长期 活体成像 炎症细胞动态的追踪 果蝇 蛹

通过利用这一新型蛹期模型的长期成像潜力以及黑腹果蝇（Drosophila）的遗传可操作性，该方法有助于解答伤口愈合与先天免疫领域中的关键科学问题。相较于传统的黑腹果蝇伤口愈合模型，蛹期在活体成像方面具有一些显著优势。例如，蛹期可实现更长时间的连续成像，可用于实验操作的组织区域更大，且此阶段存在更丰富的血细胞（hemocytes）。

此外，RNAi介导的基因失活效率在这些蛹期阶段显著提高，使得许多基因能够在特定组织或特定时间被敲低。为准备蛹的收集，使用20只未交配雌蝇和20只雄蝇设置培养管。然后在成像前18小时，从培养管中收集至少10只新形成的白色未成熟蛹。

使用镊子或细毛刷将蛹从培养瓶内壁上轻轻剥离，并小心转移至新的果蝇培养瓶侧面。待蛹发育至所需时间点后，将其转移至固定在载玻片上的双面胶带上。随后在明场解剖显微镜下，小心地将蛹从其外壳中取出。

将蛹放置在胶带上，使其腹面牢固地粘附于胶带上。使用镊子在蛹壳最前端区域进行第一处切口。确保该区域的蛹壳内部为空腔且无蛹体组织，因为在早期蛹发育过程中，蛹体会在蛹壳内收缩。

接下来，使用镊子或显微剪刀沿从头端到尾端的方向小心地撕开或剪开蛹壳，直至蛹体完全脱离棕色、不透明且易碎的外壳。请注意，这些蛹非常脆弱。在此步骤中，必须确保镊子和显微剪刀不会刺破蛹的表面。

在移除外层蛹壳时，尽量避免触碰蛹体本身。现在使用庚烷胶将完好的蛹固定在玻璃底培养皿中。首先，取10微升预配的庚烷胶，滴加成一条细线。

干燥五秒后，使用镊子小心地将解剖好的蛹转移到胶水上。初学时可排列五只蛹，随着经验积累可增加制备数量。

使用镊子轻轻滚动蛹体，将其固定，使翅膀平贴于盖玻片上，并确保大部分翅面与盖玻片直接接触。最后，为防止脱水，在玻璃底培养皿的一侧放置一片浸有蒸馏水的吸水滤纸。然后盖上培养皿，进行激光诱导损伤操作。

将固定好的蛹转移至配备可调谐激光消融系统的宽场显微镜上。使用相应的染料池将脉冲式紫外风冷氮泵浦消融激光器调节至所需波长。为获得最佳损伤效果，将脉冲重复频率设置为 40 赫兹。

现在使用40倍或63倍物镜和明场调节显微镜载物台控制装置，以定位第一只待损伤果蝇蛹的翅。聚焦于最靠近玻璃盖玻片的蛹翅上皮平面。将待损伤区域与已知的消融激光靶区对齐。

为此，请利用显微镜目镜内的十字准线标记。随后通过调节显微镜中能量密度衰减器滑片来调整激光功率。利用定位卡扣以确保设置可重复。

现在，通过快速点击手动控制来激活消融激光以制造伤口。随后检查消融部位是否出现短暂的气泡，这是损伤时的正常现象。如果损伤不成功，可尝试调整焦平面。

或者，通过调节衰减器滑块逐步增加激光功率，直至达到所需伤口大小。对蛹的翅缘造成伤口后，迅速将玻璃底培养皿转移至合适的显微镜下进行延时成像，然后打开相应的图像采集软件。

在软件中打开相应的激光器，并调整其功率以及增益/偏移，以获得足够强的荧光信号，同时避免像素饱和。通常，为尽量减少光漂白，激光功率在5%至20%范围内尽可能低时效果最佳。使用低倍镜对整个蛹翅进行聚焦，或使用高倍镜对伤口部位进行聚焦，以观察伤口修复过程。

为了同时捕捉正在修复的上皮组织和炎症细胞的募集过程，首先在控制面板上使用微调焦旋钮，将显微镜设置为记录z轴层扫图像。从受损的上皮组织开始扫描，穿透至下方含有迁移血细胞的细胞外空间。接下来，设置软件以每3微米或更小的间隔对蛹翅进行z轴切片记录。

进行延时成像时，至少每30秒记录一次z轴堆栈图像，持续至少一小时。当使用光可转换探针在成像过程中选择性地光转换并标记部分细胞时，需在成像软件中打开相应的模块以执行光转换，并激活405纳米激光。然后，在FRAP软件中使用选择工具圈选需要进行光转换的细胞。

接下来，将光转化的时间过程设置为单次迭代帧，并将405纳米激光的激光功率设为20%。然后点击“开始实验”以执行光转化。完成后，退出FRAP模块并返回原始成像界面。

将激光调整至所用荧光染料的激发波长，利用延时成像记录光转化与非光转化细胞。采用共聚焦延时显微镜对蛹形成后18小时的黑腹果蝇蛹翅膀伤口进行成像。激光诱导的蛹翅上皮损伤可引发果蝇天然免疫细胞（称为血细胞）迅速迁移至伤口部位。

血细胞同时用核标记物和细胞质或细胞骨架标记物进行标记，以便分别追踪其轨迹并观察其形态。追踪血细胞核的运动轨迹可揭示炎症反应复杂的时空动态。在损伤发生30分钟内，位于损伤部位附近的血细胞已开始向伤口进行定向迁移。

最终，距离损伤部位越来越远的血细胞开始向伤口迁移。通过利用光可转换荧光蛋白Kaede，可选择性地标记这些迁移性翅血细胞的亚群。该方法已被用于证明，被招募至初始伤口的血细胞在90分钟后对第二次产生的伤口暂时失去反应能力。

通过用GFP标记细胞黏附连接中的E-钙黏蛋白，可清晰识别伤口边缘，从而便于分析伤口愈合的动态过程。大多数伤口在受伤后一小时内开始再上皮化，伤口边缘向内推进，最终在三小时内完成愈合。

掌握该技术后，可在短短 10 分钟内制备多个蛹用于活体成像；但在操作过程中需注意，一旦从蛹壳中解剖出来，黑腹果蝇（Drosophila）蛹极易受到损伤和脱水。该技术发展后，为先天免疫领域的研究人员与计算生物学家合作铺平了道路，使他们能够应用更复杂的数学建模方法，深入探究负责炎症细胞募集的伤口趋化信号的行为规律。更近的研究中，其他类型的细胞也被标记，以追踪其对激光诱导损伤的反应，结果发现脂肪细胞（即黑腹果蝇的脂肪体细胞）在此系统中同样会对伤口产生响应。