Name: 抗菌肽定位的细菌 Spheroplasts 和原生质体的生产与可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习制备大肠杆菌球质体和巨大芽孢杆菌原生质体的方法，用于可视化抗菌肽与细菌膜的相互作用。该技术有助于研究肽的膜定位与跨膜转运机制，克服常规细菌成像的分辨率限制。

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本研究由美国国家过敏与传染病研究所（NIH-NIAID）资助，项目编号 R15AI079685。

1. 溶液配制
注意：请按顺序准备步骤 1.1–1.9 和 1.8–1.11 中所述的溶液，分别用于制备 E. coli 球状体和 B. megaterium 原生质体。
<ol>
	<li>将10.34 g Tris HCl和4.17 g Tris OH溶解于50 mL去离子水中，配制pH 7.8的1 M Tris-Cl溶液2O 在125 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并置于锥形管中，室温保存。</li>
	<li>配制溶液A（20 mM MgCl₂）2，0.7 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.10 g MgCl2 （95.2 g/mol）和 11.98 g 蔗糖（342.3 g/mol）溶于 25 mL dH₂O2在125 mL锥形瓶中加入O。 500 &#181;L 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 定容至 50 mL。使用 25 mm 注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并置于锥形管中，室温保存。</li>
	<li>配制溶液 B（10 mM MgCl₂）2，0.8 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.05 g MgCl2 （95.2 g/mol）和 13.69 g 蔗糖（342.3 g/mol）溶于 25 mL dH₂O2O，在125 mL锥形瓶中。加入 500 &#181;L 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 定容至 50 mL。使用 25 mm 注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并置于锥形管中，室温保存。</li>
	<li>通过将13.69 g蔗糖（342.3 g/mol）溶解于50 mL dH₂O中，配制0.8 M蔗糖溶液2O 在125 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并置于锥形管中，室温保存。</li>
	<li>将0.015 g脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶解于3 mL去离子水中，配制成5 mg/mL的DNase I溶液2O，在50 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜。将溶液分装至微量离心管中，于 -20 &#176;C.</li>
	<li>配制 0.125 M 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0：将 0.698 g 乙二胺四乙酸二钠二水合物（372.2 g/mol）溶解于 15 mL dH₂O 中2O，在125 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并置于锥形管中，室温保存。</li>
	<li>准备 600 &#181;g/mL 将0.03 g头孢氨苄水合物（365.404 g/mol）溶于50 mL去离子水中制备头孢氨苄溶液2O 在125 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并储存于锥形管中，置于 4 &#176;C.</li>
	<li>将0.015 g溶菌酶溶解于3 mL去离子水中，配制成5 mg/mL的溶菌酶溶液2O 在50 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜。将溶液分装至微量离心管中，于 -20 &#176;C.</li>
	<li>将30 g胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）溶解于1 L去离子水中，配制3% w/v的TSB溶液2O 在2 L烧瓶中。将溶液分装至含有25 mL或100 mL TSB的烧瓶中，用于制备 E. coli 原生质球或 B. megaterium 原生质体, 分别。将烧瓶进行高压灭菌以消毒液体培养基。无菌的TSB可在室温或 4 &#176;C.</li>
	<li>制备溶液C（1 M 蔗糖，0.04 M 马来酸盐，0.04 M MgCl₂）2，pH 6.5）通过溶解 34.23 g 蔗糖（342.3 g/mol）、0.46 g 马来酸（116.07 g/mol）和 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) 溶于 100 mL dH₂O2O，在250 mL锥形瓶中。调节pH至6.5。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 &#181;m 膜并置于锥形管中，室温保存。</li>
	<li>在1 L玻璃瓶中混合100 mL 3% w/v TSB和100 mL溶液C，配制200 mL原生质体培养基。经高压灭菌后，室温保存。</li>
</ol>
2. 过夜培养物的制备
注意：执行第2至4节时应采用适当的无菌技术。如需要，可使用含有抗生素抗性质粒的菌株，以减少潜在污染。若使用具有抗生素抗性的菌株，需在步骤2.1、3.1–3.2以及4.1–4.4中加入相应的抗生素。
<ol>
	<li>使用无菌移液器吸头挑取单个细菌菌落，接种于含有 2–3 mL 3% w/v TSB 的 14 mL 培养管中，制备过夜培养物。在 37 °C 条件下振荡培养 16–21 小时。</li>
</ol>
3. 革兰氏阴性菌的制备 E. coli 原生质球
<ol>
	<li>在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:100比例稀释至25 mL含3% w/v TSB的溶液中，于37 °C振荡培养约2.5小时，直至溶液在600 nm处的光密度达到0.5–0.8。使用分光光度计测定光密度。</li>
	<li>在250 mL锥形瓶中，将上述培养物按1:10比例稀释至30 mL含3% w/v TSB的溶液中，并在37 °C振荡培养2.5小时，同时加入60 µg/mL头孢氨苄（347.4 g/mol），以诱导形成长度约为50–150 µm的单细胞丝状体，可在光学显微镜下以1,000倍放大观察（图1B）。</li>
	<li>将细菌溶液在4 °C条件下以1,500 × g离心4分钟，收集丝状体。倾去并弃除上清液，保留沉淀。</li>
	<li>轻轻加入1 mL 0.8 M蔗糖溶液洗涤沉淀，注意勿扰动沉淀。孵育1分钟后，弃除上清液，勿扰动沉淀。</li>
	<li>按顺序向沉淀中加入150 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）、120 µL 5 mg/mL溶菌酶、30 µL 5 mg/mL DNase I和120 µL 0.125 M EDTA，并在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>使用微量移液器在1分钟内将1 mL溶液A缓慢加入步骤3.5制备的溶液中，同时手动轻轻旋转混匀。室温孵育4分钟。</li>
	<li>将7 mL 4 °C的溶液B分装至两个15 mL圆锥形离心管中。将步骤3.6制备的溶液等量加入这两个管中。在4 °C条件下以1,500 × g离心4分钟。</li>
	<li>使用血清移液器小心移除上清液，仅保留1-2 mL，注意勿扰动沉淀。使用P1000微量移液器轻轻吹打重悬沉淀。在光学显微镜下以1,000倍放大观察样品，目视检查原生质球的形成情况（图1C）。</li>
	<li>将原生质球储存于-20 °C，最长可保存一周，或直至经历3次冻融循环。</li>
</ol>
4. 革兰氏阳性菌的制备 B. megaterium 原生质体
<ol>
	<li>在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:1,000比例稀释于100 mL含3% w/v TSB的培养基中，于37 °C振荡培养约4.5小时，直至溶液在600 nm处的光密度达到0.9–1.0。使用分光光度计测定光密度。</li>
	<li>将液体培养物倒入两个50 mL离心管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>使用移液管弃去两个离心管中的上清液。将每管沉淀重悬于2.5 mL原生质体培养基中，并将重悬液合并至一个离心管内。用移液管将混合后的重悬液转移至125 mL锥形瓶中。</li>
	<li>加入1 mL浓度为5 mg/mL的溶菌酶溶液，在37 °C振荡孵育1小时。</li>
	<li>在1,000倍光学显微镜下观察原生质体生长情况，注意是否存在异常形态，例如细菌呈现膨胀杆状而非球形（图2）。使用移液管将溶液转移至15 mL离心管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>倾去上清液，将沉淀重悬于5 mL原生质体培养基中。将原生质体储存在-20 °C，可保存一周，或直至经历3次冻融循环。</li>
</ol>
5. 成像用肽溶液和膜染料的制备
<ol>
	<li>肽溶液
	<ol>
		<li>在用铝箔包裹的微量离心管中，将 2 mg FITC 标记的 BF2 P11A 溶解于 800 µL 去离子水（dH2O）中。使用至少含有一个色氨酸残基的肽，以便进行蛋白质浓度测定。</li>
		<li>使用分光光度法，对肽溶液在 280 nm 处的吸光度进行三次重复测量。利用色氨酸的摩尔消光系数（5,700/Mcm）计算肽的浓度。</li>
		<li>用去离子水（dH2O）将肽溶液稀释至终浓度为 100–200 µM。将溶液储存于微量离心管中，于 -20 °C 保存，并用铝箔包裹以避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜染料
	<ol>
		<li>在微量离心管中，通过将 5 mg di-8-ANEPPS 溶解于 843.3 µL DMSO 中，配制 10 mM 的 di-8-ANEPPS 储存液（分子量：592.9 g/mol）。储存时用铝箔包裹，于 4 °C 避光保存。</li>
		<li>在微量离心管中，取 3 µL 10 mM di-8-ANEPPS 加入 997 µL DMSO 中，配制 1 mL 浓度为 0.03 mM 的 di-8-ANEPPS 溶液。将溶液储存于微量离心管中，于 4 °C 保存，并用铝箔包裹以避光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 可视化 E. coli 原生质球和 B. megaterium 使用共聚焦显微镜观察原生质体
<ol>
	<li>取 5 µL 原生质体或球状体，用移液器滴加到多聚-L-赖氨酸包被的玻片上。向玻片中加入 2 µL FITC 标记的抗菌肽（100–200 µM），避光孵育 3 分钟。</li>
	<li>向玻片中加入 1 µL 膜染料 di-8-ANEPPS（0.03 mM），避光孵育 3 分钟。盖上盖玻片，并用指甲油封片。</li>
	<li>打开共聚焦显微镜和氩离子激光器。将氩离子激光器的输出功率和透射率均调节至 20%。</li>
	<li>分别设置 FITC 标记肽的发射波长范围为 499–532 nm，di-8-ANEPPS 标记膜染料的发射波长范围为 670–745 nm。</li>
	<li>使用 63X 物镜对原生质体或球状体进行成像（图 1 和 图 2）。利用成像软件获取 8 位、512 × 512 的复合 z 轴层扫图像，图像由贯穿整个球状体或原生质体的 0.5 µm 切片组成。 
	注意：在对球状体和原生质体进行成像时，应仔细考虑减少发射光串扰。详见讨论部分。</li>
</ol>
7. AMP 定位的表征
<ol>
	<li>在成像软件中打开复合z轴层叠图像。找到球形体或原生质体最中心的切片，在膜上放置一个圆形感兴趣区域（ROI）（直径0.3 µm）（ROI 1），在球形体或原生质体中心放置第二个感兴趣区域（ROI 2），并在远离球形体或原生质体的区域放置第三个感兴趣区域以测量背景荧光（ROI 3）（图5）。避免包含饱和像素。各感兴趣区域中的荧光强度可由成像软件计算得出。 
	注意：当肽未定位于整个膜时，应将ROI 1绘制在肽有定位的膜区域。</li>
	<li>使用以下公式计算胞内肽荧光强度与膜上肽荧光强度的比值： 
	<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg" /> 
	注意：从ROI 2和ROI 1的荧光强度中减去ROI 3的荧光强度，以校正背景荧光。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所展示的实验方案使研究人员能够更快地获取更大样本量的细菌图像，因为膨胀后的球形细菌更易于定位、定向和成像。这种增强的数据采集能力在多个方面具有重要价值。首先，它使得对肽段定位模式进行更系统的定量分析成为可能。虽然较小的图像集已能展示定性趋势，但只有高质量的大样本图像集才能揭示定位模式中更为细微的趋势，例如肽段发生跨膜转运与仅定位于膜上的细胞所占的百分比。此外，由于能够更清晰地区分细胞内部荧光与膜上的定位信号，研究人员可以更方便地开展时间序列研究，以评估肽段与细菌细胞相互作用的速度以及定位模式随时间的变化情况。分辨率的提升还使研究人员能够观察在较小细菌中无法识别的肽段定位趋势。例如，在我们观察到的部分球状体和原生质体中，肽段似乎特异性地定位于细胞膜的某些特定区域。 即， 肽信号未在细菌周围形成完整、连续的环状结构，而是呈现部分点状标记。在其他情况下，肽可能未在细菌膜内完全均匀分布。 即， 肽信号并未完全充满细菌的内部空间。尽管在当前分析中我们未深入探讨这些分布趋势，但在成像球状体和原生质体而非标准细菌细胞时，研究此类定位趋势变得可行。这些优势同样适用于确定除抗菌肽（AMPs）以外其他肽类（如细胞穿透...

抗菌肽（AMPs）因其作为传统抗生素替代品的潜力而受到广泛关注1,2,3,4,5。AMPs通过两种机制杀灭细菌：一种是跨膜转位后与核酸等细胞内组分相互作用，另一种是破坏细胞膜通透性，导致细胞内容物泄漏6。除了作为抗生素的应用外，由于转位型AMPs能够非破坏性地穿过不通透的细胞膜，因此也可被改造用于药物递送领域7,8。因此，我们致力于阐明AMPs作用的基本机制，为其在药物设计中的应用奠定基础。
共聚焦显微镜可用于评估荧光标记的抗菌肽（AMPs）在细菌细胞中的定位模式，从而揭示其作用机制9,10,11,12,13,14。通过标记细菌的膜结构，可以判断荧光标记的肽是定位于细菌细胞膜还是细胞内区域。然而，由于细菌体积小且呈杆状，其在载玻片上的取向多变，受限于传统光学显微镜的分辨率，成像较为困难，因此该技术的应用受到一定限制15。
本方法的目的是通过共聚焦显微镜增强荧光标记肽定位模式的可视化效果。通过将微小、细长、杆状的革兰氏阴性 Escherichia coli（E. coli）和革兰氏阳性 Bacillus megaterium（B. megaterium）细菌转化为增大的球形结构，即分别称为球形体（适用于革兰氏阴性菌株）和原生质体（适用于革兰氏阳性菌株），从而实现可视化增强16,17,18,19,20,21。由于球形体和原生质体尺寸更大且形状对称，因此更易于成像，细菌在载玻片上的取向不再影响其成像效果。此外，我们提出了一种系统性的方法，用于定量分析共聚焦显微镜数据，以区分抗菌肽（AMPs）是定位于膜上还是发生跨膜转运。应用这些方法可更清晰地区分荧光标记肽的定位模式。本文所述方案也可用于评估除抗菌肽之外的多种膜活性物质的定位情况，包括细胞穿透肽。
该技术的一个显著优势在于，它能够在单细胞水平上揭示抗菌肽（AMPs）的作用机制，从而可能发现细胞间的异质性15，而不同于其他常用于鉴定AMPs作用机制的荧光检测方法，后者仅能提供整体水平的估计值9,22,23,24,25。利用球状体和原生质体来评估AMP进入细胞的情况具有特殊意义26&#160;，因为与用于评估细胞摄取的其他模型（如脂质体）相比，它们在生理上更具相关性15&#160;24。

<table><tbody><tr><td>盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris HCl）</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷碱（Tris OH）</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>原始方案开发中使用 Sigma 106361；该产品已停产，由 ED2SS 替代</td></tr><tr><td>头孢氨苄水合物</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL 胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>定制订购</td><td></td></tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>原始方案开发中使用 Sigma D8779；该产品已停产，由 34869 替代</td></tr><tr><td>马来酸</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 &amp;mu;m HT Tuffryn 膜</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>用于图像采集</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>用于图像处理</td></tr></tbody></table>

细菌球状体和原生质体的制备与可视化以表征抗菌肽的定位

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

共聚焦显微镜作为评估肽在细菌内定位模式的方法，常受限于传统光学显微镜的分辨率。由于特定显微镜的分辨率难以轻易提升，本文提供了将小型杆状革兰氏阴性菌进行改造的实验方案 大肠杆菌 (E. coli以及革兰氏阳性 Bacillus megaterium (B. megaterium）转化为更大、易于成像的球形结构，称为球状体或原生质体。这种转化使观察者能够快速而清晰地判断肽是否嵌入细菌膜中即， 膜定位）或穿越膜进入细胞（即， 转位）。通过该方法，我们还提供了一种系统性表征肽类分子是否具有膜定位或转位能力的策略。尽管该方法适用于多种膜活性肽和细菌菌株，但我们通过观察抗菌肽Buforin II P11A（BF2 P11A）与 E. coli 原生质球和 B. megaterium 原生质体

通过使细菌膨胀并呈球形化，我们可以轻松区分肽是定位于细菌膜上，还是易于跨膜转运进入细菌内部。由于常规光学显微镜的分辨率有限，难以区分肽信号来自正常细菌（直径通常仅为1 µm）的膜上还是胞内空间，因为定位于膜上的信号会与胞内信号重叠（图3A）。相比之下，球状体（2–5 µm）和原生质体（2–3 µm）的尺寸明显大于正常细菌，使得膜标记物与胞内空间之间具有清晰的分辨度，从而更易于判断肽的定位（图3B）。
在此，利用球状体和原生质体来展示N端FITC标记的抗菌肽BF2 P11A的定位模式。我们观察到FITC标记的BF2 P11A既定位于细胞膜，又可跨细胞膜易位 E. coli 原生质球和 B. megaterium 原生质体 (图4）。虽然已观察...

本文介绍了一种制备革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）球状体和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，B. megaterium）原生质体的实验方案，以清晰观察并快速表征肽与细菌之间的相互作用。该方法为定义定位于膜及跨膜转运的肽提供了一种系统性的研究手段。

共聚焦显微镜用于评估肽在细菌内定位模式的方法常受限于其分辨率极限……

该方法有助于解答抗菌肽领域中的关键问题，即肽是否定位于细胞膜或穿越细胞膜。利用球状体和原生质体，可以在生理相关性较强的模型系统中实现对肽定位的可视化与分析，从而避免细菌细胞成像时所遇到的分辨率难题。尽管该方法可用于研究抗菌肽，也可应用于其他具有膜活性的物质，例如细胞穿透肽。应在生物安全柜或层流罩中，采用适当的无菌技术制备革兰氏阴性大肠杆菌球状体和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌原生质体。若需要，可使用含有抗生素抗性质粒的细菌菌株，并可在开放的实验台面上制备球状体和原生质体。本视频中，使用具有抗生素抗性的细菌菌株在开放实验台面上制备球状体和原生质体。为制备过夜培养物，使用无菌移液器吸头将单个细菌菌落从固体琼脂培养板转移至含有两到三毫升3%胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的14毫升培养管中，在37摄氏度下振荡培养16至21小时。为制备革兰氏阴性大肠杆菌（E.coli）原生质球，将过夜培养物按1:100比例稀释，并加入25毫升TSB至250毫升锥形瓶中，再将细菌放回振荡培养箱继续培养2.5小时。当溶液在600纳米处的光密度达到0.5至0.8时，将培养物按1:10比例稀释于新鲜TSB中，置于新的250毫升锥形瓶内，进行第二次2.5小时振荡培养，最终头孢氨苄（cephalexin）的有效浓度为每毫升60微克。在1000倍光学显微镜下观察，制备长度约为50至150微米的单细胞丝状体。离心细菌溶液以收集丝状体，并倾去上清液。轻轻加入1毫升0.8摩尔蔗糖溶液洗涤丝状体，注意不要扰动沉淀。一分钟后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后按相应顺序向纤维中加入指定的试剂。室温孵育十分钟后，在一分钟内逐渐加入一毫升溶液A，同时用手轻轻旋转混匀。室温孵育四分钟后，将纤维悬液均分为两等份，分别加入两个含有七毫升4°C溶液B的15毫升锥形管中。接下来，通过离心收集纤维沉淀，并使用巴斯德吸管小心吸除上清液，仅保留一至二毫升上清液，注意不要扰动沉淀。使用 p1000 移液器轻轻重悬沉淀。通过光学显微镜检查样品的小份 aliquot，以确认原生质球的形成。原生质球可在 -20 摄氏度下保存长达一周，或直至经历三次冻融循环。 为了制备革兰氏阳性巨大芽孢杆菌（B. megaterium）原生质体，将过夜培养的细菌培养物按1:1000的比例稀释于250毫升锥形瓶中的100毫升含3% TSB的培养基中，在37摄氏度下振荡培养4.5小时。当液体培养物在600纳米处的光密度达到0.9至1.0时，将菌液分装至两个50毫升锥形管中进行离心，并使用移液器吸除上清液。每管沉淀用2.5毫升原生质体培养基重悬，然后将悬液合并至一个125毫升锥形瓶中继续培养。向培养物中加入1 mL浓度为5 mg/mL的溶菌酶，在37°C下振荡孵育1小时。在光学显微镜下监测原生质体的生长情况，并记录任何异常现象，例如细菌呈现膨胀的杆状而非球形。孵育结束后，将悬浮液转移至15 mL锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于5 mL原生质体培养基中。原生质体可在零下20摄氏度保存长达一周，或直至经历三次冻融循环。为观察球状体或原生质体，取5微升目标悬浮液滴加至多聚-L-赖氨酸包被的玻片上，随后加入2微升FITC标记的100至200微摩尔抗菌肽（AMP）。在避光条件下孵育3分钟后，向样品中加入1微升合适的膜染料，再于暗处孵育3分钟。孵育结束后，用盖玻片覆盖标记的球状体或原生质体，并用指甲油密封盖玻片。为观察细胞，打开共聚焦显微镜及相关激光器，选择63倍物镜，然后使用相应的成像软件获取8位、512×512的复合Z轴层扫图像，每层厚度为0.5 µm，覆盖每个目标细菌细胞的完整范围。为观察荧光标记抗菌肽（AMP）的定位情况，将复合Z轴层扫图像导入合适的图像分析程序，找到第一个目标球状体或原生质体最中心的切片。在膜上放置一个直径为 0.3 微米的圆形感兴趣区域，一个位于细胞中心，另一个置于细胞外以测量背景荧光，注意避免饱和像素。软件可据此计算每个感兴趣区域的平均荧光强度。由于传统光学显微镜的分辨率限制，难以区分荧光标记的肽信号是来自细菌的膜还是胞内空间。由于信号定位于细胞膜时会看似与胞内空间重叠。相比之下，与正常细菌相比，球状体和原生质体的体积增大，使得膜标记物与胞内空间之间呈现出清晰的分辨，从而更易于区分肽的定位。例如，通过共聚焦荧光显微镜观察，可以可视化荧光标记的肽在大肠杆菌球状体（E.coli spheroplast）和巨大芽孢杆菌原生质体（B.megaterium protoplast）中的膜定位及其跨细胞膜的转位过程，如前所示。在球状体或原生质体的膜区域、胞内区域以及背景区域设置感兴趣区域，可计算每个与抗菌肽（AMP）相互作用的球状体或原生质体中胞内肽荧光强度与膜上肽荧光强度的比值。例如，该方法可用于观察组蛋白来源的微生物肽突变体与大肠杆菌球状体及巨大芽孢杆菌原生质体之间的相互作用。在本实验中，AMP在两种细菌菌株中均表现出相似的定位模式，凸显其相对于野生型肽的转位能力降低。该技术最终使研究人员能够在单细胞水平上探究肽的定位模式。为研究目标肽的作用机制提供见解。除了使研究人员能够收集更多图像以系统表征肽的作用机制外，较大球状体和原生质体的图像也比小型细菌细胞的图像更便于进行定量分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

抗菌肽定位的细菌 Spheroplasts 和原生质体的生产与可视化

本文描述了从重组大肠杆菌（E.

使用活细胞荧光显微镜观察细菌毒素诱导的细胞反应

来源：Figueroa, D. M., 等. 抗菌肽定位表征中细菌球状体与原生质体的制备与可视化。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了通过首先抑制大肠杆菌（Escherichia coli）细胞分裂以诱导丝状化，随后进行细胞壁的酶解，从而制备大肠杆菌球状体的方法。该过程包括可控地添加螯合剂、DNase...

E. coli 原生质球的制备

来源： Figueroa, D. M., et al. 抗菌肽定位表征中细菌球状体与原生质体的制备与可视化。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了从革兰氏阳性菌Bacillus...

从革兰氏阳性菌 Bacillus megaterium 制备原生质体

来源：Bratton, B. P., et al., 用于精确细胞表征与精准蛋白质定位的细菌细胞三维成像。J. Vis. Exp.

通过荧光成像实现细菌蛋白质分布的三维可视化

来源：Figueroa, D. et. al. 细菌球状体与原生质体的制备及可视化以表征抗菌肽的定位。 J. Vis. Exp.

从革兰氏阴性细菌制备原生质球

我们提供一种方法，利用大肠杆菌（Escherichia...

用于筛选抗体片段文库的细菌内膜展示技术

该方案介绍了 大肠杆菌基于选择性压力将非天然氨基酸（ncAAs）引入乳酸乳球菌抗菌肽乳酸链球菌肽（nisin）中。其特性可在重组表达过程中被改变 通过...

通过非经典氨基酸的选择性压力整合产生的抗菌肽

基于荧光蛋白的方法在监测细菌向宿主细胞分泌效应蛋白时面临挑战，这主要是由于荧光蛋白与III型分泌系统之间存在不兼容性。本文采用一种优化的分裂型超折叠GFP系统，用于可视化细菌向宿主植物细胞中分泌的效应蛋白。...

利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

本实验方案详细描述了一种用于在胞外膜结合囊泡内生产重组蛋白（包括通常不溶性蛋白或含二硫键蛋白）的细菌表达方法。该方法有望应用于应用生物技术、医学等多个广泛的科学研究领域。...

优化生产与分析重组蛋白填充囊泡的方法 E. coli

本方案描述了一种制备并评估阳离子肽Mel4及肽模拟物RK758的抗菌活性与细胞毒性的方法。通过整合化学合成、重组表达及标准化功能检测，该方法为肽类分子及小分子模拟物的制备与测试提供了简化的操作流程。...

抗菌肽及其模拟物的制备与检测

学习制备大肠杆菌球质体和巨大芽孢杆菌原生质体的方法，用于可视化抗菌肽与细菌膜的相互作用。该技术有助于研究肽的膜定位与跨膜转运机制，克服常规细菌成像的分辨率限制。

细菌球状体和原生质体的制备与可视化以表征抗菌肽的定位

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