Name: 用于膜蛋白结构分析和从头建模的小角中子散射实验中的对比匹配洗涤剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 了解利用小角中子散射技术进行膜蛋白结构分析的方法。该技术通过对比匹配洗涤剂使其信号隐形，结合氘标记增强蛋白信号，实现溶液中膜蛋白的低分辨率结构解析与从头建模。

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美国能源部基础能源科学办公室下属的科学用户设施部门支持了橡树岭国家实验室结构分子生物学中心（CSMB）和生物SANS在生物与环境研究办公室开展的研究工作。Lieberman实验室在膜蛋白结构方面的研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：DK091357、GM095638）和美国国家科学基金会（NSF，项目编号：0845445）的资助。

作者 Volker S. Urban、Sai Venkatesh Pingali、Kevin L. Weiss 和 Ryan C. Oliver 通过 UT-Battelle 与美国能源部签订合同，支持在本文章中使用的橡树岭国家实验室中子科学用户项目及生物小角中子散射仪（Bio-SANS）。
本手稿由 UT-Battelle, LLC 与美国能源部（DOE）签订合同 DE-AC05-00OR22725 共同撰写。美国政府保留权利，出版方在同意发表该文章的同时承认，美国政府拥有对本手稿已发表形式进行出版或复制，或允许他人出于美国政府目的进行此类行为的非独占性、免付费、不可撤销的全球许可。根据美国能源部公共获取计划，DOE 将为这些由联邦资助的研究成果提供公众访问权限。82

结构生物学研究人员利用互补的结构技术（如溶液散射）来获取溶液中生物大分子的生化和结构细节（例如整体尺寸和形状）。小角中子散射（SANS）是一种特别有吸引力的技术，可用于测定膜蛋白的低分辨率结构，而膜蛋白正是现代结构生物学和生物化学的核心研究对象。SANS 所需的纯化蛋白量与晶体学实验相当（1 mg/样品）。近年来，与膜蛋白研究相关的高纯度氘代去垢剂在商业上的可获得性不断扩大，使得研究人员能够调控膜蛋白-去垢剂复合物中的氢/氘含量，从而在 SANS 实验中直接记录蛋白信号。若实验成功，仅需数小时采集的数据即可计算出从头（ab initio）分子包络模型。因此，膜蛋白生物化学家、生物物理学家和结构生物学家可便捷地利用 SANS 获得溶液中膜蛋白的珍贵初始三维结构模型，包括与结合伴侣或底物形成的复合物结构；此外，通过 SANS 获得的模型还可用于衍射数据的相位确定。若 SANS 能够常规用于膜蛋白的表征，将对膜蛋白生物化学领域产生变革性影响，并进一步波及从基础结构功能研究到药物发现与开发的广泛领域。利用氘取代实现中子对比度匹配的额外优势，使 SANS 成为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 或其他生物分子复合物的有力技术，这...

据估计，膜蛋白由所有基因中的约30%编码1，并构成了现代药物治疗靶点的绝大多数2。这些蛋白执行多种重要的细胞功能3&#160;，但尽管其数量丰富且功能重要，目前在结构生物信息学研究协作实验室（RCSB）蛋白质数据库中存档的结构中，膜蛋白仅占约1%4。由于其部分具有疏水性，膜结合蛋白的结构解析一直极具挑战性5,6,7
由于许多生物物理技术在测量时需要溶液中具有单一分散性的颗粒，因此从天然膜中分离膜蛋白并将其稳定在模拟天然膜环境的可溶性介质中，已成为近几十年来的研究热点。8,9,10 这些研究推动了多种新型两亲性组装体系的发展，用于增溶膜蛋白，例如纳米盘（nanodiscs）11,12,13&#160;、双层微粒（bicelles）14,15&#160;和两亲聚合物（amphipols）16,17&#160;。然而，使用去垢剂胶束仍是满足特定蛋白溶解性需求最常见且最直接的方法之一。18,19,20,21,22,23,24,25&#160;遗憾的是，目前尚不存在一种通用的去垢剂或“万能”混合去垢剂能够满足所有膜蛋白的需求；因此，必须针对每种蛋白的独特性质通过实验筛选合适的条件。26,27
表面活性剂在溶液中的浓度超过其临界胶束浓度时会自发组装，形成称为胶束的聚集体结构。胶束由多个表面活性剂单体（通常为20–200个）组成，其疏水烷基链构成胶束核心，而亲水头部基团则排列在胶束外壳层，朝向水相溶剂。表面活性剂的行为及胶束的形成过程经典地由Charles Tanford在《疏水效应》（The Hydrophobic Effect）一书中进行了描述28&#160;，常用于膜蛋白研究的表面活性剂所形成的胶束的大小和形状也已通过小角散射技术进行了表征29,30&#160;。此外，表面活性剂在膜蛋白周围的组织方式也已被研究，通常会形成蛋白-表面活性剂复合物（PDCs），其中表面活性剂分子围绕蛋白排列，结构类似于完整的表面活性剂胶束31。
使用去垢剂的一个额外优势在于，可以通过加入其他去垢剂来调控所形成胶束的性质。许多去垢剂表现出理想的混合行为，混合胶束的某些特性甚至可以根据组分及其混合比例进行预测。22&#160;然而，去垢剂的存在仍可能为生物物理表征带来挑战，因其会贡献整体信号。例如，在X射线和光散射技术中，蛋白-去垢剂复合物（PDC）中的去垢剂信号实际上无法与蛋白质信号区分开来。32&#160;单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究通常依赖于被捕获（冷冻）的颗粒；但某些去垢剂或高浓度的去垢剂仍会遮蔽蛋白质的结构细节，并增加背景干扰。33&#160;针对解析完整PDC结构（包括去垢剂部分）的替代方法已通过计算手段实现，这些方法旨在重建围绕特定膜蛋白的去垢剂分布。34
对于中子散射而言，胶束中去垢剂的核-壳结构会产生一种影响观测散射的形状因子。幸运的是，可以通过调整溶液组分，使其对总的观测散射无贡献。这种&#34;对比度匹配&#34;过程通过用氘替代氢，使散射长度密度与背景（缓冲液）相匹配来实现。必须审慎选择去垢剂（需有可获得的氘代对应物）及其混合比例。对于去垢剂胶束，可使用具有相同亲水头基但带有氘代烷基链（d-尾而非h-尾）的去垢剂来进行这种替换。由于去垢剂充分混合，35&#160;其聚集体的散射长度密度为两种组分（h-尾和d-尾）按摩尔分数加权的平均值。当该平均对比度与头基的对比度一致时，均匀的聚集体结构可实现完全匹配，从而消除所有对观测散射的贡献。
本文介绍了一种通过引入烷基链氘代标记但化学性质相同的去垢剂分子，来调控去垢剂胶束中子对比度的实验方案。19,36,37&#160;该方法可实现胶束核心与壳层的同时完全对比度匹配，这是中子散射技术所独有的能力。35,38&#160;借助这一显著提升的细节分辨水平，对比度匹配技术能够推动原本难以实现的膜蛋白结构研究。此外，这种对比度匹配策略还可拓展至其他涉及去垢剂的体系，例如聚合物交换反应39和油水分散剂40&#160;，甚至其他增溶剂，如bicelles41&#160;、nanodiscs42&#160;或嵌段共聚物43&#160;。近期已有文献报道了与此文中所述类似的方法，但仅使用单一去垢剂种类，并在其烷基链和/或头部基团上进行部分氘代取代。37&#160;尽管预期该方法相比本文所介绍的方法可使氢与氘在去垢剂分子中的分布更为随机，但由于可用于取代的位点数量有限，且需要两步法合成去垢剂，因此在实际应用中仍面临额外挑战。
以下方案的步骤1和步骤2通常存在重叠，因为必须在提交高质量提案之前完成初步的实验规划。然而，本文将提案提交视为第一步，以强调该过程应远早于中子实验开始之前启动。还应注意，提案中应体现的一个先决条件是：样品需具备生化和物理表征（包括纯度和稳定性），以证明开展中子研究的必要性。本文不涉及对小角中子散射（SANS）的全面讨论，相关简明而详尽的介绍可参见参考文献 材料表征 由 Kaufmann 等人44 最近出版了一本专注于生物小角溶液散射的综合性教科书。45 进一步推荐阅读见讨论部分。小角散射以所谓的散射矢量 Q 作为描述散射过程的核心物理量。本文采用广泛接受的定义 Q = 4π sin(θ)/λ，其中 θ 为入射束与散射束之间夹角的一半，λ 为中子辐射的波长（单位为埃）。也存在其他定义，可能使用不同的符号（如用“s”表示散射矢量），或在因子 2π 上存在差异，或以纳米替代埃作为单位（另见讨论部分） 图10).

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra MWCO 50KDa 浓缩管&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>二碱式柠檬酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Bioflo 310 生物反应器系统</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td>设备</td></tr><tr><td>二水氯化钙</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>羧苄西林</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02025</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>3130</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>氯化钴(II)</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&amp;nbsp;</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Drierite 气体纯化器</td><td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>设备</td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta Purifier UPC100</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 柱</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17116701</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>六水三氯化铁</td><td>MP Biochemicals</td><td>ICN19404590</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>LB 琼脂（Miller）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>一水硫酸锰(II)</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 恒温/制冷摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&amp;nbsp;</td><td>设备</td></tr><tr><td>n-十二烷基-d25-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>RC 6 Plus 离心机</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>设备</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 蛋白酶抑制剂混合片剂（无 EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>带 0.2&amp;micro;m PES 膜的无菌 25 mm 注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>带 0.2&amp;micro;m PES 膜的无菌一次性瓶顶滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&amp;nbsp;</td><td>实验耗材</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>Superose-12 10/300 GL 柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10 细胞密度计</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>80211630</td><td>设备</td></tr><tr><td>一水硫酸锌</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&amp;nbsp;</td><td>培养基组分</td></tr></tbody></table>

小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

位于橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆的生物小角中子散射仪器，专门用于研究生物材料、生物燃料加工过程以及仿生材料，涵盖从纳米到微米尺度的结构分析。本文介绍的方法适用于该小角中子散射仪器（以及其他类似仪器），可用于研究膜蛋白（此处为 MmIAP，一种来自 Methanoculleus marisnigri 的膜内天冬氨酰蛋白酶）在胶束形成型去垢剂溶液中的物理性质（即 大小和形状）。其他生物物理表征技术往往受限于无法有效区分去垢剂在蛋白质-去垢剂复合物结构中的贡献。此外，依托生物氘代实验室，可实现大规模培养并表达氘标记蛋白，从而增强来自蛋白质部分的散射信号。尽管该技术无法提供高分辨率的结构细节，但针对膜蛋白的结构知识空白中，仍存在大量可通过该方法研究的重要领域，而无需达到近原子级分辨率。例如，这些研究方向包括寡聚状态的确定、复合物的形成、扰动过程中的构象变化以及折叠/去折叠事件。这些研究均可通过本方法的应用得以顺利实现。

申请中子束时间及仪器使用提案时，应清晰传达评审委员会所需的所有信息，以便对所提议的实验进行有效评估。对于缺乏经验的用户，强烈建议与中子科学专员（NSS）进行沟通。NSS 可评估实验的初步可行性，并指导提案的提交，以突出实验的可行性、安全性以及产生高影响力科学成果的潜力。提案中应包含的研究信息包括：研究意义的背景与依据；预期获得的知识及其对相关科学领域当前认知的影响；拟开展工作的描述，包括样品、方法和实验步骤；如适用，还应提供团队在该设施以往的工作成果，包括相关出版物和研究结果。用户可通过中子科学用户门户（neutrons.ornl.gov/users）获取有用的资源，例如提案模板以及撰写提案的实用建议。
实验规划是一个动态过程，通常始于项目申请的初期阶段，但可能要到实验开始前才能完全确定。然而，请注意，任何显著偏离申请书中描述的变更（包括缓冲液条件或样品组成的更改）都必须在实验开始前获得设施管理部门的批准。
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本方案演示了如何利用去垢剂反差匹配的小角中子散射技术，获得溶液中去垢剂增溶的膜蛋白的低分辨率ab initio模型及其结构细节。

位于橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆的生物小角中子散射仪专门用于……

该方法有助于解答有关整合膜蛋白的关键问题，例如其寡聚状态、大小、整体形状以及在溶液中的低分辨率结构。对膜蛋白进行溶液研究需要使用去垢剂等稳定分子。该技术的优势在于可使去垢剂在检测中“隐形”，从而突出膜蛋白本身的信号。该技术的影响延伸至众多生物学和医学研究问题，因为超过三分之一的蛋白质位于细胞膜中，在其中执行多种重要的细胞功能。对该方法进行可视化演示至关重要，因为氘标记和中子散射步骤较难掌握，目前仅有极少数机构提供这些技术的培训。首先，使用网络应用程序 MULCh（用于分析对比度变化数据的模块）确定中子散射长度密度（SLD）。单击左侧导航窗格中的“contrast”以打开对比模块。输入项目标题的文本，并在下方分别输入两个组分的详细信息，作为亚基一和亚基二。在分子式文本框中输入每个组分的分子式。然后在“体积”下方的输入框中输入每个组分的立方埃体积。最后，输入缓冲液组分的详细信息。点击提交以执行中子对比度计算。生成一个结果页面，提供散射长度密度和对比度匹配点的表格，以及用于确定缓冲液中任意D2O百分比下这些参数的计算公式。请仔细审阅散射参数，特别关注各组分的对比度匹配点。在LB培养基中培养携带目标蛋白序列诱导型表达载体的大肠杆菌（E.coli）细胞，使其在600纳米处的光密度（OD 600）达到约1.0。在扩增以过表达氘代蛋白之前，通过将LB培养物以1:20的比例稀释至3毫升最小培养基中，使大肠杆菌细胞适应氘代培养基。当培养物生长至OD 600约为1时，使用分别含有50%、75%和100%D2O的最小培养基重复进行1:20的稀释。适应后，继续在生物反应器中培养该菌液，以提高氘代细胞生物量的产量。随着D2O含量的增加，细胞生长速率将下降。按照文本方案中所述步骤进行细胞收获、裂解和纯化。随后，使用快速蛋白液相色谱系统，以超过两个柱体积的终末交换缓冲液对尺寸排阻色谱柱进行平衡。上样后，运行层析柱以分离出目标蛋白对应的组分。保留一份与缓冲液匹配的等分试样，用于小角中子散射（SANS）背景扣除。为采集SANS数据，首先将样品和缓冲液装入石英比色皿中。确认光束快门已关闭后，进入样品环境区域，将石英池放入样品架中。记录每个样品池在样品架中的位置。离开样品环境区域前，检查该区域，确保光路无任何遮挡物。然后打开束流快门，执行表格扫描以进行自动数据采集。遵循中子散射科学家提供的仪器操作说明。使用 Mantid Plot 软件和 Python 脚本将小角中子散射（SANS）数据从二维图像约化为一维图谱。具体操作步骤为：登录远程分析集群，并在命令行中启动 Mantid Plot。随后打开提供的用户约化脚本，将样品及其对应缓冲液的扫描编号或标识符填入适当的列表中。运行脚本以在指定位置生成包含四列数据的文本文件。右键单击相应的工作区和Mantid图，选择带误差的绘图方式，初步检查散射曲线。下载ATSAS软件包，并使用PRIMUS进行数据绘图、缓冲液缩放与扣除以及Guinier分析。启动 ATSAS SAS 数据分析程序，加载与样品和缓冲液配对对应的已减除数据文件。为正确缩放缓冲液曲线，在高 Q 区域选择两条曲线均呈平坦且相似的数据范围，然后点击“操作”选项卡下方的缩放按钮。扩大数据范围以查看所有数据点，点击“相减”执行该操作。使用SAS数据分析应用程序的分析选项卡，对扣除缓冲液后的样品数据进行Guinier分析。确保在列表中已选择正确的文件，然后点击回转半径。点击自动RG按钮，系统将自动尝试进行Guinier拟合。扩展所用数据范围以包含所有低Q值数据，然后通过逐步去除高Q值数据点来缩小数据范围，直至Q max与RG的乘积小于1.3。利用残差图验证拟合范围内数据的线性性。对拟合区域进行微调，并监测这些参数值对拟合所用数据范围的敏感性。在 gnome 中获取 R 的概率分布函数 P。现在，在分析选项卡中启动距离分布向导。获得与数据的良好拟合对于得到高质量的模型至关重要。确定分子内的最大原子间距离 Dmax。通过取消勾选强制 Rmax 等于零的选项，并输入一个较大的 Dmax 值来估算 Dmax。P(R) 图中第一个与横轴的交点即给出该估计值。逐步调整该 Dmax 值，以及用于优化对数据进行拟合的“gnome”拟合点数的数据范围，从而得到 R 的 P 曲线。在 SAS 数据分析的分析选项卡中，单击 dammif 按钮启动 PRIMUS 形状向导，并手动选择参数。根据拟合结果定义吉尼尔（Guinier）范围，然后使用导航按钮进入下一步。根据R比值图定义拟合值，并进入下一步。为从头建模过程提供参数，然后通过点击提交按钮启动该过程。使用 ATSAS 中的 supcomb 工具，将最终的无包膜结构与相关的高分辨率模型进行叠加和叠加拟合。将待拟合到 SANS 包膜的高分辨率 PDB 模型副本放置于工作目录中。然后从命令行执行 supcomb，将 PDB 文件名作为两个参数输入，其中模板结构列在首位。最后使用 PyMOL（一种三维分子图形可视化程序）来展示从头建模的结果。将 SANS 包络与高分辨率结构叠加后，即可通过任何分子图形可视化程序查看这些模型。文中展示了 PyMOL 可视化过程的概览。在 PyMOL 中打开 PDB 结构文件后，模型应显示在 PyMOL 查看窗口中。可使用每个文件名旁的 S 按钮来更改各个模型的表示方式。此处对 SANS 包络采用表面表示，对高分辨率模型的蛋白质骨架采用卡通表示。可在 C 按钮下的可用选项中选择合适的配色方案。对于蛋白质链，使用彩虹色（chainbow）着色可提供从 N 末端到 C 末端的色彩梯度，有助于结构解读。对表面表示应用透明度，以便更清晰地观察包膜内的蛋白质结构。对于出版用图像，建议使用白色背景。应用这些可视化提示后，可通过点击并拖动结构来查看3D结构。可对视角以及分子的旋转和平移进行操作。在进行该实验操作时，重要的是要准确匹配去垢剂头部和尾部基团与D2O H2O溶剂的中子对比度。该技术建立后，为研究膜内天冬氨酸蛋白酶的结构开辟了道路。这类蛋白质参与免疫反应、丙型肝炎以及阿尔茨海默病。请务必注意，在生物化学实验室和中子束设施中工作可能存在危险。执行本实验步骤时，必须采取预防措施，例如佩戴个人防护装备，并严格遵守所有设施的安全规定和放射性警示要求。

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