3维 (3 d) 印制的高吞吐量斑马鱼胚胎排列模板

在这里, 我们提出了一个设计和制造斑马鱼胚胎排列模板的协议, 然后详细的程序, 使用这种模板, 高吞吐量斑马鱼胚胎排列成96井板。

这种方法可以显着加快斑马鱼胚胎排列程序，并使斑马鱼真正适合高通量筛选。该技术的主要优点是使用 3D 打印模板将斑马鱼胚胎预先排列成 96 或 384 孔基质，这有助于实现高效的板制备过程。我们首先在进行纳米颗粒筛选时，通过手动将单个胚胎挑选到模块化板的每个孔中，从而产生了该方法的想法，并希望提高效率。

除了天宇，另一位研究生江岳也将演示该程序。从设计阵列模板开始此过程，该模板具有适合标准 96 孔板的 12 x 8 96 孔布局。如文本协议中所述。

使用精度为 0.1 毫米的 3D 打印机打印模板。模板的一些关键组件是截留室、截留井、真空室和进气口。为了进行斑马鱼胚胎产卵，首先用透明的塑料隔板将雄性和雌性分开。

然后，在产卵前一天在每个交配箱中放置两对雄鱼和雌鱼。产卵当天，早上取下隔板，将雄鱼和雌鱼混合在一起。取出雄鱼和雌鱼，并使用细网过滤器收集斑马鱼胚胎。

用 250 毫升鸡蛋水清洗胚胎。使用 Holtfreter 溶液将收集的胚胎转移到培养皿中。使用立体显微镜去除死亡和未受精的胚胎。

将胚胎放入 28.5 摄氏度的培养箱中。受精后 4 小时，观察胚胎并去除任何死亡和不健康的胚胎。胚胎现在已经准备好进行下一步了。

用 500 毫升去离子水清洗模板 2 到 3 次，然后将其放入干燥箱中 5 分钟。然后，用一块密封膜粘住底部腔室。通过模板底部的出风口连接真空泵，在密封膜密封的腔室中产生负压。

使用塑料移液管，将大约 150 个胚胎放入模板中。水平摇动整个模板，直到每个孔都捕获了一个胚胎。在此步骤中，检查并确保每个可用的斑马鱼胚胎至关重要。

如果 Holtfreter 缓冲液非常低，可以通过摇动模板来添加额外的缓冲液。丢弃额外的 Holtfreter's Solution 和未被困在孔中的胚胎。关闭并断开真空泵。

将标准 96 孔板倒置在模板上，并同时旋转两者。轻敲模板底部或将空气出口连接到压缩气体除尘罐，将所有捕获的胚胎从模板转移到 96 孔板。最后，撕掉密封膜，用 500 毫升去离子水从上到下清洗模板 3 次以备将来使用。

此处显示的是按模板排列的 96 孔板的部分图像。相反，该图像显示了手动排列的 96 孔板的部分图像。通过手动和排列模板方法接种后胚胎的整体健康状况显示在此处。

根据胚胎的孵化率、存活率和畸形率，在这两种情况下都没有观察到对胚胎整体健康状况的显着影响。一旦掌握，如果作得当，该技术将在两到三分钟内制备一个 96 或 384 孔板。该技术经过开发，为研究人员充分利用这种模式生物的新特性，真正实现体外高通量筛选铺平了道路。