调整至所用荧光染料的激发波长，利用延时成像记录光转化与非光转化细胞。采用共聚焦延时显微镜对蛹形成后18小时的黑腹果蝇蛹翅膀伤口进行成像。激光诱导的蛹翅上皮损伤可引发果蝇天然免疫细胞（称为血细胞）迅速迁移至伤口部位。血细胞同时用核标记物和细胞质或细胞骨架标记物进行标记，以便分别追踪其轨迹并观察其形态。追踪血细胞核的运动轨迹可揭示炎症反应复杂的时空动态。在损伤发生30分钟内，位于损伤部位附近的血细胞已开始向伤口进行定向迁移。最终，距离损伤部位越来越远的血细胞开始向伤口迁移。通过利用光可转换荧光蛋白Kaede，可选择性地标记这些迁移性翅血细胞的亚群。该方法已被用于证明，被招募至初始伤口的血细胞在90分钟后对第二次产生的伤口暂时失去反应能力。通过用GFP标记细胞黏附连接中的E-钙黏蛋白，可清晰识别伤口边缘，从而便于分析伤口愈合的动态过程。大多数伤口在受伤后一小时内开始再上皮化，伤口边缘向内推进，最终在三小时内完成愈合。掌握该技术后，可在短短 10 分钟内制备多个蛹用于活体成像；但在操作过程中需注意，一旦从蛹壳中解剖出来，黑腹果蝇（Drosophila）蛹极易受到损伤和脱水。该技术发展后，为先天免疫领域的研究人员与计算生物学家合作铺平了道路，使他们能够应用更复杂的数学建模方法，深入探究负责炎症细胞募集的伤口趋化信号的行为规律。更近的研究中，其他类型的细胞也被标记，以追踪其对激光诱导损伤的反应，结果发现脂肪细胞（即黑腹果蝇的脂肪体细胞）在此系统中同样会对伤口产生响应。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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