Name: 原位杂交法在小鼠心脏切片组织特异 miRNA 表达谱分析中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习原位杂交与免疫染色联合技术，用于小鼠心脏组织中miRNA与蛋白质的同步检测。该方法可实现同一组织切片内生物分子的精确定位，为microRNA功能研究提供可靠工具。

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我们感谢 Athanasios Papangelis 对本文手稿提出的宝贵意见。FM 由生物技术和生物科学研究中心（BBSRC；BB/M009424/1）资助。IP 由美国心脏协会科学家发展基金（17SDG33060002）资助。

本研究中的小鼠心脏组织样本的获取符合相关法律法规和机构指南，并经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>准备无RNase的ddH₂O2O，通过处理5 L的ddH₂O2用 5 mL 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）在室温（RT）下处理过夜（O/N）。经高压灭菌（121 °C）以灭活 DEPC。使用经 DEPC 处理的 ddH₂O2用于后续溶液的制备，具体如下所述。 
	警告：DEPC 是已知致癌物，仅可在通风橱中操作。</li>
	<li>通过将 5 片 PBS 片剂溶解于 1 L DEPC 处理的 ddH₂O 中，制备 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。2O. 高压灭菌（121 °C）。</li>
	<li>通过将1 mL非离子型去污剂加入1 L 1× PBS中，配制0.1%非离子型去污剂/PBS（PBST）。</li>
	<li>配制90%、70%、50%和30%的乙醇溶液，使用DEPC处理的ddH₂O2O.</li>
	<li>配制 10 mg/mL 蛋白酶 K（ProK）储存液：将蛋白酶 K 溶于经 DEPC 处理的 ddH₂O 中2O. 分装并保存于 -20 °C。通过将 100 μL ProK 储存液加入 50 mL 经 DEPC 处理的 ddH₂O 中，配制 20 μg/mL 的 ProK 工作液。2O. 使用前新鲜配制。</li>
	<li>将2 g多聚甲醛（PFA）加入50 mL 1×PBS中，配制成4% PFA溶液。65 °C加热并间歇振荡至完全溶解。分装后于-20 °C保存。 
	注意：PFA 是一种已知致癌物，仅可在通风橱中操作。</li>
	<li>将 87.8 g NaCl 加入 500 mL ddH₂O 中，配制 3 M NaCl 溶液2O. 高压灭菌（121 °C）。</li>
	<li>配制 1 M MgCl₂ 溶液2 通过将20.3 g加入100 mL ddH₂O中制备溶液2O. 高压灭菌（121 °C）。</li>
	<li>将121.1 g Tris溶解于800 mL去离子水中，配制1 M Tris pH 8.02O. 加入几滴 1 N HCl 将 pH 调至 8.0，定容至 1 L 后高压灭菌（121 °C）。通过将 2.5 mL 1 M Tris pH 8.0 加入 47.5 mL ddH₂O 中，配制 50 mM Tris pH 8.0 的工作液。2O.</li>
	<li>将 60.6 g Tris 溶解于 400 mL 去离子水中，配制 1 M Tris pH 9.52O. 加入几滴 1 N HCl 将 pH 调至 9.5，加水定容至 500 mL，随后进行高压灭菌（121 °C）。</li>
	<li>将1.6 mL 1-甲基咪唑用DEPC处理的去离子水定容至130 mL，配制0.13 M、pH 8.0的1-甲基咪唑溶液2O. 加入约 450 µL 12 N HCl 将 pH 调至 8.0。加入 16 mL 3 M NaCl，并加水定容至 160 mL。使用前新鲜配制。 
	注意：1-甲基咪唑对黏膜、眼睛和皮肤有害，仅可在通风橱中操作。</li>
	<li>将176 µL的N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于10 mL的0.13 M 1-甲基咪唑溶液中，配制成0.16 M EDC溶液。用约100 µL的12 N HCl将pH调节至8.0。现用现配。 
	警告：EDC 对黏膜、眼睛和皮肤有害，仅可在通风橱中操作。</li>
	<li>制备1% H2O2 通过将1.5 mL的30% H2O2 在50 mL的1×PBS中配制，使用前新鲜配制。</li>
	<li>通过将175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠（Na3C6H5O7) 加入 800 mL ddH₂O 中2O. 加入几滴 1 N HCl 将 pH 调至 7.0，定容至 1 L，高压灭菌（121 °C）。
	<ol>
		<li>通过将20 mL的20x SSC pH 7.0用180 mL的ddH₂O稀释，配制2x SSC pH 7.0工作液2O.</li>
		<li>通过将 2.5 mL 的 20x SSC pH 7.0 用 47.5 mL 的 ddH₂O 稀释，配制 1x SSC pH 7.0 的工作液2O.</li>
		<li>将5 mL的2x SSC pH 7.0用45 mL的ddH₂O稀释，配制0.2x SSC pH 7.0的工作液2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将0.5 mL的2x microRNA ISH缓冲液与0.5 mL的DEPC处理过的ddH₂O混合，配制1x杂交溶液2O. 使用前新鲜配制。</li>
	<li>通过将250 mg左旋咪唑加入5 mL去离子水中，配制200 mM的左旋咪唑储存液。2O. 分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>为第5步制备封闭液（10% 羊血清/1% BSA/0.2 mM Levamisole）：将1 mL 羊血清加入9 mL PBST中稀释，再加入0.1 g BSA。使用前添加10 μL Levamisole。现配现用。</li>
	<li>在9 mL PBST中加入1 mL山羊血清和0.1 g BSA，配制步骤6所需的封闭液（10%山羊血清/1% BSA）。4 °C保存，一周内使用。</li>
	<li>通过将 3.3 mL 的 3 M NaCl 和 5 mL 的 1 M MgCl₂ 稀释来配制预染溶液2，81.5 mL 去离子水中加入 10 mL 1 M Tris（pH 9.5）、100 µL Tween-20 和 100 µL 左旋咪唑2O. 使用前新鲜配制。</li>
	<li>使用硝基蓝四唑（nitroblue tetrazolium, NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indoly phosphate, BCIP）片剂，按照生产商说明书配制20 mL碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）底物溶液。加入20 μL左旋咪唑（Levamisole）。现用现配，并避光保存。</li>
	<li>通过将 4 g Tris、4.4 g NaCl 和 375 mg KCl 加入 500 mL ddH₂O 中，配制 KTBT 溶液2O. 高压灭菌（121 °C）。</li>
	<li>可选：将50 μL DAPI储备液（1 mg/mL）加入50 mL 1×PBS中，稀释制成DAPI工作液（1 μg/mL）。 
	注意：诸如 3 M NaCl、1 M MgCl 的标准溶液2，1 M Tris-HCl，无核酸酶的ddH₂O2O、1× PBS 和 20× SSC 也可直接购买。本方案中使用了 50 mL 玻璃 Coplin 染色缸或 20 mL 聚丙烯切片邮寄瓶。</li>
</ol>
2. 组织制备
注意：此处使用的小鼠心脏切片由耶鲁病理学组织服务部门制备，组织来源于甲醛固定/石蜡包埋样本，切片厚度为 5 μm，并置于带电荷的载玻片上。
<ol>
	<li>组织复水。
	<ol>
		<li>将切片置于杂交炉中，在 60 °C 下加热 10 分钟，直至石蜡明显熔化。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 商品化透明剂（见材料表）的玻璃染色缸中，每次 10 分钟，重复两次。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 100% 乙醇的玻璃染色缸中，每次 2 分钟，重复两次；随后依次放入 90% 乙醇中 2 分钟、70% 乙醇中 2 分钟（重复两次）、50% 乙醇中 2 分钟以及 30% 乙醇中 2 分钟。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 经 DEPC 处理的双蒸水（ddH2O）的玻璃染色缸中，孵育 5 分钟。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，孵育 5 分钟，室温下重复两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织去蛋白处理。
	<ol>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 浓度为 20 μg/mL 的蛋白酶 K 工作液的玻璃染色缸中，在杂交炉中 37 °C 孵育 15 分钟。 
		注意：消化不足可能导致信号弱或无信号，而过度消化则可能导致组织降解和背景染色。此步骤可能需要优化（蛋白酶 K 浓度 1–20 μg/mL，孵育时间 5–20 分钟，室温至 37 °C）。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下孵育 5 分钟，重复两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织固定。
	<ol>
		<li>使用疏水笔在每张切片的组织周围画出防水圈。</li>
		<li>在每张切片上加入 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，水平放置切片，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下孵育 5 分钟，重复两次。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 0.13 M 1-甲基咪唑的玻璃染色缸中，室温下孵育 10 分钟，重复两次。</li>
		<li>在每张切片上加入 500 µL 0.16 M EDC 溶液，置于湿盒中，室温下水平孵育 1 小时。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 50 mM Tris（pH 8.0）的玻璃染色缸中，室温下冲洗。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下冲洗，重复两次。 
		注意：PFA 和 EDC 固定步骤对于 miRNA 的交联均属必需，不可省略。31</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内源性过氧化物酶封闭。
	<ol>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 1% H2O2 的玻璃染色缸中，室温下孵育 30 分钟。</li>
		<li>将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下冲洗，重复两次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 杂交
<ol>
	<li>在杂交炉中将杂交液（每张切片500 µL）预热至50 °C，直至达到目标温度（10–15分钟）。</li>
	<li>在杂交盒底部放置两片滤纸或擦镜纸，并用50%甲酰胺/1x SSC溶液浸湿。 
	注意：甲酰胺对黏膜、眼睛和皮肤有害，仅可在通风橱中操作。</li>
	<li>在每张切片表面加入200 µL杂交液，于50 °C湿润环境中水平孵育1–3小时。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，将0.5 µL探针储备液（25 µM）与250 µL杂交液混合，配制探针工作液（终浓度为50 nM）。 
	注意：不同miRNA的表达水平存在差异，因此该步骤可能需要优化探针浓度（1–50 nM），以避免无信号或背景过高。</li>
	<li>在每张切片表面加入250 µL探针工作液，并覆盖无RNase的盖玻片，避免产生气泡。</li>
	<li>用封口膜小心密封杂交盒，于50 °C过夜孵育。 
	注意：杂交温度应设置为各探针RNA熔解温度（Tm）约低30 °C的条件，可能需要进行优化。此处针对miRNA-182采用50 °C作为杂交/洗涤温度，使用其他探针时应相应调整。</li>
</ol>
4. 严谨性洗涤
<ol>
	<li>在杂交炉中将 200 mL 的 2x SSC 预热至 50 °C，直至达到目标温度（20–40 分钟）。</li>
	<li>将载玻片放入含有 50 mL 50 °C 2x SSC 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟，或直至盖玻片松动。</li>
	<li>将载玻片放入含有 50 mL 室温 2x SSC 的玻璃染色缸中，每次洗涤 5 分钟，重复两次。</li>
	<li>将载玻片放入含有 50 mL 室温 0.2x SSC 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片放入含有 50 mL 室温 PBST 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片放入含有 50 mL 室温 1x PBS 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟。 
	注意：由于 RNA-RNA 杂交体已视为稳定，不再需要使用 RNase-free 条件。</li>
</ol>
5. DIG 抗体检测
<ol>
	<li>如有必要，使用疏水笔在每张载玻片的组织周围重新绘制防水圈。</li>
	<li>向每张载玻片的整个长度上加入 500 µL 封闭液。将载玻片水平放置于湿盒中，室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中，将 0.5 μL DIG 抗体加入 500 µL 封闭液中，配制 DIG 抗体溶液（1:1,000）。 
	注意：此步骤可能需要优化（1:500–1:2,000）。</li>
	<li>向每张载玻片的整个长度上加入 500 µL DIG 抗体溶液。将载玻片水平放置于湿盒中，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>将载玻片置于盛有 50 mL PBST 的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>将载玻片置于盛有 50 mL 预染液的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟，重复两次。</li>
	<li>将载玻片置于含有 20 mL AP 底物溶液的聚丙烯载玻片邮寄盒中，37 °C 孵育 6–24 小时，避光。 
	注意：应每隔 2 小时检查一次显色情况。此步骤可能需要优化。</li>
	<li>将载玻片置于盛有 50 mL KTBT 溶液的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟，重复两次。</li>
	<li>将载玻片置于盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟。</li>
</ol>
6. cTnT 抗体检测
<ol>
	<li>如有必要，使用疏水笔在每张载玻片的组织周围重新绘制防水圈。</li>
	<li>向每张载玻片的整个长度上加入 500 µL 封闭液。将载玻片水平置于湿盒中，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中，将 2 μL cTnT 抗体加入 200 μL 封闭液中，配制 cTnT 抗体溶液（1:100）。</li>
	<li>向每张载玻片的整个长度上加入 200 µL cTnT 抗体溶液。将载玻片水平置于湿盒中，4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>在室温下，将载玻片放入盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中洗涤 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中，将 0.5 μL anti-rabbit-568 抗体加入 250 μL 封闭液中，配制 anti-rabbit-568 抗体溶液（1:500）。</li>
	<li>向每张载玻片的整个长度上加入 250 µL anti-rabbit-568 抗体溶液。将载玻片水平置于湿盒中，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>在室温下，将载玻片放入盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中洗涤 5 分钟，重复三次。</li>
	<li>可选：向每张载玻片的整个长度上加入 250 µL DAPI 工作液，避光、室温水平孵育 1 分钟。</li>
	<li>在室温下，将载玻片放入盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中洗涤 5 分钟，重复两次。</li>
</ol>
7. 封片与成像
<ol>
	<li>用 2–3 滴封片剂和一张玻璃盖玻片封片。将载玻片置于 4 °C 避光环境中，平放过夜干燥。</li>
	<li>进行落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

miRNA转录本的检测可通过多种技术实现，这些技术在灵敏度、特异性和定量能力方面各不相同。本文中，我们展示miRNA的耦合检测方法 原位 与免疫染色相结合的杂交方法，并描述一种可在同一心脏切片上同时检测miRNA与蛋白质分子表达水平的实验方案。我们首先展示如何进行 原位 在石蜡包埋的心脏切片上进行地高辛标记的锁核酸miRNA探针杂交。接着，我们描述如何在同一组织切片上进行cTnT的免疫染色。最后，我们展示如何将获得的显色图像与荧光图像进行合并。本方案已针对经福尔马林固定（4 °C，过夜）及石蜡包埋的小鼠心脏组织，使用地高辛标记的锁核酸miRNA探针和cTnT抗体进行了优化。对于不同类型的组织、探针或抗体，可能需要进一步优化，具体如下所述。
在进行探针杂交前的所有步骤中，应严格实施无RNase污染的条件，因为RNase污染会严重损害实验结果。所有溶液均应使用经DEPC处理的ddH2O配制，所有考林瓶（Coplin jars）均需用RNase去污染溶液处理。此外，在使用不同DIG标记的LNA miRNA探针时，还应考虑以下因素：...

micro-RNAs（miRNAs）是一类短链（18–25个核苷酸）、单链、非编码RNA，可通过抑制信使RNA（mRNA）的翻译和/或促进mRNA降解，在转录后水平负向调控基因表达1。miRNAs由编码或非编码基因的内含子或外显子转录而来，在细胞核内被DROSHA切割生成前体miRNAs（pre-miRNAs），后者为长约70个核苷酸的茎环结构2。pre-miRNAs经输出至细胞质后，由DICER进一步加工为成熟miRNAs，长度为18–25个核苷酸3,4。随后，RNA诱导的沉默复合体（RISC）将这些miRNAs以单链RNA形式整合，使其能够结合靶mRNA的3'非翻译区（3'-UTR），从而抑制其表达3,5。
在过去的三十年中，自首次被发现以来，miRNA 已逐渐成为调控基因表达的主导分子&#160;基因表达的调控因子，其自身的表达水平受到严格调控6. 已有研究描述了miRNA在器官发育中的作用7,8,9,10,11,12，稳态的维持13,14，以及包含神经学的疾病背景15,16,17,18,19心血管20，自身免疫性疾病21,22，癌症23,24以及其他人员25。随着人们对miRNA表达模式相关性认识的不断加深，对miRNA转录本可靠检测方法的需求日益凸显。这些方法包括实时PCR、微阵列、Northern印迹杂交， 原位 杂交等方法，这些方法在灵敏度、特异性和定量能力上存在差异，主要原因是miRNA转录本由短且高度同源的序列组成6.
我们最近报道了miRNA-182在心肌肥厚发展中的重要作用26，心肌肥厚是一种心脏在血流动力学负荷增加时发生的结构适应性改变27,28。心肌肥厚的特征是心肌质量增加，若伴随不良适应性重构29，则会增加心力衰竭的风险，而心力衰竭占所有心血管疾病相关死亡的8.5%30。
在此，我们描述了将以下内容结合的实验方案 原位 使用地高辛标记（DIG）的锁核酸（LNA）探针进行杂交，并结合免疫染色，以在小鼠心脏肥厚模型的心脏组织切片上同时检测miRNA和蛋白质分子。

<table><tbody><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K，重组，PCR级</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td>ProK</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>ThermoFisher</td><td>S271</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>盐酸溶液，1 N</td><td>ThermoFisher</td><td>SA48</td><td>HCl</td></tr><tr><td>盐酸溶液，12 N</td><td>ThermoFisher</td><td>S25358</td><td>HCl</td></tr><tr><td>1-甲基咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>336092</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-二甲基氨基丙基)-N&amp;prime;-乙基碳二亚胺盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td>EDC</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>柠檬酸钠</td></tr><tr><td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450</td><td>乱序miRNA/U6 snRNA</td></tr><tr><td>miRCURY LNA mmu-miR-182 检测探针</td><td>QIagen</td><td>YD00615701</td><td>5'-DIG 和 3'-DIG 标记</td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>NBT/BCIP 片剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11697471001</td><td>NBT-BCIP</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>ThermoFisher</td><td>P217</td><td>KCl</td></tr><tr><td>DAPI 溶液 (1mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>12-545E</td><td>玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>塑料盖玻片</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td><td>无RNA酶塑料盖玻片</td></tr><tr><td>抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab片段</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>DIG 抗体</td></tr><tr><td>疏水屏障笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>记号笔</td></tr><tr><td>抗心肌肌钙蛋白T抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td>cTnT 抗体</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11011</td><td>抗兔-568 抗体</td></tr><tr><td>Dako 荧光封片剂</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>绵羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>ThermoFisher</td><td>UVP HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小鼠心脏切片进行组织特异性mirna表达谱分析 原位 杂交

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs（miRNAs）是单链RNA转录本，可结合信使RNA（mRNAs）并抑制其翻译或促进其降解。迄今为止，miRNAs已被证实参与大量生物学及疾病过程，凸显了建立可靠miRNA转录本检测方法的重要性。本文详细描述了一种基于地高辛标记（DIG）的锁核酸（LNA）探针检测miRNA的方法，并结合小鼠心脏组织切片的蛋白免疫染色技术。首先，我们进行了 原位 利用探针通过杂交技术鉴定对照组和心肌肥厚小鼠心脏切片中miRNA-182的表达。随后，我们在相同切片上对心肌肌钙蛋白T（cTnT）蛋白进行免疫荧光染色，以实现miRNA-182与心肌细胞的共定位。通过本方案，我们可采用基于碱性磷酸酶的比色法检测miRNA-182，同时通过荧光染色检测cTnT。该方案可用于利用地高辛标记的锁核酸（LNA）探针，在小鼠心脏组织切片中检测任意目标miRNA的表达，以及相关蛋白的表达情况。

miRNA 原位 使用随机序列miRNA和U6-snRNA分别作为阴性与阳性对照，在小鼠心脏切片上优化了杂交条件。阳性染色呈蓝色，阴性结果则表现为无显色反应。图1A-1B）。通过对照组和PlGF过表达小鼠心脏切片评估心肌细胞特异性miRNA-182的表达。在αMHC启动子驱动下携带PlGF转基因的小鼠，在转基因激活后6周内因血管生成增加而出现继发性心肌肥厚。26我们进行了 原位 杂交结果显示，与对照组相比，PlGF 小鼠心脏中 miRNA-182 的表达升高（图2A-2H），由蓝色染色指示。为了确定表达miRNA-182的细胞类型，我们随后对相同切片进行cTnT免疫染色。结果显示，在对照组和PlGF小鼠心脏切片中，miRNA-182均与cTnT阳性心肌细胞以及DAPI染色的细胞核共定位。<strong c...

micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位 小鼠心脏组织切片中miRNA与蛋白质分子的杂交及免疫染色共检测

利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交

micro-RNAs（miRNAs）是单链RNA转录本，可与信使RNA（mRNAs）结合，抑制其翻译或促进其降解。为了……

该方法可通过提供检测蛋白质和微小RNA（microRNA）分子相对定位的工具，帮助解答微小RNA研究领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够从同一组织切片中同时检测蛋白质和微小RNA分子。本实验方案首先对载玻片上的组织进行复水处理。将载玻片置于杂交炉中，在 60 摄氏度下预热 10 分钟，此时石蜡应明显熔化。随后，将载玻片放入盛有市售透明剂的玻璃染色缸中，孵育 10 分钟。重复此步骤两次。接着，将切片从一个洗涤液转移至另一个洗涤液，以重新水化组织。水化完成后，在37°C下用蛋白酶K工作液孵育组织15分钟。为了去除蛋白酶K，用1× PBS将载玻片洗涤两次。现在固定组织。首先，使用疏水笔在样本周围绘制一个防水圈，以在载玻片上形成储液区。接下来，在屏障内加入500微升4%PFA溶液，并将载玻片置于通风橱中孵育。为去除固定剂，将载玻片在盛有PBS的考普林瓶中室温下洗涤两次，每次5分钟。随后，将载玻片在0.13摩尔的1-甲基咪唑溶液中洗涤10分钟。在室温下的通风橱中进行此操作，并重复洗涤两次。加入EDC固定剂，在通风橱中室温孵育一小时。用50毫摩尔的Tris冲洗载玻片。为进行杂交实验做准备，首先构建一个加湿孵育盒。在盒子底部放入两张滤纸或擦镜纸，并用体积比为1:1的甲酰胺与1x SSC溶液浸湿。随后，向每张载玻片上加入200微升预热的杂交溶液，将载玻片放入加湿孵育盒中，在50摄氏度条件下孵育1至3小时。孵育结束后，将杂交液替换为250微升探针溶液，并用无RNase的盖玻片覆盖载玻片。注意避免在盖玻片下残留气泡。随后，用封口膜小心密封杂交 chamber，并在比探针RNA熔解温度低约30摄氏度的条件下过夜孵育载玻片。可能需要进行优化。除了设定合适的孵育温度外，不同的微小RNA表达水平不同，因此可能还需要针对探针浓度进行优化，以获得最佳信号。杂交完成后，进行严谨性洗涤。首先，在 50 摄氏度的 2x SSC 中孵育五分钟，或直至盖玻片松动。然后，在室温下用 2x SSC 洗涤两次，每次五分钟。接着，在室温下继续操作，用 0.2x SSC 洗涤载玻片五分钟，随后在 PBST 中洗涤五分钟，最后在 1x PBS 中洗涤五分钟。此时，RNA-RNA 杂交体已稳定，不再需要严格的 RNA 操作条件。进行 DIG 抗体检测时，首先修整疏水屏障，加入 500 微升封闭液，孵育 30 分钟。将切片置于湿盒中，室温下孵育。接下来，移除封闭液，并加入500微升DIG抗体溶液。将切片置于湿盒中，室温孵育1小时。然后，使用考普林瓶在PBST中洗涤切片三次，每次5分钟。接下来，用预染液将载玻片洗涤两次，每次五分钟。然后，将载玻片转移至聚丙烯载玻片邮寄罐中，并加入 20 毫升碱性磷酸酶底物溶液。现在，在 37 °C 条件下避光孵育 6 至 24 小时。首次使用AP底物时，需密切观察反应过程。每隔两小时，用显微镜检查切片上的显色情况，直至确定最佳孵育时间。为去除多余的AP底物，将切片在KTBT溶液中洗涤两次，每次五分钟，随后在PBS中洗涤一次，每次五分钟。为了检测cTNT抗体，首先将组织在室温下封闭1小时。然后，加入200微升cTNT抗体溶液，将切片置于湿盒中，在4摄氏度下孵育过夜。次日，将切片放入盛有PBS的考普林瓶中洗涤5分钟。重复此步骤三次。然后，加入250 µL的568标记的山羊抗兔抗体溶液，在湿盒中室温孵育1小时。为洗去未结合的二抗，用PBS洗涤三次，每次5分钟。然后，根据需要，加入250 µL DAPI工作液，避光孵育1分钟。为去除多余的DAPI染料，使用两次五分钟的PBS洗涤，洗涤后封片。微小RNA原位杂交实验在小鼠心脏切片上进行优化，以随机序列微小RNA作为阴性对照，U6 snRNA作为阳性对照。通过对照组和PlGF过表达小鼠的心脏切片，评估了心肌细胞特异性microRNA-182的表达情况。这些小鼠在α-MHC启动子驱动下携带PlGF转基因，在转基因激活后六周内因血管生成增加而出现心脏肥厚。染色结果显示，PlGF小鼠心脏中microRNA-182的表达水平升高。接下来，为了确定哪些细胞类型表达 microRNA-182，对相同切片进行 cTNT 免疫染色，并同时使用 DAPI 染色。在对照组和 PlGF 小鼠心脏切片中，microRNA-182 均存在于 cTNT 阳性心肌细胞的细胞核区室中。观看本视频后，您应能充分理解如何进行 microRNA 原位杂交，随后进行蛋白质免疫染色。在尝试该实验流程时，必须牢记在第一天进行原位杂交前的所有操作步骤中，始终保持无 RNA 酶的环境。在完成本流程后，还可进一步采用其他方法，如 Western 印迹或实时 PCR，以回答诸如：该特定 microRNA 在不同组织中的相对表达水平如何，或在同一组织切片中该特定蛋白质的相对表达水平如何等问题。请注意，使用PFA和ADC等固定剂可能具有极高危险性。进行此操作时，必须采取预防措施，包括佩戴手套和实验服，并使用通风橱。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

原位杂交法在小鼠心脏切片组织特异 miRNA 表达谱分析中的应用

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高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

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由于可获取的组织量有限，对早期胚胎小鼠瓣膜中蛋白质表达的分析一直受到阻碍。本论文提供了一种从发育中的胚胎小鼠瓣膜区域提取蛋白质以进行蛋白质印迹分析的实验方案。...

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为了分析斑马鱼心脏发育过程中的心脏基因表达谱，必须从分离的心脏中提取总RNA。本文介绍了一种通过快速手工解剖斑马鱼胚胎以获取功能性/跳动心脏的方案，从而获得心脏特异性的mRNA。...

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