斑马鱼原代细胞的培养与转染

该方法为斑马鱼群落提供了一种分析细胞间动力学的工具，其分辨率在体内无法达到。而且它还允许补偿斑马鱼细胞系的缺乏。该技术的主要优点是您可以直接从原始组织中分离和转染这些原代细胞，因此无需保留细胞系。

要开始该方案，请在受精后两天准备斑马鱼胚胎，或 dpf。第一天，建立了几个所选斑马鱼品系的杂交点。第二天与鱼交配，并在产卵后立即收集在 10 厘米塑料培养皿中。

用塑料巴斯德移液管去除死蛋和受污染的鸡蛋。用 30% 和 0.0001% 重量的 Danieau 亚甲蓝洗蛋一次。然后用不含亚甲蓝的 30% 新鲜 Danieau 替换培养基，并在 28 摄氏度下孵育鸡蛋过夜。

第三天，取出死亡和受污染的胚胎，将培养基交换为 Danieau 30%，然后将胚胎在 28 摄氏度下孵育过夜。第 4 天，通过去除培养基来去除绒毛膜，直到培养皿中剩余约 10 毫升。每毫升链霉蛋白酶加入 1 毫升 1 毫克，并在室温下在摇床上孵育胚胎约 30 分钟，直到所有绒毛膜分离。

硅脂涂抹在盘底底部的孔周围，并使用硅脂作为胶水贴上盖玻片。确保油脂密封了培养皿底部和盖玻片之间的间隙。用冷自来水和肥皂彻底但小心地清洗玻璃底餐具。

用去离子水冲洗玻璃底皿 3 次以去除肥皂。然后将盘盖和盘底风干，并存放在干净的盒子中以备进一步使用。在培养物制备当天，用 70% 乙醇润湿两个培养皿盖和培养皿底部的内部。

将培养皿盖和培养皿底部朝内，置于具有层流和紫外线的无菌工作台中。将餐具风干至乙醇蒸发，然后用紫外线照射 20 分钟。在此处理之后，将菜肴组装并消毒。

为了涂覆培养皿，在每个玻璃底培养皿的中间吸取 200 微升 0.1 毫克/毫升的聚-L-赖氨酸，并通过用移液器吸头打破表面张力，将液体涂抹在盖玻片上。然后在室温下在工作台下孵育培养皿 60 分钟。孵育后，用无菌的 1x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤一次，然后除去液体。

将盘子放在长凳下，直到进一步使用。在培养物制备当天的第四天，用新鲜的塑料巴斯德移液管将胚胎转移到无菌细胞培养皿中。逐步去除液体，直到所有胚胎聚集在一个直径约为 2 厘米或更小的大液滴中。

将装有胚胎的培养皿放在无菌工作台中，加入不依赖二氧化碳的培养基，直到培养皿装满一半。要去除蛋黄，请使用 200 微升移液器吸头上下移液胚胎。成功的除臭可以通过介质的浑浊来识别。

接下来，用 70% 乙醇填充一个细胞培养皿，用新鲜的细胞培养基填充另一个细胞培养皿。使用切下的 1000 μL 移液器吸头将胚胎转移到带手柄的无菌 40 μm 细胞过滤器中。握住过滤器的手柄，将其浸入装有乙醇的培养皿中，使所有胚胎浸入水中 5 秒钟。

乙醇处理后，立即将装有胚胎的过滤器浸入装有新鲜细胞培养基的培养皿中。然后将胚胎转移到无菌的 1.5 毫升反应管中。将 2 型胶原酶添加到胚胎中。

在垂直管旋转器上孵育试管。通过使用 1000 微升移液器吸头上下移液混合物来解离剩余的细胞团块。然后通过带有通气槽的无菌细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 锥形管中。

用 10 ml 新鲜细胞培养基冲洗过滤器。将细胞以 180 倍 g 离心 3 分钟。离心后，仔细检查颗粒形成。

之后，去除上清液，并将细胞重悬于每 30 个最初使用的胚胎中 200 微升新鲜细胞培养基中。然后，将 200 μL 细胞悬液直接移液到准备好的聚-L-赖氨酸涂层玻璃底皿的玻璃区域，让细胞附着 60 分钟。加入 6 mL 新鲜细胞培养基，并在 28 摄氏度下孵育原代细胞。

然后使用 28 摄氏度的倒置显微镜执行所需的成像应用。确定计数室中的细胞数。然后在 1.5 mL反应管中，将 10 μg 超纯质粒 DNA 与 50 万个细胞混合，并在需要时用无菌 PBS 将总体积调节至 100 μL。

穿孔前，将溶液彻底重悬 20 秒。接下来，立即将细胞 DNA 混合物转移到电穿孔比色皿中，将比色皿放入电穿孔装置中并电穿孔样品。电穿孔后，立即将细胞 DNA 混合物转移到装有 300 μL 新鲜细胞培养基的 1.5 mL 反应管中。

最后，如前几节所述，接种 200 微升细胞悬液。使用本视频中的方法，对编码荧光细胞器标志物（如内质网靶向的红色荧光蛋白或线粒体靶向的黄色荧光蛋白）的 pCS2 阳性质粒的转染进行了非常详细的可视化。通过共转染融合蛋白 MitoTag-YFP 与微管标志物人双皮质素融合至红色荧光蛋白 tdTomato 和核标志物组蛋白 H2B 与青色荧光蛋白融合进行同步分析。

从囊泡运动的延时摄影中选择的图像，对膜标志物囊泡相关膜蛋白 One 与荧光蛋白 mCitrine 融合，可提供高时间和空间分辨率。通过表达明亮的荧光蛋白来标记整个细胞，可以很容易地观察到随时间推移的形态变化。他们的电穿孔方案也适用于组合遗传学。

解离技术和基本培养条件也应用于野生型斑马鱼的成年脑组织，并显示最初碎片包被的培养物逐渐发展为复杂的神经元样网络。由于许多人类疾病斑马鱼模型和组织特异性报告基因系的可用性，我们的方法可用于描述强调生物发生的细胞内机制，重点关注特定细胞类型和发育阶段。