Name: 基因型衰老过程中正常人成纤维细胞活性氧和衰老相关分泌表型的定量测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学习利用流式细胞术和ELISA技术定量检测WI-38人成纤维细胞衰老过程中的活性氧水平及衰老相关分泌表型IL-6和IL-8，该方法适用于多种细胞衰老模型研究。

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本工作由韩国国家研究基金会资助（2015R1D1A1A01060839）（资助对象：Young Yeon Kim）以及由韩国政府（MSIT）资助的韩国国家研究基金会（NRF）项目（编号：2016R1A2B2008887，编号：2016R1A5A2007009）（资助对象：Jeanho Yun）。

1. 诱导癌基因诱导的衰老
<ol>
	<li>制备 H-RasV12 逆转录病毒
	<ol>
		<li>在室温下，向 100 mm 培养皿中加入 2 mL 0.001% 多聚赖氨酸/磷酸盐缓冲液（PBS），孵育 5 分钟以包被培养皿。</li>
		<li>使用连接真空泵的玻璃移液管吸除多聚赖氨酸溶液，并加入 2 mL 1× PBS 洗涤培养皿。</li>
		<li>在包被后的培养皿中接种 3 × 106 个嗜同种型 BOSC-23 包装细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于 37 °C、CO2 细胞培养箱中培养 1 天。</li>
		<li>次日，按照生产商说明书，使用转染试剂将 2 µg pBabe puro-H-RasV12 DNA 与逆转录病毒包装质粒 DNA（2 µg pGAG/pol 和 0.25 µg pVSVG）共转染，转染时间为 8 小时。</li>
		<li>移除转染培养基，加入 8 mL 新鲜培养基。</li>
		<li>48 小时后，收集含有病毒颗粒的培养基，并在 500 × g 条件下离心 5 分钟，去除细胞碎片。</li>
		<li>使用 0.45 µm 注射器滤器过滤含有 H-Ras 病毒的培养基。 
		注意：为确保高效的病毒感染，应避免病毒上清液的反复冻融。为获得最佳感染效率，建议使用当天收集的病毒进行感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 H-RasV12 逆转录病毒感染 WI-38 正常人成纤维细胞
	<ol>
		<li>在收集 H-RasV12 逆转录病毒前一天，将 5 × 104 个 WI-38 细胞接种于 60 mm 培养皿中，使用含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基，在 37 °C 培养 1 天。</li>
		<li>次日移除生长培养基，加入 1 mL 含 H-RasV12 逆转录病毒的培养基，并额外加入 1 mL 含 2 µL 多聚素（polybrene）储备液（8 mg/mL 溶于蒸馏水）的生长培养基。将样品置于湿度饱和、37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育 1 天。</li>
		<li>24 小时后移除 H-RasV12 逆转录病毒混合液，用 1× PBS 洗涤细胞两次。加入生长培养基，并在湿度饱和、37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中，用 2 µg/mL 嘌呤霉素处理细胞 2 天。</li>
		<li>嘌呤霉素筛选 2 天后，移除生长培养基，用 1× PBS 洗涤细胞两次。加入生长培养基，将细胞继续在湿度饱和、37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至指定时间点（示意图见 图 1A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 监测衰老 通过 衰老相关β-半乳糖苷酶染色
<ol>
	<li>配制以下储备溶液。
	<ol>
		<li>将5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-gal）以20 mg/mL的浓度溶于二甲基甲酰胺（DMF）中。溶液储存于-20 °C。</li>
		<li>将3.377 g的Na2HPO4·7H2O（126 mM）和0.708 g柠檬酸（36.8 mM）溶解于100 mL蒸馏水中，配制柠檬酸/磷酸钠缓冲液。必要时将pH调节至6.0。</li>
		<li>配制0.5 M的亚铁氰化钾溶液。避光保存于4 °C。</li>
		<li>配制0.5 M的铁氰化钾溶液。避光保存于4 °C。 
		注意：衰老相关β-半乳糖苷酶（SA β-gal）染色液的pH值对结果的准确性至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过稀释储备液，新鲜配制SA β-gal染色液，其中包含150 mM NaCl、2 mM MgCl2、5 mM亚铁氰化钾、5 mM铁氰化钾、20%（v/v）柠檬酸/磷酸钠缓冲液和1 mg/mL X-gal。</li>
	<li>移除培养基，用1× PBS洗涤细胞一次。在室温下用3%甲醛固定细胞5分钟。 
	注意：未感染逆转录病毒的细胞应作为阴性对照。未感染的对照细胞应持续传代以维持其增殖状态。</li>
	<li>移除固定液，用1× PBS洗涤细胞。加入新鲜配制的1× SA β-gal染色液（60 mm培养皿中加入1.5 mL）。用封口膜密封培养皿以防止干燥，并在37 °C孵育24小时。也可将培养皿置于湿盒中共同孵育。 
	注意：含3%甲醛的固定液应作为危险废物处理。建议使用无CO2的培养箱，以避免孵育过程中pH值发生变化。</li>
	<li>次日在显微镜下观察细胞染色情况；SA β-gal阳性细胞在核周区域呈现蓝色。 
	注意：增殖中的对照细胞中SA β-gal阳性细胞频率较低。若染色过浅，可适当延长孵育时间（代表性示例见图1B）。</li>
	<li>使用10倍或更高倍数的物镜，通过CCD相机获取SA β-gal染色图像。拍摄足够数量的图像以计算染色百分比（&#62;200个细胞）。</li>
	<li>通过统计SA β-gal阳性细胞数占总细胞数的比例，计算SA β-gal染色阳性细胞的百分比。 
	注意：SA β-gal染色实验应独立重复至少3次，并根据重复实验的结果计算平均值（见图1C）。合适的细胞密度对SA β-gal染色实验至关重要。过高的融合度可能干扰细胞向衰老相关形态的转变，并在对照细胞中引发假阳性信号。</li>
</ol>
3. 定量分析H-Ras诱导衰老过程中活性氧物种的产生
<ol>
	<li>接种 2 x 105 在60 mm培养皿中培养WI-38细胞，并按照步骤1所述诱导H-Ras介导的衰老。 
	注意：本方案可适用于其他类型的细胞衰老模型。</li>
	<li>在指定时间点（2、4 或 6 天）移除培养基，用 1× PBS 洗涤细胞。加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液处理细胞使其脱离，随后加入 1 mL 含 10% FBS 的生长培养基以终止胰蛋白酶反应。测定细胞数量。</li>
	<li>转移 1 × 105 将细胞转入15 mL锥形管中，于500 x g离心收集细胞 g 5 分钟。</li>
	<li>将50 µL的10 mM DCF-DA加入10 mL培养基中，配制新鲜的2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）染色液（DCF-DA的工作浓度为50 µM）。 
	注意：DCF-DA 对光敏感，应避免光照。DCF-DA 的浓度和染色时间可根据细胞类型进行调整。</li>
	<li>从15 mL锥形管中小心移除培养基，加入1 mL freshly prepared DCF-DA染色液。轻轻重悬细胞沉淀，于37 °C避光孵育30 min。设置未染色样本作为阴性染色对照。 
	注意：未用 DCF-DA 染色的增殖细胞应作为阴性对照进行制备。</li>
	<li>通过离心收集细胞，离心条件为 500 x g 5 分钟后用 2 mL 1×PBS 洗涤 1 次。用 1 mL 1×PBS 重悬细胞，并将样品转移至相应的荧光激活细胞分选（FACS）管中。</li>
	<li>使用配备适当激光光源的流式细胞仪检测2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF-DA）的荧光信号。采用蓝色激光（488 nm）激发样品，用530 ± 30 nm检测器（FITC）在对数尺度下检测发射荧光。
	<ol>
		<li>首先分析未染色的阴性对照细胞。在前向散射光（FSC）点图中 与 侧向散射（SSC），使用门控工具选择活细胞，并去除死细胞和细胞碎片。 
		注意：应在前向散射（FSC）点图中仔细监测细胞大小的变化 与 SSC。如果衰老细胞的尺寸显著增大，则应在点图的FSC中设门，选择相同尺寸的细胞群体后，再比较DCF-DA荧光强度 与 SSC</li>
		<li>单参数直方图显示DCF-DA（488 nm）荧光信号在对数尺度上的分布 x-轴，事件数量（细胞数）位于线性刻度上 y-轴，调节488 nm激光的电压，使未染色细胞的峰位于左侧边缘。</li>
		<li>分析DCF-DA染色样本，每份样本至少记录10,000个事件。使用流式细胞仪配套的分析软件获取每份样本的平均荧光值。 
		注意：ROS 测量应独立重复至少 3 次，并基于这些结果计算平均值。代表性 H-Ras 诱导的衰老结果如图所示 图2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用实时聚合酶链式反应分析衰老相关分泌表型中IL-6和IL-8 mRNA表达量的定量
<ol>
	<li>总RNA提取
	<ol>
		<li>接种 3 × 105&#160;在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，将WI-38细胞接种于100 mm培养皿，于37 °C组织培养孵箱中培养1天。每个时间点制备两份平行培养样本。</li>
		<li>通过步骤1所述方法，用H-RasV12逆转录病毒感染细胞以诱导衰老。</li>
		<li>收获前1天，用1×PBS洗涤细胞2次，并加入3 mL不含FBS的DMEM。 
		注意：此步骤旨在制备用于后续第5步所述ELISA实验的条件培养基。血清饥饿可能在某些敏感细胞中诱导IL-6和IL-8 mRNA的表达。因此，应首先比较经血清饥饿与未进行血清饥饿培养的细胞中IL-6和IL-8 mRNA的表达水平。若血清饥饿显著影响IL-6或IL-8 mRNA的表达，则用于qPCR的总RNA与用于ELISA的条件培养基应分别制备。</li>
		<li>24小时后收集各样本的条件培养基，并将培养基于-80 °C保存，用于ELISA检测。</li>
		<li>用1 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液处理细胞使其脱离，随后加入含10%胎牛血清（FBS）的1 mL培养基以终止胰蛋白酶活性。按照步骤5所述方法测定细胞数量，用于ELISA结果的归一化。将细胞收集至1.5 mL微量离心管中，以500 × g离心 g 5 分钟。</li>
		<li>用移液枪轻轻吸除培养基，加入1 mL RNA提取液。随后，剧烈涡旋离心管15秒。接着加入200 µL氯仿，再次剧烈涡旋混合物15秒。</li>
		<li>将样品管在17,000 x g条件下离心 g 4 °C下离心10分钟。然后，小心地将上层液体转移至新的1.5 mL微量离心管中。 
		注意：在将上层相转移至新管时，不得扰动中间相和下层有机相。</li>
		<li>加入400 µL异丙醇以沉淀RNA，轻轻倒置充分混匀。随后，将离心管于室温孵育10分钟。</li>
		<li>将离心管在17,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。然后弃去上清液，注意保留 RNA 沉淀。通过加入 1 mL 75% 乙醇洗涤 RNA，翻转离心管 2–3 次。在 17,000 x 重力下离心 5 分钟 g 4 °C下离心，弃去上清液。</li>
		<li>将RNA沉淀在室温下干燥，并用50 µL经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的去离子水溶解RNA。取1 µL RNA溶液，使用分光光度计测定总RNA浓度。 
		注意：过度干燥会降低RNA的溶解度，因此应避免RNA过度干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA 制备
	<ol>
		<li>在薄壁PCR管中，按以下组分配制每个样品的反转录反应体系：2 µg总RNA（用无RNase水调整体积至10 µL）、2 µL 10x RT缓冲液、1 µL随机引物（50 pmol）、0.8 µL 25x dNTP混合物（100 mM）、1 µL MMLV反转录酶（50 U/µL）以及5.2 µL无RNase水。</li>
		<li>在PCR仪上设置逆转录反应程序，条件如下：42 °C 反应60分钟，95 °C 反应5分钟。将PCR管放入PCR仪中，启动程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时聚合酶链式反应
	<ol>
		<li>配制所有反应的实时 PCR 预混液。每个样本的反应体系如下：25 µL 2x 实时 PCR 预混液，IL-6 或 IL-8 的正向引物和反向引物各 1 µL，以及 21 µL 无 DNase 和 RNase 的超纯去离子水。参见 表1. 
		注意：为每个样本配制实时 PCR 反应混合液，其中包含肌动蛋白 RNA 引物作为内参对照。GAPDH 也可用作标准化的内参对照。</li>
		<li>向96孔光学qPCR板的每个孔中加入48 µL预混液和2 µL用ddH2O进行3倍稀释的cDNA产物，每个反应设3个复孔。设置一个不含cDNA模板的对照孔作为PCR阴性对照。</li>
		<li>在实时荧光定量PCR仪上设置以下反应程序：95 °C 预变性10分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95 °C 变性15秒，60 °C 退火与延伸1分钟。</li>
		<li>进行实时 PCR 并记录阈值循环（CT) 值。使用 2⁻ΔΔCt 法计算 IL-6 或 IL-8 的 mRNA 水平。-ΔΔCΤ 方法20. 
		注意：使用以下公式，通过肌动蛋白（actin）水平进行标准化后，确定表达量的相对倍数变化： 
		倍数变化 = 2-Δ(ΔCT) 
		此处， 
		ΔCT = CT, IL-6 或 IL-8- CT, 肌动蛋白；以及 
		Δ(ΔCT) = ΔCT，刺激后-ΔCT, 对照</li>
		<li>计算每个重复样本的平均值。 
		注意：qPCR 实验应独立重复至少 3 次，并基于这些结果计算平均值。代表性 H-Ras 诱导的衰老结果如图所示 图3血清饥饿可能在某些敏感细胞中诱导 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达。因此，应首先比较经血清饥饿与未行血清饥饿培养的细胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表达水平。若血清饥饿显著改变 IL-6 或 IL-8 mRNA 的表达，则用于 qPCR 的总 RNA 和用于 ELISA 的条件培养基应分别制备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用ELISA定量分析衰老相关分泌表型中分泌的IL-6和IL-8蛋白水平
<ol>
	<li>按照步骤4所述，解冻从衰老的WI-38细胞中收集的3 mL条件培养基。在500 × g 条件下离心5分钟，去除细胞碎片。</li>
	<li>使用离心过滤装置，在3,000 × g 条件下离心20分钟，将条件培养基浓缩10倍。 
	注意：条件培养基的浓缩程度不一定取决于样本类型。</li>
	<li>使用每种浓缩后的条件培养基样品各50 µL，结合相应的IL-6和IL-8 ELISA试剂盒进行ELISA检测。 
	注意：每个样本应在两个ELISA孔中进行检测。由于在步骤4中每个时间点均进行了重复，因此该分析可同时监测ELISA实验和样本制备技术的变异情况。
	<ol>
		<li>进行ELISA板包被时，用1× PBS将IL-6或IL-8抗体稀释至IL-6为0.5 µg/mL、IL-8为0.125 µg/mL的浓度。向ELISA板的每个孔中加入100 µL稀释后的抗体。用ELISA板封板膜密封板子，并在室温下静置孵育过夜。</li>
		<li>通过抽吸去除抗体溶液。每孔用300 µL 1×洗涤缓冲液（含0.05% Tween-20的PBS）洗涤4次。向每孔加入300 µL封闭缓冲液（含1% BSA的PBS）。在室温下孵育1小时。</li>
		<li>通过抽吸去除封闭液。每孔用300 µL 1×洗涤缓冲液洗涤4次。在稀释缓冲液（含0.05% Tween-20和0.1% BSA的PBS）中配制ELISA标准品的系列稀释液，以生成标准曲线。 
		注意：IL-6的系列稀释浓度为31.25、62.5、125、250、500、1,000和2,000 pg/mL；IL-8的系列稀释浓度为2.34、4.69、9.38、18.75、37.5、75和150 pg/mL。</li>
		<li>向每孔加入100 µL标准品溶液或100 µL样本溶液（50 µL浓缩培养基与50 µL稀释缓冲液混合）。在室温下孵育2小时。</li>
		<li>通过抽吸去除标准品或样本溶液。每孔用300 µL 1×洗涤缓冲液洗涤4次。用稀释缓冲液将检测抗体稀释至IL-6为0.1 µg/mL、IL-8为0.25 µg/mL的浓度。每孔加入100 µL稀释后的抗体。在室温下孵育2小时。</li>
		<li>通过抽吸去除抗体溶液。每孔用300 µL 1×洗涤缓冲液洗涤4次。将链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）用稀释缓冲液稀释至0.05 µg/mL的浓度。每孔加入100 µL链霉亲和素-HRP溶液。在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>通过抽吸去除抗体溶液。每孔用300 µL 1×洗涤缓冲液洗涤4次。每孔加入100 µL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。在室温下孵育20分钟以显色，随后加入100 µL 1 M HCl终止液终止反应。</li>
		<li>使用ELISA读板仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度。</li>
		<li>根据所获得的标准品数据绘制标准曲线。依据标准曲线计算条件培养基中IL-6和IL-8的浓度。将结果按细胞数归一化后作图，并计算重复样本的平均值。 
		注意：ELISA实验应独立重复至少3次，最终的平均值应基于这些重复实验的结果（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了在H-Ras诱导的WI-38正常人成纤维细胞衰老过程中监测细胞内活性氧（ROS）水平的方法。利用细胞可渗透性试剂DCF-DA结合流式细胞术，可对活细胞内的ROS水平进行定量测定。DCF-DA进入细胞后，被细胞内酯酶去乙酰化，随后被ROS氧化，生成高度荧光的2',7'-二氯荧光素（DCF）。DCF的荧光信号可通过流式细胞仪的FL1检测器（绿色荧光）进行检测。采用DCF-DA染色法，我们成功检测到H-Ras诱导WI-38正常人成纤维细胞衰老过程中ROS水平的升高。该方法可用于多种细胞衰老模型，以监测ROS水平的变化。除DCF-DA染色外，其他已用于检测ROS诱导的方法还包括检测氧化蛋白的水平23以及利用ROS依赖性荧光染料进行共聚焦显微镜分析24。因此，建议结合其他方法进一步验证ROS水平的变化。
最近，我们已证明在p53诱导的衰老以及H-Ras诱导的衰老过程中，癌细胞内的活性氧（ROS）水平均升高21。细胞内ROS水平的升高早于SA...

50 多年前，Hayflick 和 Moorhead 发现，正常细胞在经过一定次数的分裂后，当其增殖潜能耗尽时，会进入不可逆的生长停滞状态1。这一现象如今被称为复制性衰老，被认为与机体衰老密切相关2。尽管端粒的进行性缩短被认为是导致复制性衰老的主要原因，但已有研究报道，多种细胞应激（如 DNA 损伤、癌基因激活和氧化应激）可诱导另一种类型的细胞衰老，称为&#34;早熟性衰老&#34;或&#34;应激诱导的衰老&#34;。有趣的是，在 H-Ras 和 BRAF 等癌基因激活时，早熟性衰老表现出强大的抑瘤作用。对小鼠模型和人类组织的研究提供了有力证据，表明细胞衰老的生物标志物主要存在于癌前病变中，这些病变中癌基因 Ras 和 BRAF 被激活，但在由这些病变发展而来的恶性肿瘤中则显著减少3,4,5。除了在衰老和抑瘤中的作用外，先前的研究还表明，细胞衰老在多种生理过程中发挥作用，包括伤口愈合、组织修复、免疫监视以及胚胎发育6。
尽管生长停滞已被广泛研究并作为细胞衰老的一个标志性特征7，但大量证据表明，细胞内活性氧（ROS）也参与了细胞衰老过程8。在多种类型的细胞衰老过程中，包括复制性衰老和癌基因诱导的衰老（OIS），ROS水平升高现象早在数十年前已有报道9,10。更直接的证据显示，使用亚致死剂量的外源性H2O2处理可诱导细胞发生衰老11,12。抑制ROS清除酶（如SOD1）的活性同样会导致早衰13。相反，在低氧环境中培养细胞或增强ROS清除能力可延缓衰老的发生10,14,15。这些结果明确表明，ROS是诱导细胞衰老的重要介质或决定因素。然而，ROS如何促进细胞衰老的启动，以及在细胞衰老过程中ROS水平升高的机制，仍有待进一步研究。
近期研究表明，衰老细胞可通过衰老相关分泌表型（SASP）对邻近细胞和组织产生强烈的旁分泌作用。16,17在衰老组织中，衰老细胞促进与年龄相关的组织功能障碍 通过 除了增殖细胞的自主性耗竭外，SASP 还可通过多种途径发挥作用。衰老细胞分泌的多种促炎因子（如 IL-6、IL-8、TGFβ 和基质金属蛋白酶（MMPs））可通过破坏组织稳态、损伤组织结构、诱导邻近细胞衰老以及引发无菌性炎症，导致与年龄相关的组织功能障碍。18,19然而，SASPs 的作用可能因生物学背景的不同而具有有益效应。此外，SASPs 的异质性取决于衰老细胞的类型及其所处的细胞阶段，这凸显了进一步研究的必要性。19.
本文介绍了基于细胞术的快速且灵敏的技术，用于检测OIS过程中细胞内活性氧（ROS）水平。此外，还引入了利用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析SASP因子的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV 逆转录酶</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 2x 混合液</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>随机引物</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-6 ELISA 检测试剂盒</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-8 ELISA 检测试剂盒</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>BEMIS&amp;nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax microplate reader</td><td></td></tr></tbody></table>

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

细胞衰老被认为是在增殖能力耗尽或暴露于各种应激因素后出现的一种不可逆的生长停滞状态。近年来的研究已将细胞衰老的作用扩展到多种生理过程，包括发育、伤口愈合、免疫监视以及与年龄相关的组织功能障碍。尽管细胞周期阻滞是细胞衰老的关键特征之一，但已有研究表明细胞内活性氧（ROS）生成增加在细胞衰老的诱导过程中也发挥着重要作用。此外，最近的研究发现，衰老细胞可通过一种称为衰老相关分泌表型（SASP）的机制，对邻近细胞和组织产生强烈的旁分泌作用。目前对针对细胞衰老的治疗策略兴趣迅速增长，这凸显了精确理解衰老机制（包括细胞内ROS和SASP）的必要性。本文中，我们描述了利用ROS敏感性荧光染料结合流式细胞术，定量检测H-Ras诱导的细胞衰老过程中细胞内ROS水平的实验方案。此外，我们还介绍了用于分析SASP因子mRNA表达诱导及其分泌的高灵敏度技术。这些方案可应用于多种细胞衰老模型。

H-Ras 诱导的衰老示例如图1所示。用 H-RasV12 逆转录病毒感染正常人成纤维细胞 WI-38 后，细胞出现显著的形态学改变（图1B）。此外，如图1C所示，SA β-半乳糖苷酶染色活性在表达 H-RasV12 后显著增强。在 H-RasV12 逆转录病毒感染 6 天后，超过 70% 的细胞呈现 SA β-半乳糖苷酶染色阳性，表明 H-RasV12 的表达可有效诱导 WI-38 细胞发生细胞衰老，这与我们及其他研究团队此前的报道一致21,22。
图2展示了利用DCF-DA染色分析监测H-Ras诱...

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。

细胞衰老被认为是在增殖能力耗尽或暴露于各种应激因素后出现的一种不可逆的生长停滞状态。

本实验的总体目标是提供灵敏的技术，用于监测细胞衰老过程中细胞内活性氧（ROS）水平以及衰老相关分泌表型（SASP）。本文展示了这些方法能够成功揭示在H-Ras诱导的WI-38正常人成纤维细胞衰老过程中，细胞内ROS水平以及SASP因子IL-6和IL-8的升高。这些技术可用于监测细胞衰老期间细胞内ROS水平的变化，并分析SASP因子的表达情况。该方法的主要优势在于可应用于多种不同的细胞衰老模型。因此，该方法最终有助于我们理解活性氧（ROS）和衰老相关分泌表型（SASP）在细胞衰老中的作用，并研究其潜在的调控机制。本实验操作将由我实验室的Young Yeon Kim和Jee-Hyun Um进行演示。开始此实验前，需先制备 H-Ras 逆转录病毒。首先，将亲嗜性 BOSC 细胞接种于经多聚-L-赖氨酸包被的培养皿中，并在 37°C 的组织培养孵箱中培养一天。次日，按照生产商说明书，使用转染试剂将 H-Ras 逆转录病毒 DNA 与包装用 DNA 共同转染至 BOSC 细胞中。转染8小时后，弃去转染培养基，加入8毫升新鲜培养基。48小时后收集含有病毒颗粒的培养基，通过离心去除细胞碎片。接着，使用0.45微米注射器滤器过滤含病毒的培养基。在收获H-Ras逆转录病毒的前一天，将WI-38细胞接种于60毫米培养皿中，并在37摄氏度培养箱中培养一天。次日，移除生长培养基，加入1毫升H-Ras病毒培养基。再加入1毫升含有2微升polybrene储存液的生长培养基，在CO2培养箱中继续培养一天。感染后24小时，移除病毒培养基，用PBS洗涤细胞两次，并加入生长培养基。为去除未感染的细胞，用每毫升2微克的嘌呤霉素处理细胞两天。通过稀释储备液配制新鲜的SA-β-半乳糖苷酶染色液。移除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。加入含甲醛的固定液，孵育 5 分钟。移除固定液，用 PBS 洗涤细胞。加入新配制的SA-β-半乳糖苷酶染色液，覆盖培养皿。用封口膜密封培养皿以防止样品干燥，并在37摄氏度、无CO2的培养箱中孵育。次日，在显微镜下观察细胞的染色情况。SA β-半乳糖苷酶阳性细胞的核周区域将呈现蓝色。使用CCD相机采集SA β-半乳糖苷酶染色图像，并通过计数至少200个总细胞中SA β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量，计算SA β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比。在60毫米培养皿中接种2 × 10⁵个WI-38细胞，通过感染H-Ras逆转录病毒诱导细胞衰老，具体操作如前所述。在需要测定活性氧的时间点，移除培养基，并用 PBS 洗涤一次。使用胰蛋白酶/EDTA 溶液处理使细胞脱落，并测定细胞数量。将 1 × 10⁵ 个细胞转移至 15 毫升锥形管中，通过离心收集细胞。小心移除培养基，加入一毫升新鲜配制的 DCF-DA 染色液。轻轻重悬细胞沉淀，在 37°C 避光孵育 30 分钟。通过离心收集细胞，并用 PBS 洗涤一次。用一毫升 PBS 重悬细胞，并将样品转移至流式管中。可使用配备 488 纳米蓝色激光器的流式细胞仪检测 DCF-DA 荧光信号。首先运行未染色的对照细胞样品。在前向散射与侧向散射的散点图中，使用设门工具选择活细胞，并排除死细胞和细胞碎片。接着，在显示 DCF-DA 荧光信号的直方图中，调节蓝色激光电压，使对照细胞的峰位于左侧边缘。然后，依次检测每个经 DCF-DA 染色的样本，并记录至少 10,000 个事件。按照先前所述方法，用H-Ras逆转录病毒感染细胞以诱导衰老。收获前1天，用PBS洗涤细胞两次。加入3毫升不含FBS的DMEM，于37摄氏度组织培养孵箱中继续培养细胞1天。24小时后，收集条件培养基，并于负80摄氏度保存，用于后续ELISA检测。用胰蛋白酶消化细胞，并通过离心将细胞收集至1.5毫升微量离心管中。采用常规RNA提取方法提取总RNA，并以2微克总RNA通过逆转录反应生成cDNA。进行实时 PCR 时，为所有含有 IL-6 或 IL-8 正向和反向引物的反应配制 SYBR Green PCR 主混合液。为每个样本配制含有肌动蛋白引物的反应混合液，作为内参对照。在 96 孔光学 qPCR 板的每个孔中加入 48 微升主混合液和 2 微升按 1:3 稀释的 cDNA 产物。每个反应均需设置三个重复。在实时定量 PCR 仪上设置实时定量 PCR 反应程序，并进行实时定量 PCR 扩增。运行结束后，收集阈值循环值（CT 值），并以肌动蛋白（actin）水平为内参进行归一化，计算 IL-6 或 IL-8 的 mRNA 表达水平。解冻先前从衰老的 WI-38 细胞收集的条件培养基。在 500 ×g 离心 5 分钟以去除细胞碎片。使用截留分子量为 3,000 道尔顿的离心过滤器将条件培养基浓缩 10 倍。使用相应的IL-6或IL-8 ELISA试剂盒进行ELISA实验。首先，将稀释后的IL-6或IL-8抗体包被到ELISA板孔中，并在室温下孵育过夜。每孔用洗涤液冲洗四次后，向各孔中加入封闭缓冲液，孵育一小时。将酶标板洗涤四次。加入系列稀释的ELISA标准品或浓缩的条件培养基样品，孵育两小时。洗涤酶标板后，依次与二抗和链霉亲和素-HRP偶联物孵育。每孔加入 100 µL TMB 底物溶液，在室温下孵育 20 分钟以显色。加入终止液终止反应。使用 ELISA 读板仪在 450 nm 波长下测定每孔的吸光度。绘制所制备标准品的标准曲线。根据标准曲线计算条件培养基中IL-6和IL-8的浓度。将结果按细胞数归一化后绘图。用H-Ras逆转录病毒感染WI-38正常人成纤维细胞可诱导细胞形态发生显著变化。超过70%的细胞呈现出SA-β-半乳糖苷酶染色活性，表明H-Ras表达可在六天内诱导WI-38细胞发生细胞衰老。DCF-DA染色分析显示，H-Ras表达还可显著增加细胞内活性氧（ROS）水平。H-Ras表达后两天即可观察到细胞内ROS水平升高，并持续维持至第六天。对代表性衰老相关分泌因子IL-6和IL-8进行的实时PCR分析显示，衰老的WI-38细胞中IL-6和IL-8的mRNA表达显著上调。通过ELISA检测条件培养基进一步证实，H-Ras诱导的衰老细胞中IL-6和IL-8的分泌也显著增加。通过癌基因表达、DNA损伤或氧化应激诱导细胞衰老通常需要六到八天。一旦细胞准备就绪，若操作得当，可在两小时内完成活性氧（ROS）的检测。熟练掌握这些技术后，可在一天内完成对SASP因子mRNA和蛋白质水平的分析。在分析活性氧（ROS）水平和SASP诱导时，需通过SA-β-半乳糖苷酶染色及必要时的其他方法来确认细胞衰老状态。此外，必须注意的是，ROS的增加发生在衰老的早期阶段，而SASP的形成则仅在细胞衰老完全建立后才可检测到。这些技术可应用于多种细胞衰老模型。观看本视频后，您应能充分理解如何在细胞衰老过程中分析活性氧水平及衰老相关分泌表型的诱导。

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

基因型衰老过程中正常人成纤维细胞活性氧和衰老相关分泌表型的定量测定

本视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于通过双衰老标志物定量治疗诱导的衰老癌细胞。衰老细胞的检测与定量涉及使用β-半乳糖苷酶底物。该底物被衰老细胞内活跃的溶酶体β-半乳糖苷酶切割，产生荧光产物，结合自发荧光的脂褐素颗粒，共同标记衰老的癌细胞。...

基于流式细胞术的治疗诱导癌细胞衰老定量分析

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。...

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。...

诱导与定量细胞衰老的技术

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。...

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

本方案描述了使用脉冲式SILAC对衰老细胞和非分裂细胞进行代谢标记、非靶向质谱分析以及蛋白质半衰期的简化计算的工作流程。...

通过代谢标记与质谱法测定衰老及非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。...

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

本方案介绍了利用反射光共聚焦显微镜对从人脂肪组织中分离的基质血管组分进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的客观、单细胞水平检测。该方法可与免疫细胞化学染色兼容，包含pH对照以实现定量评估，并且相较于传统的SA-β-gal染色，具有更高的灵敏度和更低的主观性。...

使用反射光检测脂肪基质血管组分中的衰老现象

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。...

利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

该方法研究衰老的皮肤成纤维细胞如何影响健康的成纤维细胞。通过UVB照射诱导细胞衰老，然后将条件培养基施加于正常成纤维细胞。该方法有助于评估靶向皮肤老化过程中异常细胞间通讯的生物活性化合物。...

一种新型抗氧化剂组合用于恢复细胞间健康通讯 体外 使用衰老细胞条件培养基的模型

学习利用流式细胞术和ELISA技术定量检测WI-38人成纤维细胞衰老过程中的活性氧水平及衰老相关分泌表型IL-6和IL-8，该方法适用于多种细胞衰老模型研究。

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

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