抗菌肽定位的细菌 Spheroplasts 和原生质体的生产与可视化

这种方法可以帮助回答抗菌肽领域中关于肽是定位于细胞膜还是跨细胞膜反式定位的关键问题。使用原生质球和原生质体可以在生理相关的模型系统中对肽定位进行可视化和分析，而不会遇到细菌细胞成像遇到的分辨率挑战。虽然这种方法可以提供对抗菌肽的见解，但它也可以应用于其他膜活性剂，例如细胞渗透肽。

革兰氏阴性大肠杆菌原生质球和革兰氏阳性巨型芽孢杆菌原生质体应在生物安全柜或层流罩中使用适当的无菌技术制备。如果需要，细菌菌株可以包含抗生素抗性质粒，并且可以在开放式实验室工作台上制备原生质球和原生质体。在本视频中，原生质球和原生质体是在开放式实验室工作台上使用抗生素耐药细菌菌株制备的。

要构建过夜培养物，请使用无菌微量移液器吸头将单个细菌菌落从固体琼脂培养板转移到 14 毫升培养管中，该培养管含有 2 至 3 毫升 3% 胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB），在 37 摄氏度下振荡孵育 16 至 21 小时。为了制备革兰氏阴性大肠杆菌原生质球，以 1：100 的比例稀释过夜培养物，并在 250 毫升培养瓶中稀释 25 毫升 TSB，然后将细菌放回振荡培养箱中再放置 2.5 小时。当溶液在 600 纳米处达到 0.5 至 0.8 的光密度时，在新的 250 毫升培养瓶中以 1 比 10 的比例在新鲜 TSB 中稀释培养物，第二次孵育 2.5 小时，最终有效浓度为 60 μg/mL 头孢氨苄。

产生长度约为 50 至 150 微米的单细胞丝，如在光学显微镜下以 1000 倍放大倍率观察的那样。离心细菌溶液以收获细丝并倒出上清液。轻轻加入 1 毫升 0.8 摩尔蔗糖清洗细丝，注意不要打扰沉淀。

1 分钟后，弃去上清液，不要干扰沉淀，并按各自的顺序将指定的试剂添加到细丝中。在室温下放置 10 分钟后，在 1 分钟内逐渐加入 1 毫升溶液 A，同时用手轻轻旋转溶液。在室温下孵育溶液 4 分钟，然后将细丝悬浮液分成两个相等的等分试样，放在两个装有 7 毫升 4 摄氏度溶液的 15 毫升锥形管中 B.接下来，通过离心使细丝沉淀，并使用亚述移液管小心去除除 1 至 2 毫升外的所有上清液，而不会干扰沉淀。

使用 p1000 微量移液器轻轻地重新悬浮沉淀。通过光学显微镜检查样品的小等分试样是否形成原生质球。然后，原生质球可以在零下 20 摄氏度下储存长达一周，或者直到它们经过三个冻融循环。

为了制备革兰氏阳性 B.megaterium 原生质体，在 250 毫升培养瓶中以 1：1000 的比例稀释 100 毫升 3% TSB 过夜细菌培养物，在 37 摄氏度下摇动孵育 4.5 小时。当液体培养物在 600 纳米处达到 0.9 至 1.0 的光密度时，将细菌分装在两个 50 毫升锥形管中进行离心，并使用同理吸管使上清液浸渍。将沉淀重新悬浮在每管 2.5 mL 原生质体培养基中，并将悬浮液拉入单个锥形管中，以便在 125 mL烧瓶中培养。

向培养物中加入 1 毫升每毫升 5 毫克溶菌酶，在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。在光学显微镜下监测原生质体的生长并注意任何不规则性，例如细菌表现为肿胀的杆状而不是球体。孵育结束时，将悬浮液转移到 15 mL 锥形管中进行离心，然后将沉淀重新悬浮在 5 mL 原生质体培养基中。

然后，原生质体可以在零下 20 摄氏度下储存长达一周，或者直到它们经历三个冻融循环。为了观察原生质球或原生质体，将 5 微升感兴趣的悬浮液转移到 Poly L 赖氨酸涂层的载玻片上，然后转移 2 微升 fitc 标记的 100 至 200 微摩尔抗菌肽或 AMP。避光孵育 3 分钟后，向样品中加入 1 微升合适的膜模具，在黑暗中再孵育 3 分钟。

在孵育结束时，用玻璃盖玻片盖住标记的原生质球或原生质体，并用指甲油密封盖玻片。要对细胞进行成像，请打开共聚焦显微镜和适当的激光器并选择 63 倍物镜，然后使用适当的成像软件获得 8 位 512 x 512 复合 Z 堆栈图像，该图像由每个感兴趣细菌细胞的整个 0.5 微米切片组成。为了可视化荧光标记的 AMP 的定位，请在适当的成像分析程序中打开复合 Z 堆栈图像，并找到感兴趣的第一个原生质球或原生质体的最中心切片。

在膜上放置一个直径为 0.3 微米的圆形感兴趣区域，一个在细胞中心，另一个远离细胞以测量背景荧光，注意避免饱和像素。然后可以通过软件计算每个感兴趣区域的平均荧光强度。传统光学显微镜的分辨率极限使得区分荧光标记的肽信号是来自膜还是正常细菌的细胞内空间变得具有挑战性。

由于信号定位于膜，因此似乎与细胞内空间重叠。相比之下，与正常细菌相比，原生质球和原生质体的尺寸扩大，导致膜标志物和细胞内间隙之间的清晰分辨率。更容易区分肽定位。

例如，如刚才所示，通过共聚焦荧光显微镜，荧光标记肽在大肠杆菌原生质体和巨型芽孢杆菌原生质体中都可以观察到荧光标记肽在膜上的定位和跨细胞膜的易位。将感兴趣区域放置在原生质球或原生质体的膜和细胞内空间以及背景中，可以计算细胞内肽荧光强度与与 AMP 相互作用的每个原生质球或原生质体膜上肽荧光强度的比率。例如，该方法可用于可视化组蛋白衍生的微生物肽突变体与大肠杆菌原生质球和巨型芽孢杆菌原生质体的相互作用。

在该实验中，AMP 在两种细菌菌株中表现出相似的定位模式。强调它相对于野生型肽的易位减少。最终，该技术使研究人员能够在单个细胞水平上探索肽定位模式。

提供对目标肽的作用机制的见解。除了允许研究人员收集大量图像以系统表征肽机制外，较大的原生质球和原生质体的图像比较小的细菌细胞的图像更易于进行定量分析。