Name: 用质谱和电镜分析 Biolayer 干涉传感器上的动态蛋白复合物的组装和释放 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习利用生物层干涉技术实时监测炭疽毒素复合物的动态组装与解离过程，并结合电子显微镜和质谱分析进行结构验证。该方法适用于研究蛋白质复合物在不同pH环境下的构象变化机制。

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本工作得到了Madison和Lila Self研究生奖学金（AJM）、NIH 5T32GM008359（PTO）、KUMC生物医学研究培训项目（PTO）、NIH R01AI090085（MTF）、KU桥接基金以及生物分子相互作用技术中心（BITC）资助（CT和MTF）的支持。作者感谢KUMC电子显微镜核心实验室的Barbara Fegley在透射电子显微镜图像采集方面的协助。

1. 在生物层干涉测量（BLI）生物传感器表面组装定义的生物大分子复合物
<ol>
	<li>在PDEA修饰的胺反应性生物传感器表面组装炭疽毒素前孔复合物
	<ol>
		<li>将第二代胺反应性（AR2G）BLI生物传感器探针置于250 µL水中水合10分钟。</li>
		<li>在控制BLI仪器的软件中设置步骤时间，具体时间见表1（参见材料表）。</li>
		<li>通过将生物传感器探针浸入250 µL水中30秒，启动BLI运行，以测量生物传感器厚度和密度的初始基线。</li>
		<li>将探针浸入250 µL含50 mM NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和200 mM EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）的溶液中7分钟，以活化生物传感器。</li>
		<li>将活化的生物传感器探针浸入250 µL含50 mM PDEA（2-(2-吡啶二硫基)乙胺）的0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）中5分钟，生成具有活性的巯基反应性表面。</li>
		<li>将活化的巯基反应性生物传感器探针浸入250 µL含100 nM E126C LFN的溶液中（10 mM醋酸钠，pH 5.0，100 mM NaCl），持续5分钟。</li>
		<li>将LFN探针浸入50 mM L-半胱氨酸、1 M NaCl、0.1 M醋酸钠（pH 5.0）溶液中4分钟，以淬灭任何残留的活性巯基反应性基团。</li>
		<li>将淬灭后的LFN探针浸入50 mM Tris、50 mM NaCl溶液中2分钟，建立缓冲液基线。</li>
		<li>将淬灭后的LFN探针浸入含0.5 µM保护性抗原前孔（PAprepore）、50 mM Tris、50 mM NaCl的溶液中5分钟，形成LFN-PAprepore复合物。</li>
		<li>一旦PAprepore结合完成，将探针从PAprepore溶液中取出，并浸入50 mM Tris、50 mM NaCl溶液中30秒，以洗去非特异性结合的PAprepore。</li>
		<li>将LFN-PAprepore复合物探针浸入含0.5 µM CMG2受体（不含跨膜区）、50 mM Tris、50 mM NaCl的溶液中5分钟。</li>
		<li>将LFN-PAprepore-CMG2复合物探针浸入50 mM Tris、50 mM NaCl溶液中30秒，以洗去未结合的CMG2，形成早期内体复合物。</li>
		<li>对于电镜分析，将探针浸入PCR管中含5 µL 50 mM DTT、50 mM Tris、50 mM NaCl的溶液中，使LFN-PAprepore-CMG2复合物从生物传感器探针上释放。</li>
		<li>对于复合物肽段的串联质谱分析，将生物传感器探针浸入PCR管中含5 µL 50 mM DTT、6 M GuHCl（无角蛋白污染）、25 mM碳酸氢铵（pH 8.0）的溶液中，使LFN-PAprepore-CMG2复合物从探针上释放。此操作使用与电镜分析不同的生物传感器探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在PDEA修饰的胺反应性生物传感器表面组装炭疽毒素孔道复合物
	<ol>
		<li>为观察pH转变后的复合物，执行前一节中的步骤1.1.1–1.1.12，生成LFN-PAprepore-CMG2复合物。</li>
		<li>将生物传感器探针浸入10 mM醋酸盐缓冲液（pH 5.0）中5分钟，以启动PAprepore向PApore的构象转变。该转变表现为信号振幅先升高（约0.2 nm），随后出现较大程度的下降，推测这是由于结合亲和力降低导致受体显著或完全解离所致。</li>
		<li>将LFN-PApore探针浸入50 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0的缓冲液中30秒，以洗去酸性缓冲液。</li>
		<li>对于电镜分析样品，将生物传感器探针浸入含1.25 mM胶束（2.5 mM MSP1D1、25 mM牛磺胆酸钠、162.5 mM POPC）的溶液中5分钟，以防止二硫键断裂后复合物在溶液中发生聚集。</li>
		<li>对于电镜分析，将探针浸入PCR管中含5 µL 50 mM DTT、50 mM Tris、50 mM NaCl的溶液中，使LFN-PApore-胶束复合物从生物传感器探针上释放。</li>
		<li>对于复合物肽段的串联质谱分析，将生物传感器探针浸入PCR管中含5 µL 50 mM DTT、6 M GuHCl（无角蛋白污染）、25 mM碳酸氢铵（pH 8.0）的溶液中，使LFN-PApore复合物（不含胶束）从探针上释放。此操作使用与电镜分析不同的生物传感器探针。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过负染电子显微镜观察和验证BLI生物传感器释放的生物大分子复合物
<ol>
	<li>对覆有碳膜的铜质300目载网进行辉光放电处理。典型的辉光放电参数为：稳定气压0.38 mBar，负15 mA电流，持续20秒，随后通入空气释放真空。</li>
	<li>用一对洁净的镊子夹牢载网。</li>
	<li>用移液器将4 µL来自PCR管中的解离复合物样品滴加到载网上，吸附60秒。</li>
	<li>用滤纸楔形尖端吸除残留液体。</li>
	<li>用移液器滴加5 µL经过0.02微米滤膜过滤的0.75%醋酸铀酰溶液对载网进行染色，5秒后用滤纸吸除多余染液。在室温下使载网自然干燥。</li>
	<li>使用透射电子显微镜观察染色后的样品载网。</li>
</ol>
3. 利用质谱法鉴定完整的早期内体前炭疽毒素复合物（LFN-Paprepore-CMG2）及转化后的复合物（不含CMG2的LFN-Papore）。
<ol>
	<li>将释放的样品稀释至 20 µL，并孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 2 µL 浓度为 55 mM 的碘乙酰胺和 25 mM、pH 8.0 的碳酸氢铵溶液，避光（用铝箔覆盖）室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 100 µL 浓度为 25 mM、pH 8.0 的碳酸氢铵溶液稀释样品，使盐酸胍浓度降至 1 M 以下。</li>
	<li>加入 5 µL 浓度为 20 ng/µL 的测序级修饰胰蛋白酶，37 °C 过夜孵育。</li>
	<li>加入冰乙酸至终浓度为 5%，将 pH 降至 &#60;3，然后在真空浓缩仪中将体积浓缩至 10 µL。</li>
	<li>将肽溶液转移至 nLC 1200 uHPLC 自动进样器的样品板中。</li>
	<li>将 5 µL 肽溶液加载到安装在质谱仪电离源阶段的 uHPLC 反相色谱柱上。</li>
	<li>以最大流速 5 µL/min 和/或最大压力 800 psi，用 15 µL 含 0.1% 甲酸的溶液冲洗色谱柱。</li>
	<li>使用线性梯度洗脱，在 90 分钟内以 350 nL/min 的流速从反相 C18 柱上洗脱肽段，溶剂 B 在 A+B 中的比例从 5% 升至 40%（溶剂 A：0.1% 甲酸；溶剂 B：含 0.1% 甲酸的 95% 乙腈）。</li>
	<li>在线分析洗脱的肽段，采用串联质谱法。
	<ol>
		<li>将电离源电压设为 2500 伏，离子传输温度设为 250 °C。</li>
		<li>在自动控制模式下运行质谱仪，每 3 秒连续进行一次 MS 扫描，随后尽可能多地进行串联 MS/MS 扫描，采用 CID 碎裂方式和归一化碰撞能量 35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用标准方法鉴定肽段和蛋白质组分。本研究中进行了两组独立的肽段与蛋白质分析。</li>
</ol>

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</ol>

目前无披露信息。

本演示说明了如何利用生物膜干涉技术轻松监测大分子复合物的形成，通过电子显微镜进行可视化观察，并使用质谱法进行验证，所有步骤均能在短时间内使用微量样品完成。所观察到的结构组装及复合物符合生物学上合理的预测，进一步验证了该联合方法的可靠性。如结果部分所述，成功组装的关键在于合理设计的半胱氨酸定点突变，以确保复合物的蛋白质-蛋白质相互作用界面能够正确地朝向远离生物传感器表面的方向排列。
以往的系统曾采用BLI和MS技术来评估两种和三种组分体系的蛋白质结合，以及表达蛋白的受体结合完整性，但在上述两种情况下，这些方法均未针对串联的EM/MS方法进行优化8,9。唯一另一种结合了MS分析以辅助表征相互作用的干涉测量系统是双偏振干涉测量技术10。遗憾的是，该系统目前已不再供常规使用。如引言中所述，已有若干研究完成了在类似SPR的生物传感器表面形成的样品并将其用于MS分析。然而，这些实例均未实现通过电子显微镜（EM）对复合物进行可视化观察。
该顺序化方法的局限性可能较多，但均可解决。对于组装过程中的初始固定化步骤（即基础步骤），若缺乏对结构相互作用表面的了解，则必然会影响对初始组装阶段的监测进展。结构信息的缺失可通过设计一种人工构建的基础结构来解决，其中包含特定的连接化学基团（例如 用于二硫键连接的巯基基团/带组氨酸标签的定位）可移动至核心组装系统的不同区域。以炭疽毒素复合物为例，幸运的是，LF的结构N 与PA结合前孔 是可获得的11合理设计的半胱氨酸应定位在远离PA的区域前孔 结合面。在使用半胱氨酸连接化学时，最好在蛋白质表面不存在其他反应性半胱氨酸。
有多种偶联化学方法可用于在蛋白质表面设计特定的偶联位点。其中一种最常用的特异性偶联方式是在蛋白质表面的特定位置引入一个生物素基团12。然而，生物素与链霉亲和素或亲和素包被的表面结合非常牢固，其结合相互作用的逆转并不容易。相比之下，在蛋白质的N端或C端引入工程化的His标签，并随后便捷地偶联至Ni-NTA表面，是一种更为通用的亲和固定化方法。当然，使用His标签系统设计组装偶联位点时需要注意：核心组装蛋白的N端和C端必须保持暴露且彼此分离，以确保偶联的便利性。与所有组装过程一样，在复合物组装进行过程中，核心组装蛋白的相互作用界面必须始终保持可及性。
使用生物传感器表面化学修饰时最常见的问题是非特异性结合。链霉亲和素探针常常是显著非特异性结合效应的来源。可利用二硫键连接的生物素释放出高度特异的复合物，同时将还原后的S-生物素连接基团牢固地留在固定化的链霉亲和素生物传感器上13。目前已有其他一些可逆化学修饰方法正在出现，例如亚氨基硼酸酯，以及应用较少的酮酰胺14。该领域目前尚处于发展初期，但人们对进一步开发可逆共价结合技术具有高度兴趣，以避免在共价靶向药物研发中常见的脱靶药物毒性效应。
利用电子显微镜（EM）观察复合物的一个局限性在于结果的解读，尤其是在所组装复合物的结构最初未知的情况下。可以通过使用单克隆抗体（mAb）作为特异性的动力学和结构标记物，来确定未明确定义的组装大分子复合物中各组分的空间位置。例如，一旦复合物形成，便可加入能够结合特定组分的单克隆抗体。该方法在电子显微镜中常用于识别大型组装结构中的特定组分15。另一个局限性与复合物的尺寸有关，尽管已有报道表明，使用负染色电子显微镜技术可以清晰分辨小至70 kDa（如GroES七聚体）的对称组装结构。通常通过电子显微镜分析的组装复合物直径大约在100 Å或更大。然而最近，借助更优的染色方法，小至20 kDa的蛋白质也已获得分辨，并得到了低分辨率的结构信息16。
对于质谱分析，当前质谱仪器的灵敏度已提高至飞摩尔（阿摩尔）水平，在某些情况下可增强生物膜层干涉技术（BLI）检测的灵敏度。可以合理推测，那些幅度虽小但可重复升高的蛋白信号将有助于目标蛋白的鉴定。此外，当其中一个相互作用蛋白固定在生物传感器上，而另一个存在于细胞环境中时，通过探测蛋白-蛋白相互作用，实际上可实现新形成复合物的富集，从而更易于检测。当前高灵敏度质谱系统可能存在的一个局限性是目标蛋白可能未收录于数据库中，但这种情况较为罕见。例如， 稀有物种的蛋白质组）。如果目标蛋白质的序列已知，则可通过在背景蛋白质数据库中加入该蛋白质的氨基酸序列来轻松解决此问题（本实验方案部分对此有描述）。该方法的另一个潜在局限性在于蛋白质对胰蛋白酶消化的抗性。胰蛋白酶消化通常是自下而上蛋白质鉴定的默认方法。然而，若蛋白质缺乏精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）残基，或其折叠结构限制了对这些残基的接触，则可能对胰蛋白酶具有抗性。针对上述局限性，可分别通过使用其他蛋白酶或多种蛋白酶组合，或在酶解前加入变性试剂（如1.1.14和1.2.6中所述的尿素或盐酸胍）来解决。
该方法的可能扩展包括允许用户追踪并鉴定来自粗细胞裂解液的细胞组装复合物。结果表明，使用生物膜干涉技术检测浓缩细胞提取物中的组装组分非常易于操作。与容易堵塞且对聚集敏感的常用微流控方法不同，BLI方法可直接将生物膜传感器探头浸入粗提物中，从而有可能直接从这些浓缩但不纯的样品中组装特定复合物。一旦完成组装，完全可行的是在BLI系统之后使用特异性抗体探针，进一步鉴定甚至定量通过微体积质谱法鉴定出的细胞提取物中可疑的组分。同样，关键在于使用定义明确且正确取向的核心蛋白作为特异性亲和探针。
利用BLI动力学地观察前孔到孔的转变过程将对鉴定潜在靶点具有重要意义 &#34;抗毒素&#34; 在晚期内体低pH（5.0）条件下特异性发挥作用的蛋白质构象转变的小分子抑制剂。在存在折叠稳定剂（如甘油或蔗糖等渗透保护剂）时，pH诱导的前孔向孔结构的转变受到抑制，因此为开发可阻止PA折叠的特异性靶向折叠稳定剂提供了有力支持。孔 形成。这种特定方法避免并取代了基于粗略聚集的检测方法，在后者中，pH值下降会导致蛋白质沉淀。尽管后一种方法适用于初步筛选，但常常产生假阳性结果，即某些化合物抑制的是聚集过程本身，而非实际的分子构象转变。
对小体积样品中结构的下游观察以及对单个组装组分的鉴定，也可用于验证潜在先导化合物。该方法适用于以特异性组装稳定化或去稳定化为靶向目标的情形。这种动力学/结构/鉴定平行方法有助于直接确认疑似先导化合物对组装过程影响效应的有效性，并可作为合理的二级筛选步骤或中等通量研究策略。
冷冻电镜（cryo-EM）是一种用于研究大分子复合物在不同组装状态下原子级细节的有用技术。在制备冷冻电镜样品之前，首先通过负染电镜验证样品是否含有纯度较高且均一的复合物至关重要。本文所展示的方法包括在BLI生物传感器表面组装蛋白质复合物、将这些复合物释放以用于电镜观察，并通过质谱（MS）鉴定其组分。这种受控组装与释放的特定方法可用于建立高度特异性的实验方案，从而增强负染电镜所需的均一性及顺序性样品制备——这是推进至冷冻电镜研究前必须验证的关键步骤。若具备取向多样性（即多种不同视角），仅需30至50个复合物颗粒即可获得低分辨率三维结构，每个颗粒提供70个不同的二维图像视角，用于进行锥形倾转系列成像。
在提升质谱方法方面，灵敏度的提高和样品体积的减少持续取得进展。纳米流速与超高压液相色谱技术，结合具有快速循环周期、更高灵敏度和分辨能力的质谱仪的发展，共同推动了这一进步。特别是轨道阱质谱仪（orbitrap mass spectrometer）的近期引入，包括其最新版本（orbitrap Fusion Lumos）及其预期继任者 Orbitrap Fusion Lumos 1M），以及搜索算法的改进，极大地促进了这一进程。
本方法利用无标记BLI技术监测炭疽毒素组分的动力学组装与解离过程，并分别采用电子显微镜（EM）和质谱（MS）技术评估这些组分的结构与身份。使用简单的单通道BLI系统，结合常规负染色EM分析和基础MS技术，已足以对组装过程进行表征。

识别并理解调控蛋白质复合物组装的特异性 体内 对生物化学研究人员具有极大的兴趣。大型异质蛋白复合物是常态而非例外。这一观点得到了光谱监测的支持 体内 组装、采用更温和的细胞破碎技术分离复合物、评估基于亲和力的纯化方法所得产物，并利用高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）对其进行可视化。为了理解细胞内组装特异性的调控机制，研究人员必须常规性地分离、鉴定并最终表征这些动态组装/解聚的结构。目前最常用的分子工具是基于抗体的免疫沉淀技术，用于鉴定这些复合物的组成成分，但该方法依赖于在细胞破碎过程中维持复合物的稳定性。近年来，已开发出多种联用分析技术，通过基于微流控的方法（如表面等离子共振，SPR）从细胞样品中捕获复合物。从SPR表面洗脱后，这些样品通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行分析。1,2采用更简便的实验方案来推进该方法，将使研究人员能够可视化并验证在细胞环境中预测存在的复合物。由于表面等离子共振（SPR）是一种基于微流控技术的系统，常会因聚集物的形成而引发问题。为避免这一问题通常需要对样品进行稀释，但这可能会降低依赖浓度的生物复合物的完整性。
无标记技术领域的一项相对较新的进展是生物膜干涉技术（biolayer interferometry, BLI）系统的开发3。这类基于光的反射系统能够以远低于表面等离子共振（SPR）技术的成本复制或最接近地模拟SPR的结合与动力学结果3,4，尤其是在使用单通道设备时。BLI通过测量参考层（对照）与生物膜表面（实验）之间反射光干涉图样的变化来工作。由此产生的相位变化被实时测量，作为动力学和定量的读数5。该生物传感器表面含有特定的固定化化学基团，在检测过程中通过波长相位偏移进行测量时，需将传感器在不同溶液之间物理转移，这与SPR中通过微流控系统更换缓冲液的方式不同。通过搅拌溶液可避免传质效应。与SPR不同，这类系统在分析粗制生物样品中的复合物时具有显著优势。BLI实验中所测量的物理参数主要取决于生物传感器表面因蛋白质复合物组装或解离所引起的质量或厚度变化。
这些光纤生物传感器使用简便且相对便宜。BLI 的一个新兴有用特性是能够轻松地将新组装的蛋白质复合物从表面去除。该方法的最新应用使我们的实验室能够实时观察炭疽毒素保护性抗原（PA）组分在大规模 pH 诱导下从前孔（PAprepore）向孔结构（PApore）转变过程中的蛋白质构象重排动力学。这一在生物传感器尖端发生的构象转变已通过电子显微镜（EM）得到验证6。从生物传感器表面去除复合物可避免在使用微流控系统时，因从芯片表面释放复合物而常遇到的大体积稀释效应。
在本研究中，炭疽毒素复合物在生物传感器表面进行组装和解离，随后释放到微升级体积中。利用电子显微镜和质谱法（MS）对所得的复合物组分进行正交验证。

<table><tbody><tr><td>(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>(2-(2-吡啶基二硫)乙胺)(PDEA)</td><td>GE Lifesciences</td><td>BR100058</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 黑色微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688304-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 50 &amp;mu;m x 150mm, C18, 2 &amp;mu;m, 100 &amp;Aring;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164561</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Fisher</td><td>A38SL-212</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>胺反应性第二代 (AR2G) 探针尖端</td><td>Forte Bio</td><td>18-5092</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Fisher</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Anotop 10 注射器滤器，0.02 μm</td><td>GE Lifesciences</td><td>6809-1002</td><td></td></tr><tr><td>BLItz 系统</td><td>Pall Forte Bio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>毛细血管形态发生基因-2</td><td></td><td></td><td>实验室自制并纯化的蛋白质</td></tr><tr><td>碳支持铜网（300目）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CF300-CU-50</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT25</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>JT Baker</td><td>0129-01</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍 (GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505-100G</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>MP-BioMedicals,LLC</td><td>100-351</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800-5G</td><td></td></tr><tr><td>致死因子N端结构域</td><td></td><td></td><td>实验室自制并纯化的蛋白质</td></tr><tr><td>质谱软件版本 2.2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>090M14531V</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easiGlow 等离子体清洗系统</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>保护性抗原前孔结构</td><td></td><td></td><td>实验室自制并纯化的蛋白质</td></tr><tr><td>定性滤纸圆片</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-795C 5</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sequest HT 搜索引擎</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铀酰 (UF)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30487</td><td></td></tr></tbody></table>

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

在活体中，蛋白质通常构成大型大分子复合物的一部分，其结合特异性和动力学最终决定功能输出。本研究中，炭疽毒素的内体前复合物被组装并转变为内体复合物。首先，通过二硫键偶联，将半胱氨酸突变型致死因子（LFN）的N端结构域以最优取向固定在生物层干涉测量（BLI）生物传感器上，使保护性抗原（PA）前孔结合（Kd 为 1 nM）。该最优取向的LFN-PAprepore复合物进一步与可溶性毛细血管形态发生基因-2（CMG2）细胞表面受体结合（Kd 为 170 pM），形成在pH 7.5条件下稳定的代表性炭疽内体前复合物。随后，将组装好的复合物置于模拟晚期内体环境的酸性条件（pH 5.0）下，促使PAprepore转变为插入膜中的孔道状态。该PApore状态导致CMG2受体与LFN-PApore之间的结合减弱，并促使CMG2从转变后的孔道中大量解离。LFN与生物传感器表面的硫醇连接可通过二硫苏糖醇（DTT）轻易逆转。在BLI生物传感器表面进行还原反应，可将LFN-PAprepore-CMG2三元复合物或经酸性转变后的LFN-PApore复合物释放至微升级体积中。释放的复合物随后通过电子显微镜和质谱技术进行可视化和鉴定。本实验展示了如何利用无标记BLI方法监测特定蛋白质复合物的动力学组装与解离过程，并分别通过电子显微镜和质谱技术评估这些BLI组装复合物的结构与身份，整个流程步骤清晰、易于重复。

监测和验证大型大分子复合物组装的能力，是理解大型生物分子组装体特异性和功能性的关键步骤。本文所展示方法的结果表明，利用生物层干涉技术可以轻松组装大型蛋白质复合物（质量 >150 kDa），同时可实时监测组装的动力学过程和反应幅度。生物传感器表面独特的紧凑结构使得组装分析得以进一步拓展，即通过将组装好的复合物释放到微小体积中进行后续分析。这些微体积可用于通过电子显微镜（EM）观察复合物的初始物理结构，并利用质谱（MS）验证复合物组分的身份。整个流程的示意图见图1。
在生物传感器表面成功组装并验证大分子复合物的关键因素之一，是初始“种子”蛋白的正确取向。这可确保蛋白-蛋白相互作用位点可被接近，不受空间位阻影响，并且相对于生物传感器表面处于最佳位置。如图2所示，炭疽毒素复合物的正确取向是通过使用一种经过特殊设计的致死因子N端片段（LFN）实现的，从而使LFN与PAprepore的结合位点始终朝向远离生物传感器共价连接位点的方向6,7。随后，PA结合到LFN BLI生物传感器上，再与可溶性CMG2结合至PA，最终形成具有易位功能的炭疽毒素复合物。
BLI 传感图谱曲线实时反映了由于逐步加入炭疽毒素组分所引起的振幅变化。图3展示了一条代表性曲线，并配以该步骤中预测形成的复合物模型。第一条上升曲线代表LFN加载到传感器尖端。在淬灭并恢复基线后，PAprepore结合至LFN，随后加入可溶性CMG2受体，形成LFN-PAprepore-CMG2前内涵体复合物。为模拟晚期内涵体环境，整个复合物经受低pH脉冲（pH 5.0）处理，该条件削弱受体结合，促使前孔结构转变为伸展并插入膜中的孔道构象。6 酸化步骤的传感图谱曲线如图4所示。振幅初始上升或“尖峰”可能对应于孔道伸展6，此过程发生在CMG2受体结合减弱之前。随后较大的振幅下降最可能反映了由于结合亲和力降低而导致的显著或完全的受体解离。本实验室先前的研究表明，与CMG2-PAprepore相互作用相比，CMG2与完全伸展的PApore的结合可忽略不计6。此外，在多次重复实验中，所有LFN-PAprepore-CMG2向LFN-PApore转变的传感图谱动力学曲线在pH降低时均表现出可重复性。
在酸化前后，生物传感器结合的复合物均易于释放，可用于负染电镜观察和质谱鉴定（图5）。电镜结果中的代表性复合物如图6所示。酸化前的早期内体样品网格显示存在密度信号，符合完整的三元复合物LFN-PAprepore-CMG2的结构特征；而酸化后的复合物网格则显示PA已转变为孔道构象，并通过胶束包埋实现溶解，未见明显的CMG2密度信号。
通过质谱法（MS）验证了酸化前和酸化后复合物的身份。数据库中包含PA（P13423）、LFN（P15917）和CMG2（P58335）的序列，并以源自NCBInr数据库的小鼠蛋白质数据库作为背景。在首次数据库搜索中仅获得目标蛋白质，其氨基酸覆盖度如下：对于三元复合物和二元复合物，PA分别为54%和22%，LF分别为36%和6%，CMG2为43%（在二元复合物中未检测到CMG2）。为了最大化蛋白质的氨基酸覆盖度，使用仅包含三种目标蛋白质的数据库进行了第二次肽段/蛋白质鉴定。早期内体前质谱样品中包含全部三种毒素组分的肽段，LFN、PA和CMG2的覆盖度分别为60.46%、67.97%和54.15%（图7）。晚期内体后的结果（见图8）仅包含来自LFN和PA的肽段（覆盖度分别为57.41%和67.79%）。在晚期内体样品中未检测到CMG2，这与BLI信号在孔道形成过程中出现的纳米级下降现象一致。
<img alt="蛋白质复合物组装过程；生物传感器示意图；质谱；电子显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 利用电子显微镜和质谱技术分析在BLI生物传感器上组装并分离的蛋白质复合物的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结合界面示意图；生物偶联方法，E126LFN 结构，SH-NH 键形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 生物传感器激活：在 BLI 生物传感器上进行方向特异性组装的第一步。E126C 致死因子N端结构域（LFN）通过硫醚键连接，形成正确取向的 PAprepore 结合界面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示结合曲线图的蛋白质结合过程示意图；步骤：LFN 加载、胶束结合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. 利用生物层干涉技术（BLI）监测炭疽毒素的组装与解离过程：传感图显示了由于依次特异性添加炭疽毒素组分所导致的信号振幅随时间的变化，起始步骤为LFN在生物传感器上的加载（见表 1中的步骤4）。随后将PAprepore加载至传感器表面，接着加入可溶性CMG2受体。所形成的早期内体前体复合物由LF-PAprepore-CMG2组成。为模拟向晚期内体环境的转变，对完整组装的功能性炭疽毒素施加低pH脉冲（pH 5.0），该条件会削弱受体结合，促使前孔结构转变为跨膜插入的伸展孔构象。通过加入胶束确认跨膜孔结构的暴露并实现其溶解。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示酸化效应对蛋白质动力学影响的瞬态吸收光谱图及三维结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4. CMG2释放的BLI传感图：酸化步骤的曲线显示振幅先出现初始上升或“尖峰”，随后出现更大程度的下降，可能分别对应孔道形成和受体解离。垂直的红色虚线表示新步骤的开始。传感图以加粗的红色虚线为基准对齐。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物传感器复合物释放；电子显微镜、质谱图；蛋白质分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5. 利用电子显微镜（EM）和质谱（MS）分析在BLI生物传感器上组装并分离的蛋白质复合物：附着在生物传感器上的复合物可轻松释放至含有DTT的5 µL缓冲液中，用于负染电子显微镜观察和质谱鉴定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质释放过程；示意图；生物传感器，酸化步骤；纳米尺度可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 利用电子显微镜可视化蛋白质复合物：早期内体前体样品网格显示存在与完整三元复合物（LFN-PAprepore-CMG2）一致的密度。晚期内体复合物网格显示PA已转变为孔道结构，并被胶束溶解，未见明显的CMG2密度。预测复合物的模型（左侧）与所示单个颗粒采用相同比例尺。每个颗粒下方显示了根据EM密度大小预测的蛋白质并进行彩色标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质生物传感器释放示意图；LFN、PA、CMG2 蛋白的覆盖数据；实验分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7. 通过质谱法验证蛋白质复合物：早期内体前体的质谱样本中检测到来自三种毒素组分的肽段，LFN、PA 和 CMG2 的覆盖度分别为 60.46%、67.97% 和 54.15%。错误发现率（FDR）大于或等于 5% 的肽段以黄色显示，FDR 大于或等于 1% 的肽段以绿色显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过生物传感器进行蛋白质相互作用分析；示意图显示LFN、PA和CMG2的检测及覆盖数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8. 通过质谱法验证蛋白质复合物：晚期内体后样品中含有来自LFN和PA的肽段（覆盖度分别为57.41%和67.79%），但未检测到CMG2。错误发现率（FDR）≥5%以黄色显示，FDR≥1%以绿色显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>时间 (s)</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>初始基线</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>激活</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>激活</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN 加载</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>半胱氨酸淬灭</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>基线</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>PAprepore 结合</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>基线</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 结合</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>基线</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>酸性转变</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>基线</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>胶束结合</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 单次BLI运行组装炭疽毒素复合物的各步时间。注意，基线步骤用于洗去前一步中未结合的蛋白质和/或建立新的缓冲液基线。

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。

在体内，蛋白质通常作为大型大分子复合物的一部分，其结合特异性与动态特性最终决定了功能输出。在本研究中，……

本实验的总体目标是利用生物膜干涉技术，在不同 pH 环境下观察蛋白质复合物的动态组装过程，并通过电子显微镜和质谱技术确认其组分。识别并理解调控蛋白质复合物形成与组装的特异性，是生物化学研究人员高度关注的问题。我们今天所讨论的方法学使研究人员能够组装、可视化并验证预测的大型分子复合物。生物传感器表面的复杂特性使得研究人员能够轻松地将组装好的复合物释放到微小体积中，用于电子显微镜和质谱分析。在本演示中，我们追踪了炭疽毒素复合物在pH诱导下的结构重排动力学过程，并通过电子显微镜和质谱方法验证了这些重排，整个过程避免了聚集现象的发生。本次展示将由本实验室的研究生Alexandra Machen和Pierce O'Neil完成，内容包括在BLI生物传感器表面进行炭疽毒素组装、宏量样品释放以及电镜负染色操作。Dr.Antonio Artigues 在使用 Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪分析和鉴定 BLI 释放的微样品方面发挥了关键作用。首先，将一种胺反应性第二代 BLI 生物传感器探针浸入 250 µL 水中进行水合，并孵育 10 分钟。在 Blitz 软件中，按照下表列出的时间参数设置步骤时间。通过将生物传感器尖端浸入250 µL水中30秒，测量生物传感器厚度和密度的初始基线，从而启动BLI运行。接下来，将尖端浸入250 mL含50 mM NHS和200 mM EDC的溶液中7分钟，以活化生物传感器。然后，将活化的生物传感器浸入溶于0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）的50 mM PDEA溶液中5分钟，以生成活化的生物反应表面。现在，将活化的生物反应性生物传感器浸入含有100纳摩尔E126C LFn的250微升溶液中，该溶液由10毫摩尔醋酸钠（pH 5）和100毫摩尔氯化钠缓冲液组成，浸泡5分钟。将LFn探针浸入50毫摩尔L-半胱氨酸、1摩尔氯化钠、0.1摩尔醋酸钠（pH 5）溶液中4分钟，以淬灭任何剩余的游离巯基反应性基团。将淬灭后的LFn探针浸入50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中，建立缓冲液基线，随后将探针浸入0.5微摩尔保护性抗原前孔（protective antigen prepore）、50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中5分钟，以形成LFn-PA前孔复合物。一旦PA前孔结合完成，将探针从PA前孔溶液中取出，并浸入50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中30秒，以洗去非特异性结合的PA前孔。将LFn-PA前孔复合物浸入含有0.5微摩尔CMG2的50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中，孵育5分钟。再将LFn-PA前孔-CMG2复合物浸入50毫摩尔Tris、50毫摩尔氯化钠溶液中30秒，以洗去未结合的CMG2，形成早期内体前体复合物。进行电镜分析时，将生物传感器探针浸入含有5 µL 50 mM DTT、50 mM Tris和50 mM氯化钠的PCR管中，以从生物传感器探针上释放LFn PA-前孔 CMG2复合物。为进行该复合物肽段的串联质谱分析，将生物传感器浸入含有5 µL 50 mM DTT、6 M无角蛋白的盐酸胍和25 mM碳酸氢铵（pH 8）的PCR管中，以从生物传感器探针上释放LFn PA-前孔 CMG2复合物。为观察pH转变后的复合物，按照上述方法在生物传感器上组装LFn PA-前孔 CMG2复合物。将生物传感器尖端浸入5 mM乙酸盐缓冲液（pH 5）中5分钟，以启动PA-prepore向PA-pore的构象转变。该转变表现为电流信号振幅先升高，随后出现较大程度的下降，推测此下降与受体完全解离相关，原因是结合亲和力降低。用于电镜分析时，将生物传感器尖端浸入含有1.25 mM胶束的溶液中5分钟，以防止二硫键释放后在溶液中发生聚集。进行负染透射电镜观察时，首先在0.38毫巴稳定气压和-15毫安条件下对覆有碳膜的铜网（300目）进行辉光放电处理20秒，随后向腔体内通入空气卸真空。用一对洁净镊子夹住铜网。然后吸取4 µL释放的复合物样品滴加到铜网上，静置吸附60秒。用滤纸楔形片将残留液体吸走。然后用移液器将5微升0.75%、0.02微米过滤的甲酸铀酰溶液滴加到载网上进行染色，5秒后用滤纸吸去多余的染色液。将载网覆盖后在室温下晾干。然后使用透射电子显微镜观察样品。最后，根据文本方案制备质谱样品后，在自动控制下使用 CID 模式和 35 的归一化碰撞能量操作质谱仪，持续进行一次 MS 扫描，随后在三秒内尽可能多地完成串联 MS-MS 扫描。BLI 传感图曲线是由于炭疽毒素组分的特异性结合所引起的振幅变化的实时读数。第一个上升阶段是LFn结合到针尖上。在淬灭并建立基线后，PA前孔与LFn结合，随后加入可溶性CMG2，形成组装好的早期内体前体复合物。该复合物随后暴露于低pH环境，导致受体结合减弱，并促使前孔转变为伸展的孔构象，这一转变可通过加入胶束得以确认。此处展示的是复合物从生物传感器释放后获得的负染电镜图像。早期内体样品网格显示存在与完整的三元复合物（LFn-PA前孔-CMG2）一致的密度。酸化后复合物网格显示PA已转变为孔结构，并通过胶束包埋而溶解，未见明显的CMG2密度。质谱分析（MS）证实了蛋白质复合物的存在，早期内体前质谱样本中检测到三种毒素组分的肽段，LFn、PA 和 CMG2 的覆盖率分别为 60.46%、67.97% 和 54.15%。晚期内体样本中仅检测到 LFn 和 PA 的肽段。CMG2 的缺失与生物膜层干涉（BLI）技术中观察到的纳米级尺寸减小现象一致，该现象发生在孔道形成过程中。能够监测并验证大分子复合物的组装过程，是深入理解大型生物大分子复合体特异性和功能性的关键步骤。将预先组装的生物大分子复合物从生物传感器释放到微体积中以用于电子显微镜观察，这一能力将对结构分析极为有益。我们对生物传感器组装复合物成分的分析仅使用了0.04飞摩尔的释放复合物，即可在内体酸化前后鉴定其组分。该生物传感器组装释放方案可进一步应用于追踪其他细菌毒素或病毒蛋白结构中天然但难以捕捉的pH诱导内体转化过程，同时还能避免蛋白质聚集。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

质谱法（MS）已成为研究大分子组装体结构与动态的重要工具。本文整合了基于质谱的方法，用于探究蛋白质复合物的形成及配体结合。...

通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

本文介绍了一种使用切片机的多功能冷冻切片BN-MS方案，适用于高分辨率复合物组分析。...

通过冷冻切片BN-MS分析实现高分辨率复合物组学分析

本方案将质谱光度法与一种新型微流控系统相结合，用于研究低亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法基于对溶液中高浓度复合物的快速稀释，从而实现对低亲和力的测量，并拓展了质谱光度法的应用范围。...

通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。...

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

本文介绍了一种使用软件套件SPHIRE处理冷冻电镜图像的实验方案。该方案几乎适用于所有以接近原子级分辨率为目标的单颗粒电镜研究项目。...

使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

学习利用生物层干涉技术实时监测炭疽毒素复合物的动态组装与解离过程，并结合电子显微镜和质谱分析进行结构验证。该方法适用于研究蛋白质复合物在不同pH环境下的构象变化机制。

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

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