Name: HEK 细胞 Mitoribosome 的快速分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习利用氮气空化裂解技术从HEK293S细胞中快速分离高纯度线粒体核糖体的方法。该技术仅需少量培养细胞即可完成大规模制备，适用于结构生物学研究和线粒体蛋白质合成机制探索。

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本工作得到了瑞典战略研究基金会（未来领袖资助 FFL15:0325）、Ragnar Söderberg 基金会（医学研究员奖学金 M44/16）、瑞典研究理事会（启动资助 NT×2015-04107）、FEBS 长期研究员奖学金（SA）以及“地平线2020”计划—玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络（721757）（VS）的支持。

所有哺乳动物细胞培养操作必须在生物安全柜内进行。若接触细胞，应使用无菌设备。佩戴腈类手套和实验服，并遵循良好的组织培养规范。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下，使用添加了10%无四环素胎牛血清（FBS）、5 μg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）和200 μg/mL阿奇霉素（Azithromycin）的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM）悬浮培养HEK293S细胞。2.</li>
	<li>扩增至9个T175培养瓶。当细胞融合度达到90%时，收集细胞，以500 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于添加了5%无四环素胎牛血清的Freestyl培养基中。使用自动细胞计数仪计数细胞，并调整细胞浓度至1.5 × 10⁶个/mL。6 细胞/mL，置于通气摇瓶中。 
	注意：这通常对应于在1,000 mL通气烧瓶中的起始体积为300 mL。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下，于摇床培养箱中孵育细胞2 在120 rpm（50 mm振荡直径）条件下。</li>
	<li>2天后计数细胞，若细胞密度高于3.0 × 106 个/mL。将2 × 150 mL细胞培养物于2 × 250 mL锥形瓶中在500 × g离心5分钟，沉淀细胞。用2 × 10 mL新鲜培养基重悬细胞，转移至2个带通气盖的1,000 mL培养瓶中，加入适量培养基，使最终细胞密度为1.5 × 106 细胞/毫升， 例如 2 × 300 mL，起始细胞密度为 3.0 × 106 cells/mL</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的摇床培养箱中孵育细胞2 在120 rpm（50 mm振荡直径）条件下。</li>
	<li>两天后计数细胞，若细胞密度高于 3.0 x 106 个/mL。将4 × 150 mL细胞培养液于4 × 250 mL锥形瓶中，在500 × g离心5分钟，沉淀细胞。用2 × 10 mL新鲜培养基重悬细胞，转移至2 × 2,000 mL通气培养瓶中，补加适量培养基，使最终细胞密度为1.5 × 106 细胞/毫升， 例如 2 × 700 mL，起始细胞密度为 3.0 × 106 cells/mL</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下，于摇床培养箱中孵育细胞2 在120 rpm（50 mm振荡直径）条件下。</li>
	<li>两天后计数细胞，若细胞密度高于 3.0 x 106 细胞/mL。将2 × 700 mL细胞培养液分别转移至2个2800 mL透气培养瓶中，再分别补加300 mL新鲜培养基，使终体积达到2 × 1 L，进行细胞传代。</li>
	<li>在37°C、5% CO₂的摇床培养箱中孵育细胞2 在120 rpm（50 mm振荡直径）条件下。</li>
	<li>24 小时后计数细胞，若细胞密度在 3.0 - 4.0 x 10 之间，则收获细胞6 cells/mL</li>
</ol>
2. 线粒体分离
<ol>
	<li>所需缓冲液 
	注意：以下试剂用量适用于从 2 L 细胞中进行制备。请提前配制以下&#160;储备液&#160;用于线粒体分离缓冲液（MIB）、蔗糖/甘露醇缓冲液（SM4）、实验缓冲液（MIBSM）和重悬缓冲液（SEM）。
	<ol>
		<li>配制 0.5 L MIB 缓冲液：50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT，并加入蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>配制 100 mL SM4 缓冲液：280 mM 蔗糖、840 mM 甘露醇、50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT，并加入蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>配制 160 mL MIBSM 缓冲液：将 120 mL MIB 缓冲液与 40 mL SM4 缓冲液混合。</li>
		<li>将 200 mL PBS 储存于 4 °C。</li>
		<li>配制 5 mL SEM 缓冲液：250 mM 蔗糖、20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、1 mM EDTA。</li>
		<li>配制 4 份各 10 mL 的储备液，用于制备梯度蔗糖溶液，其中含 20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、1 mM EDTA，以及分别为 60%、32%、23% 和 15% 的蔗糖溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体分离 
	注意：操作过程应迅速，并在整个实验过程中保持所有材料处于冰上。</li>
	<li>使用前将氮气破胞室预冷。
	<ol>
		<li>通过离心收集 2 × 1 L 细胞（每离心管含 3–4 × 109 个细胞），条件为 1,000 × g 离心 7 分钟，4 °C。</li>
		<li>小心弃去上清液，并迅速将沉淀细胞重悬于 2 × 100 mL PBS 中。合并细胞悬液。</li>
		<li>将重悬的细胞在 1,200 × g 条件下离心 10 分钟，4 °C。</li>
		<li>小心弃去上清液，并称量细胞沉淀（约 20 g）。</li>
		<li>将沉淀重悬于 120 mL MIB 缓冲液中。</li>
		<li>在冷室中轻轻搅拌，使细胞膨胀 10 分钟。</li>
		<li>将氮气破胞室置于冰上，将膨胀后的细胞转移至破胞室中。加入 45 mL SM4 缓冲液（约为重悬细胞终体积的 1/3，约 140 mL），使终浓度为 70 mM 蔗糖和 210 mM 甘露醇。</li>
		<li>密封氮气破胞室，充入氮气至压力达到 500 psi。关闭阀门，保持在冰上静置 20 分钟。</li>
		<li>缓慢释放氮气破胞室中的压力，并收集裂解液（约 185 mL）。</li>
		<li>将裂解物在 800 × g 条件下离心 15 分钟，4 °C，以去除细胞碎片和细胞核。</li>
		<li>将上清液通过纱布倾倒入置于冰上的烧杯中。不要丢弃沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于 90 mL MIBSM 缓冲液中（为前一体积的一半）。使用特氟龙/玻璃Dounce匀浆器匀浆，并在 800 × g 条件下重复离心 15 分钟，4 °C。</li>
		<li>将上清液通过纱布倾倒入置于冰上的烧杯中。将此上清液与步骤 2.2.11 的上清液合并。</li>
		<li>将合并后的上清液在 1,000 × g 条件下离心 15 分钟，4 °C。</li>
		<li>将上清液通过纱布倾倒入置于冰上的烧杯中。</li>
		<li>弃去沉淀，并将含有粗线粒体的上清液在 10,000 × g 条件下离心 15 分钟，4 °C。 
		注意：沉淀通常分为松散和致密两部分。</li>
		<li>小心冲洗松散部分的沉淀，避免扰动致密部分。将致密沉淀重悬于 10 mL MIBSM 缓冲液中。</li>
		<li>使用商用蛋白定量试剂盒或类似方法测定蛋白浓度。从 2 L 起始培养物中通常可获得约 2 mg/mL 的蛋白浓度。</li>
		<li>加入 200 单位无 RNase 污染的 DNase，在冷室中于旋转仪上孵育 20 分钟，使 DNase 充分混匀以去除基因组 DNA。</li>
		<li>在 10,000 × g 条件下离心 15 分钟，4 °C，将沉淀重悬于 2 mL SEM 缓冲液中。使用小型特氟龙/玻璃Dounce匀浆器轻轻匀浆，以重悬任何残留的聚集体。上下吹打不超过五次，避免破坏线粒体。保持样品在冰上。</li>
		<li>在 14 mL SW40 离心管中制备蔗糖梯度：用移液器小心将 1.5 mL 60% 蔗糖储备液加至管底。随后小心地将 4.5 mL 32% 蔗糖储备液加在 60% 层之上，避免扰动下层。再依次加入 1.5 mL 23% 蔗糖储备液和 1.5 mL 15% 蔗糖储备液。</li>
		<li>将全部线粒体悬液（约 3 mL）小心加至蔗糖梯度顶部。</li>
		<li>在 SW40 转子中以 139,065 × g 离心 60 分钟。</li>
		<li>使用移液器小心收集迁移至 32% 与 60% 蔗糖界面处的棕色条带，通常为 2–3 mL。</li>
		<li>将纯化的线粒体在液氮中速冻，并储存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 线粒体核糖体的制备
<ol>
	<li>所需缓冲液 
	注意：提前配制以下&#160;储存液&#160;，用于裂解缓冲液、蔗糖垫/梯度液和重悬缓冲液。
	<ol>
		<li>配制10 mL裂解缓冲液：25 mM HEPES-KOH，pH 7.5，150 mM KCl，50 mM MgOAc，2% 聚乙二醇辛基苯基醚，2 mM DTT，蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>配制10 mL蔗糖垫缓冲液：1 M 蔗糖（34% w/v），20 mM HEPES-KOH，pH 7.5，100 mM KCl，20 mM MgOAc，1% 聚乙二醇辛基苯基醚，2 mM DTT。</li>
		<li>配制5 mL重悬缓冲液：20 mM HEPES-KOH，pH 7.5，100 mM KCl，20 mM MgOAc，2 mM DTT。</li>
		<li>在TLS-55聚碳酸酯管中用重悬缓冲液制备15%-30%线性蔗糖梯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&#160;线粒体核糖体纯化
	<ol>
		<li>将冷冻的线粒体在冰上解冻。</li>
		<li>加入两倍体积的裂解缓冲液，例如，向3 mL线粒体中加入6 mL裂解缓冲液。立即通过反复倒置离心管进行混匀。</li>
		<li>使用小型特氟龙/玻璃Dounce匀浆器进行匀浆以促进裂解，并在冰上孵育5-10分钟以完成裂解过程。</li>
		<li>将裂解物（约9 mL）在4 °C条件下以30,000 × g离心20分钟，以去除不溶性物质。小心倾去上清液，弃去沉淀。</li>
		<li>在4 °C条件下再次以30,000 × g离心20分钟，确保上清液澄清。小心倾去上清液，弃去沉淀。</li>
		<li>在TLA 120.2超清管中制备蔗糖垫：每管0.4 mL蔗糖垫。每毫升裂解物准备一管。</li>
		<li>将裂解的线粒体铺在蔗糖垫上：每管约1 mL，使裂解物与垫层的比例为2.5:1。</li>
		<li>在TLA120.2转子中于4 °C以231,550 × g离心45分钟。</li>
		<li>弃去上清液，并依次用100 µL重悬缓冲液冲洗管壁，以去除残留的蔗糖。</li>
		<li>将沉淀用总共100 µL重悬缓冲液重悬。</li>
		<li>以低速涡旋振荡30秒以溶解残留的聚集体，然后在微量离心管中于4 °C以17,949 × g离心10分钟。</li>
		<li>小心收集上清液，并重复一次离心步骤。</li>
		<li>测定线粒体核糖体在A260处的吸光度。 
		注意：典型产量为7 A260，A260:A280比值为1.3。</li>
		<li>将全部样品加至单个线性蔗糖梯度管中。在TLS-55转子中于4 °C以213,626 × g离心120分钟。</li>
		<li>对梯度进行分部收集，测定A260处的光密度，并合并对应于核酸峰的组分。 
		注意：峰组分的典型A260:A280比值&#62;1.6。</li>
		<li>如有必要，使用合适的方法进行缓冲液置换。使用换算关系1 A260 = 0.1 mg/mL计算最终浓度。</li>
		<li>将纯化的线粒体核糖体样品在重悬缓冲液中快速冷冻，并储存在-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ott, M., Amunts, A., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+mitochondrial+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis.</a> Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).</li>
<li>Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+human+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the human mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6230), 95-98 (2015).</li>
<li>Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+structure+of+the+55S+mammalian+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome.</a> Science. 348 (6232), 303-308 (2015).</li>
<li>Greber, B. J., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial ribosome.</a> Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).</li>
<li>Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+large+subunit+of+the+mammalian+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome.</a> Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).</li>
<li>Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+ribosomes+can+switch+their+structural+RNA+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338(2016).</li>
<li>Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+ribosomes+can+switch+structural+tRNAs-but+when+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why?</a> RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).</li>
<li>Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Genome+Engineering%3A+The+Revolution+May+Not+Be+CRISPR-Ized%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized.</a> Trends in Genetics. , (2017).</li>
<li>Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+mitochondrial+ribosome+in+native+states+of+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866(2017).</li>
<li>Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin%3A+high-level+expression+of+rhodopsin+with+restricted+and+homogenous+N-glycosylation+by+tetracycline-inducible+N-acetylglucosaminyltransferase+I-negative+HEK293S+stable+mammalian+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).</li>
<li>Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+large+ribosomal+subunit+from+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria.</a> Science. 346 (6210), 718-722 (2014).</li>
<li>O'Brien, T. W., Kalf, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+from+rat+liver+mitochondria+I.+Isolation+procedure+and+contamination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).</li>
<li>Spremulli, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+mitochondrial+ribosomes+from+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondria%3A+Practical+Protocols%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues.</a> Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).</li>
<li>Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRice%2C+JE+%22Subcellular+Fractionation%3A+A+Practical+Approach%22">Subcellular Fractionation: A Practical Approach</a>. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).</li>
<li>Attardi, G., Ching, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+mitochondrial+proteins+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells.</a> Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Adachi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cavitation+for+cell+disruption+to+obtain+mitochondria+from+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells.</a> Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).</li>
<li>Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+fatty+acids+and+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+by+isolated+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).</li>
<li>Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li>
<li>Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+and+cancer+metabolism+in+the+tumor+microenvironment%3A+markers%2C+models%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).</li>
<li>Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+translation+as+a+therapeutic+strategy+for+human+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).</li>
<li>Boczonadi, V., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+impaired+mitochondrial+translation+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).</li>
</ol>

关于起始材料的来源，尽管已知某些动物组织富含线粒体且相对容易获取，因而成为线粒体核糖体研究的常用选择3,5,12,13，但这些组织难以在实验室中进行遗传修饰和大规模繁殖。因此，建立基于均一培养的人源细胞系的实验方案具有明确的实用需求。处理组织与培养细胞的方案之间主要区别在于裂解和匀浆方式。对于以单层形式生长的培养细胞，常用的方法是特氟龙/玻璃Dounce匀浆法14。早期建立的制备方案虽然高效，但仅适用于小规模操作15。虽然可直接使用容量为500 mL的匀浆器进行放大操作11，但需要约2小时的人工操作才能实现80%的裂解率。这种方法至少带来三个问题：由于等待时间较长导致细胞器聚集；由于重物质沉降至大容器底部造成裂解不均一；以及因多次研磨导致样品升温。因此，更理想的裂解方法是采用氮气空化法，该方法基于从加压容器中快速减压的原理16,17。在此方法中，细胞首先在低温环境中膨胀，以软化细胞结构，使其更易于裂解。当细胞被置入氮气空化装置时，加入含有蔗糖和甘露醇的缓冲液，以维持渗透压，从而有助于保持线粒体的完整性。随后，用大量无氧氮气对氮气空化装置加压，使氮气溶解进入细胞内部。当压力释放时，氮气从溶液中形成气泡析出，导致细胞膜破裂。与涉及剪切应力和摩擦的机械匀浆方法相比，该方法具有以下优势：1）避免了对细胞施加任何外部物理应力；2）绝热膨胀过程使样品冷却，确保细胞器不受热损伤；3）惰性氮气可保护细胞组分免受氧化；4）悬浮介质的pH值不会发生改变；5）由于每个细胞内部及整个样品中所受的破坏力一致，过程均一且可重复；6）操作快速，可在20–30分钟内完成。
从培养细胞和组织中分离线粒体的方法在文献中已有广泛描述，其基本原理是通过温和的细胞破碎，随后进行一系列差速离心。目前大多数常用方案均基于上个世纪中叶建立的原始方法18。尽管这些基本生化方法是正确的，但文献中已指出若干长期未被察觉的误解。为了优化线粒体核糖体（mitoribosome）的分离方案，我们系统地评估了已报道的通用原则，并得出以下结论：1）缓冲液中添加 Mg2+ 和 K+ 并非关键。尽管有观点认为 KCl 可防止胞质蛋白形成凝胶19，但只要按照本方案进行充分稀释，该现象不会发生。此外，去除 Mg2+ 有助于减少胞质核糖体的污染20；2）无需维持细胞与培养基之间尽可能大的体积比以保护释放的细胞器免受低渗环境影响。本方案中，含蔗糖的缓冲液已足以提供渗透支持，而将细胞用线粒体分离缓冲液稀释（步骤 2.II.5）对于大规模制备中细胞器的有效分离至关重要。
线粒体分离缓冲液的pH接近生理值， 即 7.5，这同样是后续线粒体核糖体（mitoribosome）制备的最适pH值。在分离介质中加入结合剂EDTA和EGTA，用于螯合污染性离子，它们分别螯合游离的镁离子和钙离子。已有讨论指出，EDTA的加入可能导致线粒体内膜受损。14因此，出于谨慎考虑，浓度限于1 mM。在蔗糖密度梯度的最终纯化步骤中，使用5 mM EDTA时我们未观察到任何差异。
本方案采用源自HEK293S的人源细胞进行线粒体核糖体的纯化。所获得样品的质量可支持对其进行生化和原子分辨率水平的结构研究。因此，该方法可应用于人源线粒体核糖体翻译复合物、质量控制组装体以及线粒体核糖体亚基中间产物的研究。此外，由于癌细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）能力较邻近间质组织增强，且线粒体蛋白质翻译水平升高21，线粒体核糖体已成为癌症治疗的既定药物靶点22。因此，利用本方案在抑制剂存在条件下特异性纯化线粒体核糖体，将具有医学应用价值。同时，线粒体核糖体的突变已被证实与遗传性线粒体疾病相关23。由于这些突变会直接影响其结构，本文所介绍的方法将有助于对这类突变进行结构表征。该方案还可进一步实验拓展，应用于多种科学问题，以深入理解人类线粒体中翻译过程的基本机制及其医学意义。

线粒体蛋白质合成过程依赖于13种关键的线粒体mRNA（mt-mRNA），这些mRNA由附着在膜上的特化线粒体核糖体（mitoribosome）翻译，生成呼吸链的催化核心。线粒体基因组的改变以及蛋白质需要在翻译过程中共翻译插入膜内的特性，显著塑造了线粒体核糖体的结构架构1。近期获得的哺乳动物线粒体核糖体高分辨率结构显示，其整体构象与细菌核糖体存在显著差异2,3。特别是，至少新增了36种线粒体特异性蛋白，额外贡献了约1 MDa的分子质量，而线粒体rRNA（mt-rRNA）则减少了一半，并且高度分化。这些结构上的重排几乎改变了此前普遍认为在所有物种中均保守的关键功能特征4。
每个线粒体核糖体亚基都获得了新的主要组分，例如，小亚基在其“头部”区域整合了一种内在的GTP酶蛋白mS29。其他翻译系统中尚未发现GTP酶活性，而结构研究表明该GTP酶可能在线粒体核糖体亚基的组装过程中发挥作用2。此前认为存在于所有已知核糖体大亚基中的5S rRNA，作为中心突起核心的标志性组分，在哺乳动物线粒体核糖体中缺失，取而代之的是将mt-tRNA-Val作为其结构中的一个基本组成单元2。Ban及其同事发现，猪的线粒体核糖体中含有的是mt-tRNA-Phe而非mt-tRNA-Val5。Chrzanowska-Lightowlers、Minczuk及其同事进一步验证了这些结果，并发现来自mt-tRNA-Val稳定性受损患者的线粒体核糖体原则上能够容纳mt-tRNA-Phe6,7。目前尚不清楚线粒体核糖体为何会整合这些特定组分，以及介导这些独特组装过程所需的通路和反式作用因子是什么。
总体而言，人类线粒体核糖体的高度复杂性、新发现的蛋白质组分以及线粒体tRNA作为结构元件的独特结合方式，暗示了迄今尚未明确的线粒体特异性trans-作用因子的参与。然而，由于该系统的许多特征为线粒体所独有，而线粒体传统上难以研究8，目前对相关的分子机制和质量控制机制仍知之甚少。随着电子冷冻显微镜（cryo-EM）高分辨率单颗粒分析技术的发展20，现在有机会全面研究人类线粒体核糖体组装、功能及其质量控制背后的分子机制。我们首次报道了人类线粒体核糖体组装中间体的结构，表明可视化人类线粒体核糖体形成过程是可行的，并显示cryo-EM在鉴定新的trans-作用组装因子方面具有关键作用9。
为了进一步推进这一初步工作，我们详细描述了一种快速纯化人线粒体核糖体的方案。该方案的第一部分介绍了从悬浮细胞中大规模分离高纯度完整线粒体的方法。此步骤耗时9小时，可轻松修改并适用于不同类型的细胞和不同规模的实验。该方案中的关键步骤是使用氮气空化法裂解细胞。第二部分方案旨在纯化线粒体核糖体，耗时7小时，可获得足量的线粒体核糖体，适用于生化与结构研究。以高纯度线粒体作为起始材料，可获得高质量的终产物，且该方法可推广应用于其他线粒体大分子的纯化。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含GLUTAMAX添加剂和丙酮酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin 筛选试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R25001</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Freestyle 293表达培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12338026</td><td></td></tr><tr><td>T175 组织培养瓶，带透气盖</td><td>Sarstedt</td><td>83.3912.002</td><td></td></tr><tr><td>带通气盖的摇瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 锥形瓶，无菌</td><td>康宁</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Eve 自动细胞计数仪</td><td>NanoEnTek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>氮气空化细胞破碎装置</td><td>Parr Instruments</td><td>4635, 4639</td><td>安全体积：分别为 40 ml 和 600 ml</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（无RNA）</td><td>HT 生物技术</td><td>N401a</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙/玻璃Dounce匀浆器</td><td>剑桥玻璃吹制有限公司</td><td></td><td>尺寸可根据要求定制</td></tr><tr><td>用于线粒体梯度离心的SW40离心管</td><td>贝克曼</td><td>344060</td><td>聚丙烯，薄壁</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.2 离心管（用于减震垫）</td><td>贝克曼</td><td>343778</td><td>聚碳酸酯，厚壁</td></tr><tr><td>用于梯度的 TLS-55 管</td><td>贝克曼</td><td>347356</td><td>超清晰</td></tr><tr><td>梯度站 IP</td><td>BioComp</td><td>153-002</td><td></td></tr></tbody></table>

快速分离hek细胞中的线粒体核糖体

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

人类线粒体拥有一套专门的核糖体（线粒体核糖体），用于翻译由线粒体基因组编码的氧化磷酸化复合物的13种必需蛋白质组分。由于人类线粒体核糖体合成的所有蛋白质均为膜整合蛋白，因此在翻译过程中，人类线粒体核糖体会锚定于线粒体内膜上。与细胞质核糖体相比，线粒体核糖体的沉降系数为55S，核糖体RNA（rRNA）含量减半，不含5S rRNA，并含有36种额外的蛋白质。因此，较高的蛋白质与RNA比例以及非典型的结构使得人类线粒体核糖体与其细胞质对应物存在显著差异。
尽管线粒体核糖体对生命具有核心重要性，但此前尚无从人类细胞系中纯化完整复合物的实验方案。传统上，线粒体核糖体的分离依赖于富含线粒体的动物组织，且需要千克级的起始材料。我们推断，在营养丰富的表达培养基中培养的分裂期HEK293来源的人类细胞，其线粒体具有活跃的线粒体翻译活性，因此可能成为线粒体核糖体结构与生化研究的合适材料来源。为了研究其结构，我们开发了一种从HEK细胞中大规模纯化完整线粒体核糖体的实验方案。本文中，我们引入氮气空化法作为细胞裂解的一种更快、更省力且更高效的替代方法，相较于传统的基于机械剪切的裂解方式，该方法获得了适用于高分辨率结构解析的线粒体核糖体样品，揭示了完整人源线粒体核糖体及其组装中间体的组成。在此，我们进一步优化了该工作，提出一种更经济且优化的方法，仅需约~1010个培养的HEK细胞。该方法可用于纯化人源线粒体核糖体翻译复合物、突变体、质量控制组装体以及线粒体核糖体亚基中间体。如有需要，该纯化过程可线性放大十倍，并可适用于其他类型的细胞。

分裂活跃且高活力的细胞是纯化有活性的线粒体核糖体的关键起始材料。本方案适用于任何悬浮培养的HEK293细胞。我们使用的是实验室自建的T501细胞系，该细胞系在四环素诱导调控下稳定表达一种转运蛋白。其亲本细胞系为HEK293S-GnTI。- 细胞 (材料清单)10在 FreeStyle 293 表达培养基中进行细胞生长与扩增期间，最低密度应维持在 1.5 × 106 细胞/mL，以确保每两天倍增一次，而最大细胞密度不应超过约5 × 106 细胞/毫升。当细胞密度超过 3 x 106 细胞/mL，离心收集细胞后，用预热的新鲜培养基在扩大体积中重悬，以达到最低细胞密度1.5 × 106 细胞/mL。每2-3天重复进行一次传代，直至达到该实验所需的细胞量。最终细胞密度可在3-4.5 × 10范围内变化6 细胞/mL，且分离线粒体至少需要以2 L为起始量。细胞活力应通常保持 &gt;90%，以及用于收获的最终培养物 &gt;95%。不建议对大规模细胞培养使用抗生素。
经过一系列差速离心后，步骤 2.2.20 所得线粒体悬液的体积通常在 3–5 mL 范围内。随后，线粒体通过蔗糖梯度（图 1）与其他细胞器分离。蔗糖梯度需分步制备，使梯度体积与线粒体悬液体积之和恰好达到离心管的最大容量。在此过程中，需特别小心收集迁移至 60% / 32% 界面处的棕色条带，尽量减少周围缓冲液的污染。这一步至关重要，以确保后续线粒体增溶过程中蛋白与去垢剂的比例保持恒定。建议在此阶段测定线粒体蛋白浓度，通常从约 1010 个培养的 HEK 细胞中可获得 15–20 mg 总线粒体蛋白。
线粒体成功分离后，通过加入聚乙二醇辛基苯基醚将其裂解，并通过蔗糖垫分离线粒体核糖体（图2）。为将线粒体核糖体与疏水性膜状物质分离，将沉淀物重悬于不含去污剂的缓冲液中，再通过离心使疏水性复合物沉淀。该步骤需重复一次，通过测定A260/A280比值来定量线粒体核糖体的纯化程度，该比值预期约为1.3。通常从2 L起始培养液中可获得7 A260 的典型产量。此线粒体核糖体组分中还含有其他较大的可溶性线粒体复合物，如丙酮酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶。为将线粒体核糖体与可溶性线粒体复合物分离，将上清液加载至蔗糖密度梯度中。含有线粒体核糖体的组分通常位于离心管底部的三分之一区域。蔗糖梯度的分级可采用自动活塞完成，也可手动操作，即用移液器小心吸取50 µL的组分，或用21 G针头在离心管底部穿孔并收集滴出液。
在梯度中可识别出两种主要的线粒体核糖体组分：55S 单体和39S 大亚基，如图3和图4所示。大亚基组分的存在表明细胞处于高度活跃的分裂状态11。单体与大亚基峰之间的比例可能发生变化。在含有污染性胞质核糖体80S 的样品中，可能在靠近梯度底部的位置出现额外的峰。请注意，使用摆动转头 TLS-55 的小型蔗糖梯度可快速纯化约 1 mL 的线粒体核糖体，其在 A260 处的光密度为 0.4–1。单体与大亚基峰的分离程度可能因分步操作而略有差异，但通常两者存在一定重叠。因此，应仔细考虑收集并合并哪些组分，以确保样品中单体或大亚基的比例达到最高。对于高分辨率冷冻电镜研究，两种线粒体核糖体组分之间无需完全分离（因后续可通过in silico 方法进一步处理）。然而，若需要更佳的分离效果，建议使用更大的离心管及相应的延长运行时间。
<img alt="差速离心示意图；密度梯度中线粒体、细胞核的条带分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：蔗糖梯度纯化线粒体。 来自 2 L 起始培养物的亚细胞器按照本方案所述进行一系列差速离心分级，线粒体通过不连续蔗糖梯度分离。纯化的线粒体位于 32%/60% 界面处的下部条带中。
<img alt="戴手套的手持微型离心管，可能用于DNA分析或样品制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：线粒体核糖体在蔗糖垫上的纯化。 从2 L起始培养物中获得的粗制线粒体核糖体通过1 M蔗糖垫进行沉降。沉淀物重悬于无去垢剂的缓冲液中，并按照本方案所述，通过两次离心澄清线粒体核糖体。记录吸光度以评估制备样品的质量，典型的A260/A280比值约为1.3（右图），表明获得了富含线粒体核糖体的组分。<a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="吸光度与组分关系图显示DNA浓度峰值，用于色谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：线粒体核糖体在蔗糖梯度中的精细纯化。 来自2 L起始培养物的吸光度曲线。组分按梯度从上到下编号。可识别出两类主要的线粒体核糖体组分：大亚基（峰1）和55S单体（峰2）。两类组分的比例可能发生变化。 <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜核糖体结构分析、单颗粒重构结果、核糖体亚基鉴定" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57877/57877fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：电子显微照片、二维分类结果及三维重构。 左图：来自单体峰2的样品在标定放大倍数为1.23 Å/像素下的显微照片。 中图： 代表性的后期处理数据（二维分类），显示完整的单体核糖体。 右图： 三维重构结果。 <a href="/files/ftp_upload/57877/57877fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

线粒体具有特化的核糖体，这些核糖体与其细菌和细胞质中的对应物存在差异。本文展示了如何从HEK细胞的天然区室中获取线粒体核糖体。该方法包括从悬浮细胞中分离线粒体，进而纯化线粒体核糖体。

快速分离HEK细胞中的线粒体核糖体

人类线粒体拥有一套专门的核糖体（线粒体核糖体），用于翻译氧化磷酸化复合物的13种必需蛋白质组分……

本实验的总体目标是从人类细胞系的线粒体中大规模纯化核糖体，以获得足够用于结构研究的样品。该线粒体核糖体纯化方法可用于表征正在翻译的复合物、突变体、质量控制组装体以及线粒体核糖体亚基的中间产物，进而解答有关线粒体内蛋白质合成的关键科学问题。该技术的主要优势在于采用氮气空化法进行细胞裂解，仅需10^10个培养细胞即可制备用于高分辨率结构解析的线粒体核糖体。该方法有助于发现线粒体翻译机制中的新组分，并可进一步用于开发癌症治疗的新型疗法。按照文本所述方案培养HEK293S细胞后，通过离心收集两管一升培养物，离心条件为1,000 × g、4摄氏度，离心7分钟。小心弃去上清液，并迅速将每个沉淀重悬于 100 毫升 PBS 中。然后，收集细胞并以 1,200 × g 在 4 °C 下离心 10 分钟。接着，小心弃去上清液后，称量沉淀物。然后，使用 120 毫升 MIB 缓冲液重悬细胞，并将重悬的细胞置于冷室中膨胀 20 分钟。将膨胀后的细胞转移至冰上的预冷氮气破菌室中。然后，向细胞中加入 45 毫升 SM4 缓冲液。固定氮气爆破室，并充入氮气直至压力达到 500 PSI。然后关闭阀门，将装置置于冰上静置 20 分钟。氮气爆破法裂解细胞可避免对细胞施加外部物理应力，防止细胞器受热损伤，同时氮气环境可保护细胞免受氧化损伤。此外，该方法具有高度的可重复性。缓慢释放腔室内的压力，收集裂解液。随后，为去除细胞碎片和细胞核，将裂解后的样品在 800 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。将上清液倒入置于冰上的烧杯中，过滤时使用折叠的纱布。切勿弃去沉淀。用90毫升MiBSM缓冲液重悬沉淀。然后，使用聚四氟乙烯玻璃匀浆器匀浆样品，并在 800 × g、4 °C 条件下再次离心 10 分钟。随后，将上清液通过折叠的纱布过滤，倒入置于冰上的烧杯中，收集上清液。接着，将此上清液与第一次的上清液合并。将样品在 1,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。然后，收集上清液，方法同前。弃去沉淀后，将含有粗线粒体的上清液在 10,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。小心冲洗掉松散的沉淀物，同时不要扰动紧实的部分。然后，用 10 毫升 MiBSM 缓冲液重悬紧实的沉淀物。向样品中加入 200 单位的无 RNase 的 DNase，以去除基因组 DNA，并将试管置于冷室中，在摇床上旋转 20 分钟，使样品均匀消化。将样品在 10,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟，并用 2 毫升 SEM 缓冲液重悬沉淀。将全部线粒体悬液加至蔗糖梯度顶部。按照文本方案离心梯度后，使用移液器小心收集在 32% 与 60% 蔗糖界面处迁移的棕色条带。本方案采用氮气空化法裂解细胞。掌握该技术后，可在九小时内完成大规模高纯度完整线粒体的分离，并可轻松针对不同细胞类型和规模进行修改和调整。将冻存的线粒体在冰上解冻后，向三毫升线粒体中加入两倍体积的裂解缓冲液。立即通过反复倒置离心管数次进行混匀。使用小型聚四氟乙烯玻璃匀浆器辅助裂解，并将匀浆液置于冰上孵育5至10分钟以完成反应。在4 °C条件下，以30,000 × g离心20分钟，去除不溶性物质。然后，小心收集上清液，并弃去沉淀。重复离心以确保上清液澄清。接着，再次小心收集上清液，并弃去沉淀。每毫升裂解物，通过向TLA-120.2超清晰管中加入0.4毫升蔗糖缓冲液，制备蔗糖垫。将约1毫升裂解的线粒体样品铺在每层蔗糖垫上，使裂解物与缓冲液的比例为2.5:1。然后，将样品在TLA-120.2转子中以231,550 ×g、4 °C离心45分钟。弃去上清液，用100微升重悬缓冲液冲洗管壁，以去除残留的蔗糖。将沉淀重悬，并合并至总体积为100微升的重悬缓冲液中。在重悬蔗糖垫沉淀时，必须在冰上操作，以避免样品受热以及产生泡沫，从而确保线粒体核糖体的结构完整性。将样品在低速下涡旋震荡30秒，以溶解残留的聚集体，然后在4°C条件下以17,949 × g离心10分钟。小心收集上清液，并重复离心步骤。测量A260处的线粒体核糖体吸光度后，将整个样品上样至一条线性蔗糖梯度管中。将样品在 TLS-55 转子中以 213,626 ×g 离心，4°C 下离心 120 分钟。为分离梯度，穿刺管底，逐滴收集样品至 96 孔板中。为获得足量的线粒体核糖体，其纯化过程不应超过七小时。如该不连续蔗糖梯度所示，纯化的线粒体迁移至32%-60%界面处的棕色下层条带。通过蔗糖梯度分离线粒体核糖体与可溶性线粒体复合物后，可鉴定出两种主要的线粒体核糖体群体：单体55S和大亚基39S。大亚基组分的存在表明细胞处于活跃分裂状态时被收获。该图显示了来自单体峰2的样品在每像素1.23埃校准放大倍数下的显微照片。此处展示的是初步处理后的数据，显示完整的单体。最后，该图还展示了单体的三维重建结果。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备完整的人类线粒体核糖体，用于结构与生化研究。我们的方案可获得高质量的终产物，且该方法可推广应用于其他线粒体大分子的制备。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

HEK 细胞 Mitoribosome 的快速分离

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快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

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通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

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无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。...

一种改进的线粒体接触位点分离方法

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

学习利用氮气空化裂解技术从HEK293S细胞中快速分离高纯度线粒体核糖体的方法。该技术仅需少量培养细胞即可完成大规模制备，适用于结构生物学研究和线粒体蛋白质合成机制探索。

快速分离HEK细胞中的线粒体核糖体

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