Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

通过利用这种新蛹模型的长期成像潜力以及果蝇的遗传可处理性，这种方法可以帮助我们回答伤口愈合和先天免疫领域的关键问题。与更传统的果蝇伤口愈合模型相比，蛹阶段为实时成像提供了一些明显的优势。例如，蛹可以在更长的时间内成像，更多的组织区域可用于实验作，并且在这个阶段存在更多的血细胞。

此外，在这些蛹阶段，RNAi 介导的基因失活的效率大大提高，允许以组织或时间特异性方式敲低许多基因。要设置蛹收集，请设置具有 20 个处女雌性和 20 个雄性的小瓶。然后在成像前 18 小时从小瓶中收集至少 10 个新形成的白色前蛹。

要收集蛹，请使用镊子或细漆刷将其从小瓶内部表面移出，然后小心地将其转移到新苍蝇小瓶的侧面。蛹发育到所需的时间点后，将它们转移到安装在载玻片上的一块双面胶带上。现在在明场解剖显微镜下，小心地从它们的外壳中取出蛹。

放置蛹，使它们的腹侧牢牢地粘在胶带上。使用镊子在蛹的最前部区域做第一个切口。确保该区域的蛹壳是空心的并且没有蛹组织，因为在蛹的早期发育过程中，蛹会在壳内收缩。

接下来，用镊子或微型剪刀小心地从前后撕开或切开蛹壳，直到蛹完全摆脱棕色不透明脆壳。小心这些蛹非常脆弱。现在至关重要的是，在此步骤中，镊子和微型剪刀不会刺穿蛹表面。

取下周围的外壳时，尽量避免触摸蛹本身。现在用庚烷胶将未损坏的蛹安装在玻璃底培养皿中。首先从 10 微升等分试样中存入一行准备好的庚烷胶。

然后，在干燥 5 秒后，用镊子小心地将解剖的蛹转移到胶水上。学习时，最多排列五个蛹。根据获得的经验，可以准备更多。

用镊子滚动蛹以安装蛹，使翅膀平放在盖玻片上，大部分翅膀表面与盖玻片直接接触。最后，为防止脱水，在玻璃底皿的侧面添加一张浸泡在蒸馏水中的吸收性滤纸。然后盖上培养皿并继续进行激光诱导受伤程序。

将已安装的蛹转移到配备有可调谐激光消融系统的宽视野显微镜中。使用适当的染料池将脉冲紫外风冷氮泵烧蚀激光器调谐到所需的波长。为了获得最佳伤害效果，请将脉冲重复频率设置为 40 赫兹。

现在使用 40 倍或 63 倍物镜和明场调整显微镜载物台控制，以定位第一个要受伤的蛹的蛹翼。聚焦于最靠近玻璃盖玻片的蛹翼上皮平面。将要受伤的区域与消融激光的已知目标区域对齐。

为此，请利用显微镜目镜内的十字准线标记。接下来，通过调整显微镜中的能量密度衰减器滑块来调整激光的功率。利用咔嗒声停止点使设置可重现。

现在要制作伤口，只需快速单击手动控制即可激活消融激光。然后检查消融部位是否有瞬时气泡，这与受伤是正常的。如果受伤不成功，请尝试改变焦平面。

或者，使用衰减器载玻片逐渐增加激光功率，直到达到所需的伤口大小。伤及蛹翅边缘后，迅速将玻璃底培养皿转移到合适的显微镜上进行延时成像。然后打开相应的图像捕获软件。

在软件中打开适当的激光器并调整它们的功率和增益/偏移，以获得足够的荧光信号而不会出现像素饱和。通常，在 5% 到 20% 的范围内，尽可能低的激光功率最能最大限度地减少光漂白。在低倍率下关注整个蛹翼，或在高倍率下关注伤口以研究伤口修复。

为了捕获修复上皮细胞和炎性细胞募集，首先使用控制面板上的微调将显微镜设置为记录 z 堆栈。从受伤的上皮扫描到包含迁移血细胞的下方细胞外空间。接下来，将软件设置为每 3 微米或以更紧密的间隔记录穿过蛹翼的 z 切片。

对于延时成像，至少每 30 秒记录一次 z 堆栈，持续至少 1 小时。在成像过程中使用光转换探针选择性地进行光转换和标记细胞子集时，请在成像软件中打开相应的模块以执行光转换并激活 405 纳米激光器。然后使用选择工具在 FRAP 软件中选择要进行照片转换的单元格。

接下来，将光转换的时间进程设置为单个迭代帧，并将 405 纳米激光器设置为 20% 激光功率。然后点击 开始实验 执行照片转换。完成后，退出 FRAP 模块并返回原始成像屏幕。

在那里，将激光器调谐到正在使用的荧光团，并使用延时记录对光转换和非光转换的细胞进行成像。使用共聚焦延时显微镜对果蝇蛹形成后 18 小时受伤的翅膀进行成像。激光诱导的蛹翼上皮损伤刺激了果蝇先天免疫细胞（称为血细胞）向伤口部位的快速迁移。

用细胞核标记物和细胞质或细胞骨架标记物标记血细胞，以便分别跟踪和查看其形态。追踪血细胞核轨迹证明了炎症反应的复杂时空动力学。在受伤后 30 分钟内，位于最靠近受伤部位的血细胞开始定向向伤口迁移。

最终，逐渐远离损伤的血细胞开始向伤口迁移。通过利用光转化荧光团，这些迁移翼血细胞的 Kaede 亚群被选择性标记。这种方法已被用于表明募集到初始伤口的血细胞对 90 分钟后产生的第二个伤口暂时脱敏。

通过用 GFP 标记细胞粘附连接内的 E-钙粘蛋白，伤口边缘很容易识别，这允许分析伤口愈合动力学。大多数伤口在受伤后一小时内开始重新上皮化。伤口边缘向内推进，伤口最终在 3 小时内愈合。

一旦掌握了这项技术，就可以在短短 10 分钟内准备好多个蛹进行实时成像，但在尝试此过程时，重要的是要记住，一旦从蛹壳中解剖出来，果蝇蛹极易受到损伤和脱水。开发后，这项技术为先天免疫领域的研究人员与计算生物学家合作铺平了道路，并应用更复杂的数学模型来探索负责炎症细胞募集的伤口引诱信号的行为。甚至最近，替代细胞类型也被标记以跟踪它们对激光诱导损伤的反应，这揭示了脂肪细胞，果蝇脂肪体细胞，也对该系统内的伤口有反应。