Name: 斑马鱼原代细胞的培养与转染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学习从斑马鱼胚胎和成体脑组织分离原代细胞并进行转染的技术，实现高分辨率活细胞成像。该方法为研究细胞间动态提供了可靠工具，弥补了现有细胞系不足。

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感谢 T. Fritsch、A. Wolf-Asseburg、I. Linde 和 S.-M. Tokarski 在动物饲养和技术支持方面的出色工作。我们衷心感谢 Köster 实验室所有成员给予的深入而有益的讨论。本研究得到德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号 KO 1949/5-1）和下萨克森州政府 Niedersächsisches Vorab（项目编号 VWZN2889）的资助，特此致谢。

本文所述所有动物实验均符合相关法律法规（欧盟指令2010/63）。鱼类的饲养与操作已获得当地主管部门、布伦瑞克工业大学动物福利代表以及德国下萨克森州消费者保护与食品安全局（LAVES，奥尔登堡；编号：§4 (02.05) TSchB TU BS）的批准。
1. 斑马鱼胚胎原代细胞的制备
<ol>
	<li>受精后2天（dpf）斑马鱼胚胎的制备
	<ol>
		<li>第1天：根据您所在斑马鱼设施管理者的具体要求，设置多个所需斑马鱼品系的交配组合8.</li>
		<li>第2天：交配鱼类并收集卵8 在10 cm塑料培养皿中产卵后立即用巴斯德吸管（塑料）移除死亡或受污染的卵。用30% Danieau溶液（5.8 mM氯化钠，0.07 mM氯化钾，0.04 mM硫酸镁，0.06 mM硝酸钙，5 mM 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸，pH 7.2）清洗卵一次。8 含0.0001% (w/v)亚甲蓝的Danieau 30%溶液中。更换为不含亚甲蓝的Danieau 30%溶液，因为亚甲蓝可能引起自发荧光，随后将胚胎在 28 °C. 
		注意：每种鱼系至少使用100枚卵，以获得足够数量的细胞。每个培养皿中培养的胚胎数量不得超过150枚。</li>
		<li>第3天：移除死亡或污染的胚胎，更换为30% Danieau培养液。通过计数确定胚胎数量。将胚胎在28.5°C下过夜培养 28 °C. 
		注意：使用表达荧光报告基因的转基因品系时，可能需要在受精后1天或2天进行筛选。 
		注意：对于较大量的胚胎，建议拍摄相应培养皿的黑白图像（图1A并使用成像软件对胚胎数量进行定量。</li>
		<li>第4天：胚胎现为受精后2天。为去除卵膜，向10 mL 30% Danieau溶液中加入1 mL浓度为1 mg/mL的蛋白酶8 将胚胎置于摇床上，在室温下孵育，直至所有卵膜完全脱落（根据环境温度，约需20–40分钟）。用30% Danieau溶液洗涤，以去除蛋白酶和脱落的卵膜，随后在室温下保存胚胎，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可重复使用聚-L-赖氨酸包被玻璃底培养皿的制备

关键词：聚-L-赖氨酸，玻璃底培养皿，表面包被，细胞培养，可重复使用 
	注意：市售的玻璃底培养皿仅设计为一次性使用，且价格昂贵。以下步骤介绍如何使用标准实验室材料制备可重复使用的自制玻璃底培养游戏副本
	<ol>
		<li>在标准细胞培养皿（直径 6 cm，塑料）底部钻一个直径为 10 mm 的孔图1B）。用自来水彻底清洗培养皿底部，以去除钻孔产生的粉尘。</li>
		<li>在培养皿底部的孔洞周围涂抹硅脂，并用硅脂将盖玻片粘附固定。确保硅脂密封培养皿底部与盖玻片之间的缝隙。 
		注意：确保所使用的盖玻片厚度适合后续成像应用。</li>
		<li>用冷水和肥皂仔细彻底清洗自制的玻璃底培养皿。用去离子水冲洗玻璃底培养皿三次，以去除肥皂残留。将培养皿盖和培养皿底自然晾干，并存放于洁净容器中备用。</li>
		<li>在培养准备当天（第4天，参见1.1.4）：用70%（v/v）乙醇润湿培养皿盖和皿底的内侧。将培养皿盖和皿底内面向上放置于带有层流和紫外灯的无菌操作台中。待乙醇完全挥发后自然风干，随后用紫外灯照射20分钟。经此处理后，将培养皿组装，视为无菌。</li>
		<li>用于包被，用移液器吸取 200 µL 在每个玻璃底培养皿中央加入多聚-L-赖氨酸（0.1 mg/mL），用移液枪头轻触液面以破坏表面张力，使液体均匀铺展于盖玻片上。室温静置干燥60分钟，随后用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次。吸除液体，将培养皿置于超净台内备用。 
		注意：可根据实验目的测试其他包被材料。我们发现聚-L-赖氨酸足以支持神经元的生长，而未经额外包被的处理塑料表面似乎更有利于成纤维细胞样细胞的生长（图1E, F). 
		注意：自制的玻璃底培养皿可多次使用。如需更换盖玻片，先用温水清洗，小心取下盖玻片，并用70%（v/v）乙醇和肥皂去除残留油脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代细胞的制备与接种
	<ol>
		<li>在培养准备当天（第4天，参见1.1.4）：使用新的塑料巴氏吸管将胚胎转移至无菌细胞培养皿（直径6 cm）中。逐步移除液体，直至所有胚胎聚集于一个直径约2 cm或更小的大液滴中。</li>
		<li>将含有胚胎的培养皿置于无菌操作台中，并加入CO2不含血清的培养基（添加10% (v/v) 过滤牛血清、1 × 谷氨酰胺和1.2% (v/v) 10,000 U 青霉素-链霉素；含所有添加剂的培养基在下文中简称为“细胞培养基”）直至培养皿半满。 
		注：CO 的替代方案2-不依赖的培养基可根据实验目的进行测试，例如神经基础培养基（neurobasal medium）、DMEM培养基或Leibovitz’s L-15培养基。CO2-独立培养基和Leibovitz’s L-15培养基的优点是无需使用CO2 培养箱</li>
		<li>为去除卵黄，使用移液器将胚胎上下吹打 200 µL-移液枪头。成功去卵黄可通过培养基变浑浊来识别。</li>
		<li>用70%（v/v）乙醇填充一个细胞培养皿，另用新鲜细胞培养基填充另一个细胞培养皿。使用截断的 1,000 µL-用移液器吸头将胚胎转移至带柄的无菌细胞筛中40 µm; 图1C）。用手握住滤网的把手，将其浸入盛有乙醇的培养皿中，使所有胚胎完全浸没5秒。随后立即将带有胚胎的滤网浸入盛有新鲜细胞培养基的培养皿中。 
		注意：细胞筛可重复使用多次。使用后用软刷在流动的自来水下清洗，置于70%乙醇中保存，使用前在超净工作台内干燥并进行紫外照射处理（另见1.2.4）。</li>
		<li>将胚胎转移至无菌的1.5 mL离心管中（每管约100个胚胎）。加入用细胞培养基稀释的胶原酶（II型），使终浓度为4 mg/mL，总体积为1 mL。将含有胚胎的离心管置于垂直旋转仪上，以每分钟30转的速度于室温孵育45分钟。</li>
		<li>用移液器反复吹打胚胎-胶原酶混合物以解离残留的细胞团块 1,000 µL-移液枪吸头。然后通过带有通气槽的无菌细胞滤器过滤细胞悬液40 µm; 图1D) 转移至50 mL锥形管中。用约10 mL新鲜细胞培养基冲洗滤网。</li>
		<li>离心3分钟，180 x g，收集细胞沉淀 g. 沉淀物可能几乎不可见。小心吸除上清液，并将细胞重悬于 200 µL 每 30 个最初使用的胚胎，添加新鲜的细胞培养基。 
		注意：为获得可见的沉淀，建议至少使用 100 个胚胎作为起始材料。</li>
		<li>移液器 200 µL 将1.3.7步骤中获得的细胞悬液直接加入自制的聚-L-赖氨酸包被的玻璃底培养皿的玻璃区域（见1.2）。在室温下的无菌操作台中孵育60分钟。加入6 mL新鲜细胞培养基，继续孵育原代细胞于 28 °C.</li>
		<li>使用倒置显微镜进行所需的成像应用 28 °C每天更换细胞培养基。接种后可连续数天用于成像观察（dap）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="细胞培养实验装置与结果；培养皿、细胞生长和菌落的显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57872/57872fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：斑马鱼胚胎的原代细胞培养。（A）1 dap（受精后天数）胚胎的黑白图像，可通过软件工具分析胚胎数量。（B）带钻孔（直径10 mm）的细胞培养皿（直径6 cm），用于制备可重复使用的自制玻璃底培养皿。（C）带简易手柄的细胞筛（40 µm），用作“着陆网”，将去卵黄膜胚胎浸入乙醇中，并快速转移至新鲜细胞培养基中。（D）带通气槽的细胞筛（40 µm），用于胶原酶消化后过滤细胞。（E）接种于聚-L-赖氨酸包被玻璃表面的原代细胞在培养5 dap后，主要形成具有明显突起的神经元。比例尺 = 100 µm。（F）在未经包被处理的塑料表面培养5 dap后，成纤维细胞样细胞在培养物中过度生长。比例尺 = 100 µm。（E）和（F）由落射荧光显微镜拍摄。（G）来自野生型斑马鱼1 dap的原代细胞的透射光图像。可清晰观察到横纹肌细胞及延伸出细长突起的神经元簇。比例尺 = 50 µm。（H）转基因品系 Tg(ptf1a:eGFP)jh1 的培养细胞，该品系在后脑主要为GABA能神经元的神经前体细胞以及部分视网膜细胞群体中表达 eGFP29,30,31。比例尺 = 50 µm。（G）和（H）使用如（B）所示自制的玻璃底培养皿，通过共聚焦激光扫描显微镜拍摄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57872/57872fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
2. 使用质粒DNA转染原代细胞
<ol>
	<li>将步骤 1.3.7 中获得的滤过并沉淀的细胞用 1× PBS 重悬，而非细胞培养基。取部分细胞悬液用台盼蓝染色，通过计数板测定细胞数量9。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中，将 50 万个细胞与 10 µg 高纯度质粒 DNA 混合，并用 1× PBS 将总体积调至 100 µL。 
	注意：在我们的实验中，主要使用基于 pCS2+ 质粒的表达载体10。插入 pCS2+ 多克隆位点中的开放阅读框由人巨细胞病毒的泛表达启动子（CMV 启动子）驱动表达。也可尝试其他表达载体和启动子（另见代表性结果以及 图 2 和 图 3）。</li>
	<li>立即将细胞-DNA 混合液转移至电穿孔杯（0.4 cm），将电穿孔杯放入电穿孔仪中，并按以下参数进行电穿孔：单次脉冲、指数衰减、280 V、950 µF。</li>
	<li>电穿孔后，立即将细胞-DNA 混合液转移至含有 300 µL 新鲜细胞培养基的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>按照 1.3.8 中所述方法接种 200 µL 细胞悬液，并按 1.3.9 中所述继续操作。根据所使用的表达载体不同，荧光蛋白的表达可在数小时后或次日被检测到。</li>
</ol>
3. 固定原代细胞的染色
注意：亚细胞结构也可通过经典的免疫染色法而非荧光融合蛋白报告分子进行可视化。对于斑马鱼原代细胞，我们采用以下标准方案，以荧光标记物示例性地染色细胞核、F-肌动蛋白和乙酰化微管蛋白。
<ol>
	<li>将细胞接种于置于细胞培养皿或多孔板中的聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，操作步骤如上所述（见1.3.8）。</li>
	<li>固定时，吸去培养基，加入含4%多聚甲醛的1x PBS覆盖细胞，在室温下孵育10分钟 4 °C 在摇床上操作。室温下用1×PBS洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤3次。确保1×PBS完全覆盖细胞，并在摇床上进行洗涤步骤。</li>
	<li>为封闭并通透固定后的细胞，用含5%脱脂奶粉和0.3% Triton X-100的1x PBS覆盖细胞，在室温下置于摇床上孵育10分钟。按步骤3.2所述方法洗涤细胞。</li>
	<li>标记乙酰化微管蛋白，一种轴突标志物11，将一抗用含1%脱脂奶粉的1×PBS按1:2,000比例稀释，加入细胞中使其完全覆盖细胞，4℃孵育过夜 4 °C 在摇床上孵育。次日，按照3.2步骤所述洗涤细胞。</li>
	<li>用含1%脱脂奶粉的1×PBS将与绿色荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的二抗按1:100稀释，将细胞与该溶液在室温避光孵育1 h（用培养皿盖遮盖 例如 用盒子或铝箔包裹后置于摇床中。细胞洗涤步骤如3.2所述。</li>
	<li>为了同时染色肌动蛋白细胞骨架和细胞核，将细胞在添加了鬼笔环肽的1x PBS中孵育12 与红色荧光染料偶联（1:50）及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）13 （100 ng/mL）避光、室温、摇床上孵育10分钟。按3.2步骤洗涤细胞。</li>
	<li>为成像准备细胞时，将一块玻璃载玻片置于洁净表面上，并在其上滴加一滴封片介质。用镊子从培养皿中取出带有固定并染色细胞的盖玻片，将其细胞面向下放置在液滴上。确保封片介质覆盖整个盖玻片区域。避光干燥。</li>
	<li>将固定并封片的细胞置于暗处保存于 4 °C 直到完成所需的成像应用。</li>
</ol>
<img alt="细胞分化中遗传标记的荧光显微镜观察；EGFP、KDEL、DCX、mClover标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57872/57872fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：通过电穿孔转染表达载体。（A）在1 dap时，用pCS-eGFP转染的疑似神经元。（B）在2 dap时表达内质网靶向蛋白ss-RFP-KDEL的横纹肌细胞。（C）在2 dap时，神经元簇内的两个神经元被pCS-MitoTag-YFP转染。（D）在2 dap时，一个细胞同时转染了pCS-DCX-tdTomato、pCS-MitoTag-YFP和pCS-H2B-mseCFP。（E）将pSK-UAS:mCherry电穿孔转入来源于双转基因胚胎的原代细胞（1 dap），这些胚胎携带转基因Tg(atoh1a:Gal4TA4)hzm222和Tg(4xUAS:KGFPGI)hzm332，导致GFP在后脑神经前体细胞中表达。比例尺 = 10 µm。（A-E）通过共聚焦激光扫描显微镜获取图像，使用如图1B所示制备的玻璃底培养皿。（F）在5 dap时固定斑马鱼原代神经元的荧光染色。蓝色：DAPI（细胞核）；红色：鬼笔环肽（F-actin）；绿色：乙酰化微管蛋白（神经元）。比例尺 = 10 µm。（G）用pCS-mClover转染的类神经元细胞。在2 dap时未见突起；在5 dap时已形成类似神经突的结构。比例尺 = 25 µm。（H）与（F）中细胞来自同一样本的神经元，周围环绕着类成纤维细胞。比例尺 = 10 µm。（I）来源于携带转基因Tg(XITubb:DsRed)zf14828的转基因胚胎并转染了pCS-mClover的神经元。在12至15 dap期间，神经突发生大规模退化。比例尺 = 100 µm。图（F–I）所示细胞接种于聚-L-赖氨酸包被的玻璃（F、H）或塑料（G、I）表面，在L-15培养基中培养，培养基中添加10%过滤牛血清和神经元补充剂B-27（稀释1:50），并使用落射荧光显微镜成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57872/57872fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 成年斑马鱼脑组织原代细胞的制备
<ol>
	<li>脑组织提取
	<ol>
		<li>选取至少90日龄的成年斑马鱼。若需针对特定细胞类型，应选择一种可表达细胞特异性荧光报告基因的转基因品系，以便可视化目标细胞。</li>
		<li>将鱼放入盛有200 mL 0.2% Tricaine8（溶于Danieau 30%溶液）的烧杯中。待鱼停止活动后，将其转移至另一盛有200 mL冰水的烧杯中，持续15分钟以实施安乐死。</li>
		<li>用70%（v/v）乙醇填充一个培养皿（直径6 cm）。用一对镊子夹住鱼尾，将鱼浸入乙醇中，确保鱼体完全浸没于乙醇中5秒。</li>
		<li>按照Gupta和Mullins14的方案提取脑组织，但需作如下调整：仅使用经高压灭菌或无菌包装的器械，并在无菌1×PBS中解剖头部。</li>
		<li>提取后立即把脑组织放入盛有无菌1×PBS的培养皿（直径3 cm）中，并将该培养皿转移至无菌操作台内，用于后续细胞培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织解离与原代细胞接种
	<ol>
		<li>在超净工作台内放置两套无菌镊子（已高压灭菌）、一个盛有70%（v/v）乙醇的无菌培养皿（直径6 cm）、一个盛有Leibovitz’s L-15培养基（添加10%（v/v）过滤除菌的胎牛血清、B-27（1:50）及1.2%（v/v）10,000 U青霉素-链霉素）的无菌培养皿（直径10 cm），以及一个带柄的无菌细胞筛（孔径40 µm；图1C）。</li>
		<li>将细胞筛放入盛有乙醇的培养皿中，确保液面高于筛底至少5 mm。</li>
		<li>使用第一套镊子将脑组织转移至已置于乙醇中的细胞筛内，确保其完全被液体覆盖。1秒后，将带有脑组织的细胞筛转移至含有上述补充成分的Leibovitz’s L-15培养基的培养皿中。</li>
		<li>使用第二套镊子将脑组织转移至一个无菌1.5 mL离心管中，管内预先加入500 µL含上述补充成分的Leibovitz’s L-15培养基。加入胶原酶（II型），使其终浓度为4 mg/mL，总体积为1 mL。</li>
		<li>将离心管置于垂直旋转仪上，在室温下以每分钟30转的速度孵育35分钟。使用1,000 µL移液枪头反复吹打，机械性地分散残留的组织团块，以促进解离过程。</li>
		<li>当溶液中无可见颗粒时停止解离。将细胞悬液通过带有排气槽的无菌细胞筛（孔径40 µm；图1D）过滤至50 mL锥形离心管中。用约10 mL新鲜细胞培养基冲洗细胞筛。 
		注意：当已获得单细胞悬液时，过滤步骤的重要性低于胚胎组织解离的情况。脑组织为软组织，更易于均匀解离成单细胞悬液。</li>
		<li>以180 × g 离心5分钟收集细胞，然后将细胞沉淀重悬于1 mL含上述补充成分的新鲜Leibovitz’s L-15培养基中。</li>
		<li>取500 µL细胞悬液（相当于获得细胞总数的50%）接种至一个自制的多聚-L-赖氨酸包被的玻底培养皿（见1.2节）或24孔板的一个孔中。若使用较小表面积的容器（例如，96孔板的一个孔），则相应缩小体积（如125 µL）。在无菌操作台内室温孵育60分钟，随后补充适量新鲜培养基至指定容器的推荐体积，并将原代细胞在28 °C条件下继续孵育。</li>
		<li>使用倒置显微镜在28 °C下进行所需的成像操作。接种后的培养物可用于连续数天的成像实验。每天更换50%的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了两种不同的原代细胞培养方案，分别来源于2 dpf斑马鱼胚胎或成年斑马鱼脑组织。
从2 dpf斑马鱼制备原代细胞培养物对于具备基本细胞培养技术经验的人员而言相对容易操作。然而，为了获得良好且可重复的实验结果，使用足够数量的胚胎作为起始材料至关重要（最少100个）。在胚胎培养过程中，必须避免所有可能的污染源，以尽可能降低微生物和寄生虫的数量。其中最关键的步骤是将胚胎在乙醇中孵育——该步骤需持续足够长的时间以确保彻底灭菌，但又不能过长，因为乙醇是一种会损伤细胞和组织的有机溶剂。
在脑组织或2 dpf斑马鱼胚胎的酶解离过程中，时间控制也至关重要。一旦完成单细胞阶段的完全解离，不得延长孵育时间，并应迅速移除含酶的培养基。然而，II型胶原酶不会损伤细胞膜，且与胰蛋白酶33相比，其被胎牛血清（FBS）抑制的程度较弱。得益于这些特性，我们能够在添加FBS的情况下进行解离，FBS作为一种关键的补充成分，有助于维持细胞活力并减少细胞损伤，从而提高脆弱细胞类型的得率和存活率。
<p ...

斑马鱼（Danio rerio，D. rerio）是基础研究和生物医学研究多个领域的常用模式脊椎动物1。斑马鱼胚胎在体外（ex utero）快速发育，具有透明性，且体型适合置于显微镜下观察，因此为在活体生物中研究脊椎动物发育提供了极佳条件。由于斑马鱼具有良好的遗传可操作性2，目前已建立大量稳定的转基因报告品系，可在特定细胞类型中表达各种荧光标记物，从而实现对特定细胞群体的观察。斑马鱼研究领域提供了多种所谓的Gal4驱动品系，这些品系携带一种转基因，可在细胞类型特异性增强子的调控下，表达由酵母Gal4 DNA结合域与病毒转录激活域融合而成的合成蛋白Kal4TA4（或与KalTA3等效的GalFF）。这些驱动品系可与效应品系杂交，后者携带由特定上游激活序列（UAS）与报告基因融合而成的转基因。Kal4TA4蛋白可结合UAS元件，从而激活报告基因在特定细胞类型中的选择性表达3,4。该策略使得在双转基因动物中，几乎可以任意组合所有可用的增强子与报告元件，开展高度多样化的组合研究。
然而，在完整且持续发育的胚胎中，针对单个细胞或其亚细胞组分的深入活体成像存在局限性。为了以最高分辨率解答特定的细胞生物学问题，使用细胞培养往往更为理想。目前存在一些斑马鱼细胞系，但这些细胞系被认为经历了长期筛选5,6,7，其传代培养通常耗时较长。此外，所有现有细胞系均来源于成纤维细胞，限制了细胞培养实验仅能应用于单一类型的细胞。因此，我们建立了一种高效且易于操作的实验方案，可直接从斑马鱼胚胎及成年斑马鱼脑组织中制备原代细胞，同时提出了延长培养物存续时间并增加培养细胞类型多样性的方法。此外，我们还提供了一种将荧光细胞器标记物表达载体转染至胚胎原代细胞的操作流程。由此，可在保留关键特征的不同细胞类型中，以高空间和时间分辨率分析细胞形态及亚细胞结构。

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;鱼类品系&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB（野生型）</td><td></td><td></td><td>由Streisinger及其同事建立，可从斑马鱼国际资源中心（Zebrafish International Resource Center, ZIRC）获得</td></tr><tr><td>Tg(&lt;em&gt;ptf1a&lt;/em&gt;:eGFP)jh1</td><td></td><td></td><td>稳定转基因品系，其中包含斑马鱼基因的增强子&lt;em&gt; ptf1a &lt;/em&gt;驱动荧光蛋白EGFP的表达（Parsons &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 2007)</td></tr><tr><td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>稳定转基因品系，其中&lt;em&gt; 非洲爪蟾 &lt;/em&gt;神经特异性β微管蛋白启动子驱动荧光蛋白DsRed的表达&amp;nbsp; （佩里和N&amp;uuml;sslein-Volhard, 2008</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;设备&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>model 5804 R</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 成像系统</td><td>BioRad</td><td></td><td>model XRS+，用于获取含有1 da胚胎的培养皿的黑白图像</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td>型号 SP8，配备 28 &amp;deg;C 温度箱和 63X 物镜</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td>型号 DM5500B，配备 28 &amp;deg;C 温度箱和 40X 物镜</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 配电容扩展器</td><td>BioRad</td><td>1652661</td><td>电穿孔仪</td></tr><tr><td>水平摇床</td><td>生长因子样蛋白</td><td></td><td>model 3011</td></tr><tr><td>细胞培养用孵育箱（28 &amp;deg;C)</td><td>Memmert</td><td></td><td>模型培养箱 I</td></tr><tr><td>胚胎培养箱（28 &amp;deg;C)</td><td>Heraeus</td><td></td><td>B6120 型</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>model TELAVAL 31</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌操作台</td><td>生物数据库</td><td></td><td>在层流和紫外光条件下</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td></td><td>风格 5，Inox</td></tr><tr><td>垂直管旋转仪</td><td>Labinco B.V.</td><td></td><td>模型 LD-79</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;软件&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab 软件</td><td>BioRad</td><td></td><td>BioRad ChemiDoc MP 成像系统</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>用于通过将“计数颗粒”工具应用于相应的黑白图像来计数1 dpf胚胎；Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016)。</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>适用于徕卡显微系统公司的共聚焦显微镜和落射荧光显微镜</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;质粒&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 1599</td><td>基于骨架 pCS2+ (Rupp &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&amp;ouml;斯特尔实验室</td><td># 7</td><td>基于骨架 pCS2+（Rupp &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 2379</td><td>基于骨架 pCS2+ (Rupp &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 3865</td><td>基于骨架 pCS2+ (Rupp &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 2199</td><td>基于 pCS2+ 骨架（Rupp &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 4330</td><td>基于骨架 pCS2+ (Rupp &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrine</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 2291</td><td>基于骨架 pCS2+ (Rupp &lt;em&gt;等人，&lt;/em&gt; 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS:mCherry</td><td>K&amp;ouml;ster Lab</td><td># 1062</td><td>基于Stratagene的pBluescript骨架</td></tr><tr><td>质粒编号参考 K&amp;ouml;斯特实验室。质粒可应要求提供。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;塑料和玻璃器皿&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 细胞筛（40 &amp;micro;m)</td><td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>由 BD Bioscience 分发，用作 &amp;ldquo;捞网&amp;rdquo; 将去卵黄的胚胎浸入乙醇中，然后迅速转移至新鲜的细胞培养基中</td></tr><tr><td>1.5 mL离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer（40 &amp;micro;m)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td><td>带有通风槽；用于胶原酶消化后细胞的过滤</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿（0.4 cm）</td><td>Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技（Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管（塑料；3 mL）</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（塑料；直径 10 cm）</td><td>Sarstedt</td><td>821473</td><td>用于斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Sarstedt</td><td>蓝色（1000 &amp;micro;l): 70762；黄色（200 &amp;micro;70760002；白色（10 &amp;micro;701116</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞培养皿（塑料；直径 3 cm）</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞培养皿（塑料；直径 6 cm）</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿（塑料；直径 10 cm）</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>用于脑组织解剖</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;化学品与试剂&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>4 % 多聚甲醛溶于 1x PBS 中</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>四水合硝酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 p.a. 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;-小鼠 IgG（Fc 特异性）FITC 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>道康宁</td><td>3826-50</td><td>用于自制玻璃底培养皿的硅脂</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>默克</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>抗乙酰化微管蛋白单克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount（封片剂）</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>默克</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>脱脂牛奶</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Phalloidin</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>同义词：甲磺酸三卡因</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco 由 Life Technologies 提供</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;酶&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶（2型）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>将粉末溶于细胞培养基中（8 mg/mL），经无菌过滤后，分装并储存于 -20 ℃ &amp;deg;C</td></tr><tr><td>pronase（源自灰色链霉菌）</td><td>罗氏</td><td>11459643001</td><td>由 Sigma-Aldrich 分发，溶于 30% Danieau 溶液（10 mg/mL），分装后于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;细胞培养用培养基与溶液&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水）</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-169</td><td>由赛默飞世尔科技公司分发</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;无血清培养基</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>18045054</td><td>由赛默飞世尔科技公司分发</td></tr><tr><td>过滤的牛血清（FBS）</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>单个批次</td></tr><tr><td>谷氨酰胺 100x</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25030081</td><td>由 Thermo Fisher Scientific 分发</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>Gibco 由 Life Technologies 生产</td><td>11415049</td><td>由赛默飞世尔科技公司分发</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15140148</td><td>由 Thermo Fisher Scientific 分发</td></tr></tbody></table>

斑马鱼原代细胞的培养与转染

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

斑马鱼胚胎具有透明性且在母体外快速发育，因此能够在完整且正在发育的脊椎动物体内实现优异的活体成像 在体 在完整且正在发育的脊椎动物体内对动态生物学过程进行成像。然而，在整体标本中，对不同类型细胞的形态及亚细胞结构的详细成像受到限制。因此，我们建立了一种高效且易于使用的方案，用于培养来自斑马鱼胚胎和成体组织的活体原代细胞。
简而言之，将2 dpf的斑马鱼胚胎去壳、去卵黄、灭菌后，用胶原酶消化为单细胞。经过滤后，将原代细胞接种于玻璃底培养皿中，并培养数天。无论是新鲜培养的细胞还是长期分化的细胞，均可用于高分辨率共聚焦成像研究。该培养体系包含多种细胞类型，在聚-L-赖氨酸包被的条件下，横纹肌细胞和神经元尤为显著。为了利用荧光标记蛋白特异性地标记亚细胞结构，我们还建立了电穿孔方案，可将质粒DNA转染到包括神经元在内的多种细胞类型中。因此，在操作者设定的刺激条件下，可对斑马鱼原代细胞的复杂细胞行为及细胞内动态过程进行高时空分辨率的观测。此外，通过使用成年斑马鱼脑组织，我们证明了所述的解离技术以及基本培养条件同样适用于成年斑马鱼组织。

图1G 显示了来自野生型胚胎的典型培养物的透射光图像，其中以横纹肌细胞和成簇的类神经元细胞最为丰富。为了更易于识别特定细胞类型，可使用一种带有细胞类型特异性荧光蛋白表达的转基因品系（图1H）。
将编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）15 的基于 pCS2+ 载体的质粒11 转染至野生型胚胎的原代细胞中，可在1天后观察到强烈的荧光信号（图2A）。通过转染编码荧光细胞器标记物的基于 pCS2+ 载体的质粒，例如靶向内质网的红色荧光蛋白（ss-RFP-KDEL）16 或靶向线粒体的黄色荧光蛋白（MitoTag-YFP）<sup class="...

我们介绍了一种高效且易于使用的方案，用于制备斑马鱼胚胎的原代细胞培养物，以进行转染和活细胞成像；同时提供了一种从成年斑马鱼脑组织制备原代细胞的方案。

斑马鱼胚胎具有透明性，且在母体外快速发育，因此可在完整且正在发育的脊椎动物体内对动态生物学过程进行优良的活体成像。然而，在整体装片中对不同类型细胞的形态及亚细胞结构进行精细成像仍存在局限性。为此，我们建立了一种高效且易于操作的方案，用于培养来自斑马鱼胚胎及成体组织的活体原代细胞。简言之，将2天龄的斑马鱼胚胎去除卵膜和卵黄，经灭菌处理后，使用胶原酶将其解离为单细胞。经过滤步骤后，将原代细胞接种于玻璃底培养皿中，并培养数天。新鲜培养的细胞以及长期分化后的细胞均可用于高分辨率共聚焦成像研究。该培养体系包含多种细胞类型，在聚-L-赖氨酸包被条件下，横纹肌细胞和神经元尤为显著。为利用荧光标记蛋白特异性地标记亚细胞结构，我们还建立了一种电穿孔方案，可实现质粒DNA向包括神经元在内的多种细胞类型的转染。因此，在操作者设定的刺激条件下，可对斑马鱼原代细胞的复杂细胞行为及细胞内动态过程进行高时空分辨率的观测。此外，通过使用成年斑马鱼脑组织，我们证明所描述的解离技术及基本培养条件同样适用于成年斑马鱼组织。

该方法为斑马鱼研究领域提供了一种工具，可用于分析细胞间动态，其分辨率是体内实验无法达到的。同时，该方法还能弥补斑马鱼细胞系缺乏的不足。该技术的主要优势在于，可直接从原始组织中分离并转染原代细胞，因此无需维持细胞系。开始实验方案时，准备受精后两天（dpf）的斑马鱼胚胎。在第一天，设置若干对所需斑马鱼品系的交配。第二天让斑马鱼交配，并在产卵后立即在塑料10厘米培养皿中收集卵。使用塑料巴斯德移液管去除死亡和受污染的卵。用含0.0001%（质量体积比）亚甲蓝的30% Danieau溶液清洗卵一次。然后将溶液更换为不含亚甲蓝的新鲜30% Danieau溶液，并在28摄氏度下过夜孵育卵。第三天，移除死亡和污染的胚胎，更换为30% Danieau培养液，随后将胚胎在28摄氏度条件下过夜培养。第四天，通过吸去培养液至皿中剩余约10毫升，加入1毫升浓度为1毫克/毫升的蛋白酶K（pronase），将胚胎置于摇床上，在室温下孵育约30分钟，直至所有卵膜完全脱落。接下来，在培养皿底部下方的孔洞周围涂抹硅脂，并用硅脂作为粘合剂将盖玻片固定。确保硅脂密封了培养皿底部与盖玻片之间的缝隙。用冷水和肥皂彻底但小心地清洗玻璃底培养皿。用去离子水将玻璃底培养皿清洗三遍，以去除肥皂残留。然后将皿盖和皿底自然晾干，并存放于洁净盒子中备用。在准备培养物当天，用70%乙醇润湿皿盖和皿底的内表面。将培养皿盖和培养皿底内面朝上放置于带有层流和紫外灯的无菌工作台中。让培养皿自然晾干，直至乙醇完全挥发，然后用紫外灯照射20分钟。经此处理后，培养皿可组装使用，且为无菌状态。在每个玻底培养皿中央加入200微升浓度为0.1毫克/毫升的多聚-L-赖氨酸溶液，用移液枪头轻触液面以破坏表面张力，使液体均匀覆盖在盖玻片表面。随后将培养皿置于室温下静置孵育60分钟。孵育结束后，用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次，并吸除液体。将培养皿置于实验台下备用。在第4天，即培养准备当天，用新的塑料巴斯德吸管将胚胎转移至无菌细胞培养皿中。逐步移除液体，直至所有胚胎聚集在一个直径约两厘米或更小的大液滴中。将含有胚胎的培养皿置于无菌操作台中，加入二氧化碳非依赖性培养基，直至培养皿半满。为去除卵黄，使用200微升移液枪头将胚胎反复吹打。成功的去卵黄操作可通过培养基变浑浊来判断。接着，用70%乙醇填充一个细胞培养皿，另取一个细胞培养皿加入新鲜的细胞培养基。使用剪去尖端的1000微升移液枪头将胚胎转移至带有手柄的无菌40微米细胞滤器中。用手握住手柄，将滤器浸入盛有乙醇的培养皿中，使所有胚胎完全浸没5秒钟。乙醇处理后立即将装有胚胎的滤网浸入盛有新鲜细胞培养基的培养皿中，随后将胚胎转移至无菌的1.5毫升离心管中，向胚胎中加入胶原酶2型。将试管置于垂直管式旋转仪上孵育。使用1000微升移液器枪头反复吹打混合液，以解离残留的细胞团块。随后将细胞悬液通

culture-and-transfection-of-zebrafish-primary-cells

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

该视频展示了一种从斑马鱼胚胎中培养原代视网膜神经节细胞的方法。早期胚胎经过解剖以分离眼球，随后通过机械方法将眼球解离成视网膜神经节细胞悬液。该细胞悬液被接种于涂有黏附性蛋白的盖玻片上进行培养，以促进轴突的发育。...

从斑马鱼胚胎中建立原代视网膜神经节细胞培养

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斑马鱼原代细胞的培养与转染

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