原位杂交法在小鼠心脏切片组织特异 miRNA 表达谱分析中的应用

这种方法通过提供检测蛋白质和微RNA分子的相对化的工具，有助于回答微RNA领域中的关键问题。该技术的主要优点是，您可以检测来自同一组织部分的蛋白质和微RNA分子。该协议从对滑动安装的组织进行补液开始。

在杂交烤箱中，在 60 摄氏度下加热滑梯 10 分钟。石蜡应该明显融化了。然后，将幻灯片孵育在装有市售清除剂的玻璃科普林罐中 10 分钟。

这样做两次。接下来，将幻灯片从洗涤转移到洗涤，以补充组织水分。一旦水合，在37摄氏度下孵育蛋白酶K工作溶液中的组织15分钟。

要去除蛋白酶K，请用1xPBS清洗幻灯片两次。现在，修复组织。首先，使用疏水笔在滑梯上制作储液罐，在准备工作周围绘制一个防水圈。

接下来，在屏障内应用 500 微升 4%PFA 溶液，并在烟罩中孵化幻灯片。要去除固定剂，请将包含 PBS 的 Coplin 罐中的幻灯片在室温下两次清洗五分钟。接下来，在0.13摩尔1-甲基米米达佐尔中清洗幻灯片10分钟。

在室温下在烟罩中进行此操作，并进行两次此洗涤。加入EDC固定药，在室温下在烟罩中孵育一小时。用 50 毫升三轮车冲洗幻灯片。

为了准备杂交，首先建造一个加湿室。将两片滤光片或纸巾装入盒子底部，用一对一的甲酰胺和1x SSC混合物将纸张弄湿。接下来，在每张幻灯片上应用 200 微升预热杂交溶液，并在 50 摄氏度下孵育加湿的幻灯片室 1 至 3 小时。

孵育后，用250微升探针溶液代替杂交溶液，用无RNase盖滑盖住幻灯片。尽量避免将气泡困在盖滑下。现在，小心地用副膜密封腔室，并在低于探头RNA熔化温度约30摄氏度的温度下孵育滑轨。

可能需要优化。除了设置正确的孵育温度外，不同的微RNA在不同级别上表达，因此可能需要对探头浓度进行优化，以获得最佳信号。混合后，执行串联洗涤。

首先，在 2x SSC 在 50 摄氏度下 5 分钟，或直到盖滑松动。然后，在室温下在 2x SSC 中进行两次洗涤，每次洗涤五分钟。然后，在室温下继续，在 0.2 x SSC 中清洗幻灯片 5 分钟，然后在 PBST 中清洗 5 分钟，最后在 1x PBS 中清洗幻灯片 5 分钟。

此时，RNA-RNA杂交是稳定的，不再需要RNA严格的条件。对于DID抗体检测，首先，润润疏水屏障，并应用500微升的阻尼溶液30分钟。在加湿室中孵育室温下的幻灯片。

接下来，去除阻断溶液，代之以500微升的DI格抗体溶液。在加湿室中将幻灯片在室温下孵育一小时。然后，使用Coplin罐子，在PBST中清洗幻灯片三次，每次洗涤五分钟。

接下来，在预染色溶液中清洗幻灯片五分钟两次。然后，将幻灯片传输到聚丙烯滑动邮件器 jar，并添加 20 毫升 AP 基板溶液。现在，在37摄氏度的温度下孵化滑梯6至24小时，不受光线影响。

首次使用 AP 基板时，遵循反应非常重要。每隔两小时，使用显微镜检查幻灯片上的颜色发展，直到确定最佳的孵育时间。要去除多余的 AP 基材，请每次洗涤用 KTBT 溶液清洗幻灯片两次，每次洗涤五分钟，然后用 PBS 清洗一次，洗涤五分钟。

要检测 cTNT 抗体，首先，阻断组织一小时。然后，应用200微升的cTNT抗体溶液，在4摄氏度的加湿室中孵育。第二天，在含有PBS的科普林罐中清洗幻灯片五分钟。

这样做三次。然后，应用250微升抗兔568抗体溶液，在加湿室中孵育幻灯片一小时。要洗掉多余的二次抗体，在PBS中使用三个五分钟的洗涤。

然后，如果需要，应用 250 微升的 DAPI 工作解决方案，并孵育幻灯片一分钟，防止光线。要去除多余的 DAPI 污渍，请使用两次五分钟 PBS 洗涤，洗涤后，安装幻灯片。MicroRNA原位杂交在小鼠心脏部分进行了优化，使用炒微RNA进行负对，以及U6 snRNA作为正对照。

在对照组和PlGF过度表达小鼠的心脏部分评估了微RNA-182的心肌细胞特异性表达。小鼠在α-MHC启动子下携带PlGF转基因，并在转基因激活后六周内出现心脏肥大，继发性增加血管生成。染色协议显示，在PlGF小鼠心脏中，microRNA-182的表达增加。

接下来，要确定哪些细胞类型表示微RNA-182，相同的部分被免疫区为cTNT。也使用了DAPI染色。在对照组和PlGF小鼠心脏部分，在CTNT阳性心肌细胞的核隔间中均发现微RNA-182。

看完这段视频后，您应该对如何进行微RNASe杂交，然后是蛋白质免疫保持有一个良好的理解。在尝试此过程时，记住在第一天的所有步骤中保持无 RNAse 条件非常重要。按照这个程序，其他方法，如西方印迹在实时PCR可以执行回答的问题，如，这种特殊的微RNA在不同组织中的相对表达水平，或这种特定的蛋白质在同一组织部分。

不要忘记，使用固定材料（如 PFA 和 ADC）可能非常危险。执行此过程时，应始终采取预防措施，包括戴手套和实验室外套，以及使用烟罩。