Name: 无珠光高音喇叭在食子胚胎中的细胞力学探测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解光镊与光片显微镜联用技术，用于在活体果蝇胚胎中直接测量细胞间力学特性。该方法无需微珠注射，可实现实时张力测定与流变学分析，为发育生物学研究提供微创手段。

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本工作得到了法国医学研究基金会（FRM）团队资助项目FRM DEQ20130326509、法国国家科研署（ANR-Blanc）资助项目以及Morfor ANR-11-BSV5-0008（授予P.-F.L.）的支持。我们感谢由法国国家科研署资助的法国生物成像基础设施（«投资未来»项目，编号ANR-10-INBS-04-01）。我们感谢PICSL-FBI基础设施的Brice Detailleur和Claude Moretti提供的技术协助。

1. 设置光片显微镜
<ol>
	<li>请参考先前出版物中对装置的描述25。 
	注意：该装置由一个直立式显微镜载物台和一个在水平面内产生光片的光片模块组成。一个10倍激发物镜将光片导入玻璃比色皿中（图4）。检测物镜具有高数值孔径（1.1），这对于高效的光镊操作至关重要（见下文）。</li>
</ol>
2. 设置光镊光路
注意：图1展示了光学装置的总体示意图。
<ol>
	<li>将1070 nm激光器单元放置于光学平台上，并使用V型夹具固定光纤。确保光纤准直器与光学平台平行（即水平），且此处选定的高度将作为光学平台上所有光学元件对准时的高度基准。 
	注意：100 mm 可能是该高度的一个合适选择。</li>
	<li>转动红外激光器单元的钥匙并按下“选择”按钮，以打开校准指示器。光纤出射的光束必须保持水平。</li>
	<li>将快门置于光路中，并将其固定在光学平台上，使红外激光束通过快门的孔径。确保光学平台与快门孔径中心之间的距离为步骤2.1中选定的高度。</li>
	<li>转动快门控制器的钥匙，使用箭头选择手动模式，然后按下“Enable”按钮以打开快门。</li>
	<li>放置、对准并固定第一面振镜。 
	注意：两个检流计镜必须与检测物镜的后光瞳共轭，以便当其中一个镜面旋转时，激光束不会偏离物镜的后光瞳。需计算第一个检流计与物镜后光瞳之间的距离，以确定该检流计相对于物镜的位置（f1+f1+f2+f2+f3+f3+f4+f4 = 30+30+30+30+30+200+200+500+500 = 1550 mm；其中fi表示第n个透镜的焦距）°i).</li>
	<li>打开检流计电源。确保在后续的对准流程中检流计始终保持供电。</li>
	<li>将检流计调至零偏转位置（使用 NIMAX 或光镊软件——检流计连接方式见步骤 3）。</li>
	<li>放置、对准并固定由两个焦距为30 mm的透镜组成的中继望远镜。</li>
	<li>放置、调整并固定第二个检流计镜。注意两个检流计之间的距离为 4f = 4 × 30 mm = 120 mm（f = 焦距）。</li>
	<li>放置并固定望远镜。 
	注意：该望远镜由两片透镜组成，用于将光束扩展至至少等于物镜后孔径直径的宽度。焦距最短的透镜应置于前方。</li>
	<li>将潜望镜放置、对齐并固定，使光路向上移动，更接近二向色镜导轨的入口。</li>
	<li>将热反射镜固定在导轨上，然后将导轨放入显微镜中。确保导轨右侧已切割，以便红外激光进入图2).</li>
	<li>检查激光是否从显微镜射出，先在无物镜的情况下检查，再在装有物镜的情况下检查。使用潜望镜的底部反射镜校正物镜前的激光位置，使用潜望镜的顶部反射镜校正物镜后的激光位置。</li>
	<li>放置 1 µL 在玻璃比色皿中加入500 nm的荧光微球，并加入10 mL蒸馏水。将比色皿置于比色皿架中的物镜下方，调节物镜的焦距（Z轴位置），使物镜接触水面。</li>
	<li>启动由声光可调滤光器（AOTF）、相机和压电位移台控制的自制软件进行图像采集。也可使用如MicroManager之类的免费软件。通过点击“Live”按钮开启实时采集模式。</li>
	<li>将红外激光功率调节至 1 W。</li>
	<li>戴上护目镜（在实验结束前不得取下），然后打开激光器。应有微珠被捕获在激光焦点处。
	<ol>
		<li>若在激光焦点处未捕获到微珠，请检查红色激光指示器（与红外激光共线）是否从物镜射出。若未射出，请重新执行校准步骤，特别是步骤 2.13；或者，提高红外激光功率。</li>
		<li>如果微珠被困在焦平面之外（成像平面），请轻轻移动最后一组望远镜中最后一个透镜（L4）的位置 图1) 沿光轴方向移动，使微珠与成像平面共焦。如果调节范围不足，则移动最后一组望远镜中的第一个透镜（L3） 图1沿光轴方向。</li>
		<li>如果被捕获的微珠未位于图像中心，可使用两个潜望镜反射镜调节光阱位置。若通过改变第一面反射镜的角度来调整微珠位置，则需相应改变第二面反射镜的角度以补偿光束方向。先校正X方向位置（每面反射镜各一个螺钉），再校正Y方向位置（每面反射镜各一个螺钉）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如有必要，调整2的位置nd 望远镜镜头观察微珠，使其处于焦点位置。</li>
	<li>如有必要，调整潜望镜反射镜的角度，使微珠位于图像中央。</li>
</ol>
3. 仪器连接
注意：图3展示了美国国家仪器公司（NI）数据采集卡连接的总体示意图。
<ol>
	<li>将输出卡（NI-9263）插入机箱（cDAQ-9178）的第一个插槽中。请注意，也可使用其他型号的NI卡，只要其具备至少2个模拟输出和3个模拟输入即可。</li>
	<li>将输入卡（NI-9215）插入机箱的第二个插槽中。</li>
	<li>使用BNC电缆将第一个检流计连接至模拟输出AO0和模拟输入AI0。注意可使用T型转接头将两条BNC电缆连接至同一接口。请参考检流计手册以确定检流计驱动板上的引脚位置。</li>
	<li>以相同方式，将第二个检流计连接至AO1和AI1。</li>
	<li>将PFI1连接至快门的触发输入端（控制器背面）。</li>
	<li>将PFI0连接至相机的触发端以及AI2。</li>
	<li>将AI3连接至快门的触发输出端（控制器背面）。</li>
	<li>调整快门控制器的设置。使用方向键更改参数值，并按下“Select”按钮以确认选择并进入下一个参数。将“time open sec”参数设为000.000，“time closed sec”设为000.000，“mode”设为SINGLE，“trigger”设为EXT。按下“Enable”按钮以启用对快门的控制。</li>
	<li>打开QtCreator（从 https://www.qt.io/ 下载，免费版本）。 
	注意：QtCreator是用于开发光镊软件的C++集成开发环境。此处使用Qt库创建界面控件（widgets）。</li>
	<li>打开OT.pro项目文件（包含在提供的Qt代码文件中）。此操作将加载整个项目。根据所使用的NI卡，在AOGenerator.cpp文件中修改输入和输出的名称。</li>
	<li>编译并运行OT软件。</li>
</ol>
4. 使用微珠校准光镊位置
<ol>
	<li>校准视频的录制
	<ol>
		<li>在玻璃比色皿中加入 1 µL 的 500 nm 红色荧光微球，然后用 10 mL 去离子水充满比色皿。图 4 展示了观察环境下的比色皿示意图。</li>
		<li>将比色皿固定在压电位移台上。</li>
		<li>调节比色皿的 Z 轴位置，使检测物镜浸入水中。</li>
		<li>打开红外激光器，并将功率设置为 1 W。</li>
		<li>启动图像采集软件。</li>
		<li>为采集延时图像，需设置曝光时间、增益、两幅图像之间的时间间隔、采集图像总数以及激光功率。注意，在使用微球进行光镊校准时，无需使用激发激光（561 nm）。红外激光诱导的双光子效应已足以激发被捕获微球的荧光。</li>
		<li>启动自行开发的光镊控制软件。</li>
		<li>设置光镊参数以生成圆形轨迹。将采样率（SamplingRate）设为 250 samp/s，缓冲区大小（bufferSize）设为 1000，波形1参数（galvo 1）设为正弦波形，周期数（nbPeriod）为 1，振幅 0.5 V，相位 0.0 rad，偏移量（Offset）0.0 V；波形2参数（galvo 2）设为正弦波形，周期数（nbPeriod）为 1，振幅 0.5 V，相位 1.57 rad，偏移量（Offset）0.0 V。</li>
		<li>勾选“AI Parameters”选项框，以及“Wait for it”… 选项框。</li>
		<li>开始图像采集（以高帧率如 10 fps 采集 500 或 1000 帧图像）。</li>
		<li>按下“Generating!”按钮，启动光镊系统。</li>
		<li>让被捕获的微球完成至少两个完整的圆周运动，然后松开“Generating!”按钮以停止光镊操作。</li>
		<li>停止图像采集。请注意，默认情况下会生成一个 tiff 格式的视频文件和一个包含检流计电压数据的文本文件，存储于“C:/TEMP/”文件夹中（除非指定了其他路径）。如有需要，可创建多个校准视频及其对应的数据文件。
		<ol>
			<li>如果圆周轨迹不完整，说明微球在运动过程中丢失。可能是速度过高所致，可通过降低光镊软件中的采样率来减慢速度。或者，使用红外激光器的红色指示激光，检查在整个圆周运动过程中激光是否始终从物镜出射。若否，则检流计镜面可能未与物镜的后焦平面共轭。应重新调整检流计相对于物镜后焦平面的位置，并从步骤 2.5 开始重复对准步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将振幅设为零，并开启激光器以在固定位置捕获一个微球。在捕获位置标记一个参考点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过图像分析进行位置插值
	<ol>
		<li>打开 Matlab，进入校准文件夹，运行“position2tension”脚本（该脚本包含在提供的 Matlab 代码文件中）。此脚本用于计算将检流计电压转换为光阱位置的插值函数。</li>
		<li>选择将使用的校准视频数量。可以选择多个具有不同轨迹的视频，例如两个相互垂直的椭圆轨迹。通常，单个具有圆形轨迹的校准视频已足够。</li>
		<li>在对话框中输入每段视频的第一帧和最后一帧图像编号（每个视频对应一个对话框），应选择轨迹清晰且信噪比较高的图像序列。</li>
		<li>提供每个视频采集过程中记录电压数据的文本文件路径。注意，该脚本会读取文件并计算每幅图像对应的两个检流计的平均电压值。</li>
		<li>提供对应的校准视频文件路径。 
		注：该脚本通过自定义函数及从 MTT26 提取的函数，对微球图像进行二维高斯拟合，以亚像素精度检测微球位置，并显示微球运动轨迹图。</li>
		<li>通过点击方式剔除任何检测不良的点（异常值）。</li>
		<li>检查脚本计算并显示的 X 和 Y 方向激光位置的插值图是否完整。如果存在大量缺失值（图中出现白色区域），请使用信噪比更高和/或检流计运动速度更慢的新校准视频重复该操作。 
		注：这些图像和插值数据会自动保存在与视频相同的文件夹中，文件名为 convertFct.mat。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 封片 果蝇 胚胎27
<ol>
	<li>从培养箱中收集在 25 °C 下培养的 Drosophila 胚胎。</li>
	<li>通过筛网（孔径约为 100 µm）过滤培养皿内容物，去除酵母。</li>
	<li>用 100% 次氯酸钠溶液（2.6% 次氯酸钠）清洗胚胎 45 秒，以去除卵壳。</li>
	<li>用清水清洗胚胎 2 分钟。</li>
	<li>用毛笔将胚胎转移至琼脂垫上。</li>
	<li>根据所需发育阶段挑选约 10 个胚胎，并使用解剖针或湿润的毛笔将胚胎排列整齐。 
	注意：排列时应根据感兴趣区域进行调整（使感兴趣区域尽可能靠近检测物镜）。</li>
	<li>使用金刚石刻划笔切割一块尺寸为 10 × 20 × 1 mm3 的玻璃载片。</li>
	<li>在切下的玻璃片一侧涂上胶水，静置干燥 20 秒。</li>
	<li>将切下的玻璃片翻转，放置在胚胎排列线上，使其粘附在载玻片边缘。</li>
	<li>将此样品安装至样品架中，并放入比色皿内。图 4 展示了观测状态下比色皿的示意图。</li>
	<li>将比色皿放置在压电载物台上。</li>
</ol>
6. 捕获实验 在体实验 
<ol>
	<li>细胞接触的捕获——振荡（图5）
	<ol>
		<li>在组织中找到感兴趣的区域。 
		注意：如果需要在黏附连接平面内操作，使用钙黏蛋白被标记的果蝇会有所帮助。</li>
		<li>使用压电载物台将目标连接处的中点移动至光阱位置（在步骤4.1.14中设定的标记位置）。</li>
		<li>设置光阱参数，以实现垂直于接触线方向的振荡。将相位设为零。在X和Y方向上设置振幅，使运动方向垂直于接触线，振幅通常为0.1 V。</li>
		<li>开始图像采集（使用较快的帧率，例如10 fps）。</li>
		<li>按下“Generating!”按钮，开启光镊。</li>
		<li>操作完成后，关闭光镊并停止图像采集。此时，指定文件夹中应出现一个视频文件和一个包含采集期间检流计电压值的文本文件。</li>
		<li>细胞接触的捕获——拉伸-释放（图6）</li>
		<li>在组织中找到感兴趣的区域。</li>
		<li>使用压电载物台移动目标连接，使其中点通常距离光阱位置约1 µm（即步骤4.1.14中设定的标记位置）。</li>
		<li>将振幅设为0，以形成稳定的光阱。</li>
		<li>开始图像采集（使用较快的帧率，例如10 fps）。</li>
		<li>按下“Generating!”按钮，开启光镊。</li>
		<li>经过所需时间后，关闭光阱并等待组织松弛。</li>
		<li>停止图像采集。此时，指定文件夹中应出现一个视频文件和一个包含采集期间检流计电压值的文本文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自动生成明渠图及界面位置的半自动检测。
	<ol>
		<li>在Matlab命令窗口中，加载校准过程中生成的插值图（步骤4b）：load('convertFct.mat')。该操作将提供fx和fy变量。</li>
		<li>在Matlab命令窗口中运行提供的autokymo(fx,fy)函数（包含在Matlab代码文件中）。该函数的目的是沿激光轨迹生成明渠图，并以亚像素分辨率检测每一帧中接触线的位置。</li>
		<li>选择提示的包含电压值的文本文件路径。</li>
		<li>选择待分析视频的第一帧和最后一帧编号。</li>
		<li>选择tiff格式的视频文件。系统将显示两个新图像：第一个是明渠图的图像；第二个是接触线位置与激光位置随图像编号变化的曲线图。 
		注意：该函数会保存表示样品位置和激光位置随图像编号变化的图形（matlab图形、jpg格式）、明渠图（tiff图像）以及包含激光位置的明渠图（tiff图像）。对于稳定光阱实验，明渠图需手动生成，例如使用ImageJ软件，之后可利用相同算法从明渠图中检测界面位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 机械测量
<ol>
	<li>刚度与张力测量
	<ol>
		<li>进行振荡实验（步骤 6.1）以及对应的时间序列图像分析（步骤 6.3）。</li>
		<li>使用 Matlab 绘图函数或任何数据绘图软件，绘制界面位置 <img alt="静力平衡方程：ΣFx=0。数学符号，用于教学。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"> 随光阱位置 <img alt="时间依赖变量 \(X_t\)，表示动态系统或随机过程的符号。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3"> 变化的曲线。 
		注：该关系应近似呈线性。</li>
		<li>使用 Matlab “ezfit” 免费工具箱或任何支持拟合功能的软件进行线性拟合。拟合斜率的倒数即为平均比值 <img alt="静态过程分析图中的平衡方程 \(x_t/x_m\)。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5">。</li>
		<li>估算界面的表观弯曲刚度，在假设小变形且捕获势能为二次型的前提下，其表达式为 <img alt="动态分析与动力学建模研究中的数学方程 km=kt(xt/xm−1)。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 6">。其中 <img alt="静力平衡公式；公式中代表动能的符号 k_t。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 7"> 为光阱刚度（光阱刚度校准见步骤 8）。</li>
		<li>估算张力，其定义为23： 
		<img alt="静力平衡公式 T=(ktlo/4)((xt/xm)-1)=kmlo/4，用于张力分析。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 8">。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流变学测量
	<ol>
		<li>进行拉伸-释放实验（步骤 6.2）以及对应的数据分析（步骤 6.3）。</li>
		<li>使用自定义流变学模型对所得曲线进行拟合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 捕获刚度的校准
注意：确定绝对力需要了解界面上的捕获刚度。这可以通过微珠采用两步法来实现。
<ol>
	<li>细胞质黏度的测定
	<ol>
		<li>将胚胎置于卤代烃油中，使用显微注射装置注入荧光聚苯乙烯微球（1:1,000 原液稀释，直径 0.46 µm）23,27。</li>
		<li>将注射后的胚胎置于显微镜下。</li>
		<li>追踪细胞质中单个微球的运动。提取微球的均方位移（使用大量轨迹，>100 个微球）。根据均方位移曲线的斜率确定微球的扩散系数。利用斯托克斯-爱因斯坦方程将扩散系数与黏度关联，推导出细胞质的有效黏度。在早期胚胎中，报道的黏度约为 3.5 Pa·s23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微球上光镊捕获刚度的测定
	<ol>
		<li>使用光镊在细胞质中捕获单个微球。</li>
		<li>以步进方式将微球在两个相距 0.5 µm 的捕获位置之间移动。</li>
		<li>通过微球从一个捕获位置松弛至另一个位置时的阻力系数与松弛时间之比，确定微球上的捕获刚度。 
		注：阻力系数为 <img alt="流体力学公式，6πηR，与流体动力学和黏度概念相关。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 9">，其中 <img alt="流体力学方程中的 η 符号；用于通道流动研究中的效率分析示意图。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 10"> 为步骤 (8.1) 中测定的黏度，<img alt="瑞利散射公式：I(θ) ∼ λ⁻⁴，用于光学测量的分子光谱图。" src="/files/ftp_upload/57900/57900eq13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 13"> 为微球半径。松弛时间通过使用 Matlab 或其他拟合软件对微球位置进行指数拟合获得。在 200 mW 激光激发下，典型的捕获刚度值为 120 ±50 pN·µm-1 。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞界面光镊捕获刚度的测定
	<ol>
		<li>将激光聚焦于接触线，并使其发生偏转（如步骤 6 所述）。测量形变幅度。应在多条接触线上重复该操作，以获得具有代表性的平均值。</li>
		<li>将由此产生的形变与微球推动接触线所引起的形变进行比较。由于形变与捕获刚度成反比，由此推导出细胞接触处的捕获刚度。 
		注：细胞接触处的捕获刚度通常比微球（直径 0.46 µm）上的捕获刚度小 2 至 3 倍。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation%2C+transmission%2C+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

光镊技术能够以非侵入性方式直接在发育中的胚胎上皮组织内进行绝对力学测量。与其它方法相比，该技术具有优势：例如激光消融法具有侵入性且仅能提供相对测量结果，磁力法需要注射操作，而力学推断法则依赖较强的假设条件，且同样只能提供相对测量结果。
该方案包含几个关键步骤。首先，由于物镜可能存在色差，且激光捕获会将物体推向&#34;下游&#34;方向，因此必须确认红外激光能够在成像平面上捕获微珠，并在必要时进行校正（步骤 2.18）。其次，该方法依赖于对细胞接触位置的测量，因此使用高对比度的荧光标记物至关重要。
物镜和激光束的质量对有效捕获至关重要。物镜的数值孔径应超过1.0。如果捕获效果不佳，请确保激光束充满物镜的后光阑。
我们的方法存在若干局限性。首先，目前尚不清楚光学捕获的支撑机制究竟是什么。尽管检测到了折射率的不匹配，但其来源仍有待确定。其次，如果需要进行绝对测量，则校准过程可能较为繁琐，因为它需要进行被动微流变学实验，并对微珠上的捕获刚度进行校准。需要认识到，细胞接触部位的刚...

胚胎发育是一个高度可重复的过程，在此过程中，细胞和组织发生形变，从而塑造未来的动物形态。研究表明，此类形变需要细胞水平上主动产生作用力1,2。因此，要理解细胞和组织发生形状变化的形态发生过程，关键在于评估相关细胞的力学特性，并测量该过程中组织内部的作用力3,4。上皮层，尤其是Drosophila的上皮层，因其近似二维的几何结构和易于操作的特点，已被广泛研究。
因此，我们及其他研究者开发了多种技术来评估上皮力学特性 体内 在发育过程中，我们将简要概述上皮组织研究中常用的三种主要技术。激光消融是一种广泛应用的方法，可用于揭示细胞连接处的局部机械应力。5,6,7,8 或更大规模9,10,11 通过进行局部切割以破坏目标的机械完整性。切割后开口的动力学变化可提供消融前应力状态以及组织流变学的相关信息。12,13激光消融的一个缺点是具有侵入性，因其需要局部破坏细胞皮层。因此，若要保持组织完整性，只能进行有限次数的消融操作。另一个缺点是，消融只能提供细胞接触处张力的相对估计值，因为开口速度依赖于通常未知的黏性摩擦。磁操控技术也已发展并应用于 果蝇，涉及铁磁流体的使用14 或超顺磁性脂质体15。它们能够提供绝对测量值16,17，但具有侵入性，因为需要在目标位置注射探针。这在某些系统中可能非常困难，因为并非所有系统都适合进行精确注射。第三种技术是力推断，完全非侵入性18,19,20推断力依赖于三重点（三细胞连接点或顶点）处力学平衡的假设，通过求解一个逆问题，可推断出所有细胞-细胞接触处的张力（并可能推断出所有细胞内的压力）。对于张力而言，每个顶点提供两个方程（X 和 Y 方向），从而形成一个大型线性方程组，在满足一定条件下可通过矩阵求逆来评估所有细胞接触处的张力。尽管该方法极具吸引力，因其仅需一幅已分割的图像，无需额外实验或设备，但其准确性仍有待确定；此外，除非进行绝对校准测量，否则该方法仅能提供相对值。
为了克服其中一些局限性，本文介绍了一种将光镊与光片显微镜耦合的装置，用于在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎上皮中对细胞尺度施加可控力。光镊已被广泛应用于多种生物学研究，包括单个蛋白质的测量以及细胞器和细胞的操控21。本文报道了施加数十分皮牛（pN）范围内的力，该力虽小，但足以诱导细胞连接处的局部形变，并实现活体内的力学测量。in vivo。通常，我们通过分析明场图像的时间-空间图（kymograph）来监测细胞连接的垂直偏转，从而建立力与形变之间的关系。重要的是，本装置无需将微珠注射到组织中的目标位置，因为光镊可直接对细胞间连接施加作用力。将光镊与光片显微镜耦合，能够实现快速成像（每秒数帧），这对于短时间尺度下的力学分析极为有利；同时，由于照明仅限于成像平面，光毒性显著降低22。
总体而言，光镊是一种非侵入性技术，可在活体果蝇（Drosophila）胚胎中对细胞接触部位施加可控的力，并提取细胞接触处的力学信息，例如刚度和张力23、流变特性24以及张力的梯度或各向异性23。

<table><tbody><tr><td>镱光纤激光器，线偏振，10 W，连续波</td><td>IPG Laser</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>包含线偏振准直器：光束直径 D = 1.6 mm，以及红色导向激光器</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1/2&quot; 光束快门</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>小光束直径振镜系统</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 个用于 X 方向位移，1 个用于 Y 方向位移</td></tr><tr><td>一维或二维振镜系统线性电源</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>振镜电源</td></tr><tr><td>两个焦距 f = 30 mm 的透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>两个振镜之间的中继望远镜</td></tr><tr><td>透镜 f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5 倍望远镜</td></tr><tr><td>透镜 f = 500 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5 倍望远镜</td></tr><tr><td>带螺纹笼杆孔的运动学直角椭圆镜安装座</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td><td>潜望镜结构</td></tr><tr><td>激光防护眼镜，浅绿色镜片，可见光透过率 59%，通用款式</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>入射角 45&amp;deg;，直径 50.0 mm，热反射镜</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>多光子发射器 HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>CompactDAQ 机箱</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>C 系列电压输出模块</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263</td><td>模拟输出模块</td></tr><tr><td>C 系列电压输入模块</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>模拟输入模块</td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基修饰微球，0.5 &amp;micro;m，红色荧光（580/605），2% 固含量</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td><td>校准微珠</td></tr><tr><td>基于 C++ (Qt) 自主开发的光镊软件</td><td></td><td></td><td>由 Olivier Blanc 和 Claire Chard&amp;egrave;s 开发。替代方案：LabVIEW</td></tr></tbody></table>

利用无微珠光镊技术探测细胞力学特性 果蝇 胚胎

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

形态发生需要遗传模式与机械力之间的协调，以稳健地塑造细胞和组织。因此，理解形态发生过程的一个挑战在于，如何在胚胎发育过程中直接测量细胞内的作用力和机械特性。in vivo。本文介绍了一种将光镊与光片显微镜耦合的实验装置，可在以每秒数帧的速度成像的同时，直接对早期Drosophila胚胎中的细胞-细胞接触施加作用力。该技术的优势在于，无需向胚胎内注射通常用作光力作用中介探针的微珠。我们逐步详细描述了该装置的搭建过程，并提出了从实验中提取力学信息的分析工具。通过实时监测细胞-细胞接触处的位移，可进行张力测量并研究细胞接触的流变特性。

图5展示了通过对光阱施加正弦运动所获得的实验数据。光阱会引起界面的偏转，如三个连续界面位置的快照所示（图5A）23。记录的视频用于生成明场时空图（图5B），并进一步分析以确定界面位置，空间分辨率达到亚像素级别，分析方法是对每一帧图像在x方向上进行高斯拟合。在小形变条件下，光阱位置与界面位置呈正比关系（图5C）。界面偏转幅度相对于光阱振幅的比值（图5D）可用于测定界面张力或刚度（见步骤7.1）。
图6展示了通过拉伸释放实验获得的实验数据。光镊被开启在距离...

我们介绍了一种将光镊与光片显微镜耦合的装置，及其在无微珠条件下用于探测细胞力学特性的应用 果蝇 胚胎

形态发生需要基因模式形成与机械力之间的协调，以稳定地塑造细胞和组织。因此，一个挑战是……

该方法有助于解答组织力学中的关键问题，例如在组织形态发生过程中细胞间连接的特性如何随空间和时间发生变化。该技术的主要优势在于其侵入性较弱，并且可与活体成像技术（如光片显微镜）兼容。该技术无需向组织内注射微珠。通常用作获取冰冻切片的半成品探针，我感到非常兴奋。本次演示将由查德斯（Chardes）——一名工程师，以及拉斐尔·克莱门特（Raphael Clement）——我所在地形级别的一名研究科学家共同完成。首先，在水平面内搭建用于光片显微成像的直立显微镜系统，随后调整激光与光学元件，使其作为光镊使用。接下来，将一微升500纳米的荧光微球注入玻璃比色皿中，并加入10毫升蒸馏水。将比色皿放入物镜下方的比色皿支架中，调节物镜焦距，使物镜接触水面。然后，打开用于控制采集软件的集成开发环境QT Creator。打开 microRheo. 配置文件以启动采集软件，并通过选择“live”来开启实时采集模式。在打开激光器之前，需佩戴安全护目镜，然后将激光功率调节至1瓦，并开启激光器。实时画面现在应显示微珠被捕获在激光焦点处。如有必要，可调节第二个望远镜透镜的位置，以使微珠处于清晰对焦状态。也可能需要调整潜望镜调节装置的角度，使微珠位于图像中央。按照随附文本方案中的图三所述，准备数据采集板和路缘连接。在光学快门接口上，将“时间开启（秒）”参数调整为 000.000，“时间关闭（秒）”参数调整为 000.000，模式参数设为 single，触发参数设为 EXT。设置完成后，选择启用按钮。在 QT Creator 中，打开 ot.profile 以打开项目。在 aogenerator 中更改输入和输出的名称。cpp 文件以匹配您设置中使用的 MI 卡。最后，编译并运行光镊软件。在采集软件中，选择所需的曝光时间、游戏模式、两幅图像之间的时间间隔、要采集的图像数量以及激光功率。然后，在光镊软件中，将光镊参数（如图所示）设置为追踪圆形。接下来，勾选AI参数框和正向权重框，点击记录按钮，随后开始图像采集。通过选择“生成”按钮启动光镊，使被捕获的微球至少完成两个完整的圆周运动，然后通过取消选择“生成”按钮关闭光镊。最后，停止图像采集。请注意，默认文件夹中将生成一个 tiff 格式的视频文件以及一个包含检流计电压的文本文件。打开 Matlab，进入校准文件夹，运行 position two tension 脚本。该脚本将计算插值函数，将检流计电压转换为光镊位置。接下来，参照随附的文字方案设置校准视频。检查脚本是否已正确计算并显示X和Y方向激光位置的插值图。查看图中是否存在代表缺失值的白色区域。如果存在明显的白色区域，请使用新的校准视频重复该操作。此处显示的校准视频代表具有足够数据的视频。使用解剖针或湿润的毛刷，选取约10个处于目标时期的胚胎并将其排列整齐。然后使用金刚石刻划笔切割载玻片，得到一

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

无珠光高音喇叭在食子胚胎中的细胞力学探测

本方案描述了在黑腹果蝇（Drosophila...

研究有丝分裂的显微注射技术 黑腹果蝇 合胞体胚胎

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。...

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

我们介绍一种用于标记黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中枢神经系统（CNS）中单个神经元的技术，该技术可通过透射光显微镜或共聚焦显微镜对神经元形态进行分析。...

果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

斑马鱼胚胎卵黄细胞中的原子力显微镜与微流变学研究

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。...

单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

本实验方案的目的是展示如何在黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中进行改良的机械性伤害感受检测。我们在此利用该检测方法证明，黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中存在机械性痛觉过敏（包括异常性疼痛和痛觉过敏）。...

一种改进的机械性伤害感受测量实验方法及相关工具 果蝇 幼虫

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

肌球蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起着重要作用。然而，调控肌动球蛋白收缩力具有挑战性 体内 急性地。本方案描述了一种光遗传学系统，可快速抑制由 Rho1 介导的肌动球蛋白收缩力 果蝇 胚胎，揭示肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失 体内.

光遗传学抑制Rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量 黑腹果蝇 胚胎

这些实验方案阐述了如何在对照组和突变型果蝇胚胎上皮中表征折叠型隔膜连接的结构及其封闭功能。...

免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白 果蝇 胚胎上皮

了解光镊与光片显微镜联用技术，用于在活体果蝇胚胎中直接测量细胞间力学特性。该方法无需微珠注射，可实现实时张力测定与流变学分析，为发育生物学研究提供微创手段。

利用无微珠光镊技术探测细胞力学特性果蝇胚胎

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