利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交
2018年9月15日
micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位 小鼠心脏组织切片中miRNA与蛋白质分子的同步检测：杂交与免疫染色法
该方法可通过提供检测蛋白质和微小RNA（microRNA）分子相对定位的工具，帮助解答微小RNA研究领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够从同一组织切片中同时检测蛋白质和微小RNA分子。本方案首先对载玻片上的组织进行复水处理。
将载玻片置于杂交炉中，在 60 摄氏度下预热 10 分钟，此时石蜡应明显熔化。随后，将载玻片放入盛有市售透明剂的玻璃染色缸中孵育 10 分钟。
重复此步骤两次。接着，将切片从一个洗涤液转移至另一个洗涤液，以重新水化组织。水化完成后，在37°C下用蛋白酶K工作液孵育组织15分钟。
为了去除蛋白酶K，用1×PBS将载玻片洗涤两次。现在固定组织。首先，使用疏水笔在样本周围画一个防水圈，以在载玻片上形成储液区。
接下来，在屏障内加入500微升4%PFA溶液，并将载玻片置于通风橱中孵育。为去除固定剂，将载玻片在含有PBS的考普林瓶中室温下洗涤两次，每次5分钟。随后，将载玻片在0.13摩尔的1-甲基咪唑溶液中洗涤10分钟。
在室温下的通风橱中进行此操作，并重复洗涤两次。加入EDC固定剂，在通风橱中室温孵育一小时。用50毫摩尔的Tris冲洗载玻片。
为进行杂交实验做准备，首先构建一个加湿孵育盒。在盒子底部放入两张滤纸或擦镜纸，并用体积比为1:1的甲酰胺与1x SSC溶液浸湿。随后，向每张载玻片上加入200微升预热的杂交溶液，将载玻片放入加湿孵育盒中，在50摄氏度条件下孵育1至3小时。
孵育结束后，将杂交液替换为250微升探针溶液，并用无RNase的盖玻片覆盖载玻片。注意避免在盖玻片下残留气泡。随后，用封口膜小心密封杂交 chamber，并在比探针RNA熔解温度低约30摄氏度的条件下过夜孵育载玻片。
可能需要进行优化。除了设定合适的孵育温度外，不同的微小RNA表达水平不同，因此可能还需要针对探针浓度进行优化，以获得最佳信号。杂交完成后，进行严谨性洗涤。
首先，在50摄氏度的2x SSC中孵育5分钟，或直至盖玻片松动。然后，在室温下用2x SSC洗涤两次，每次5分钟。接着，在室温下继续操作，用0.2x SSC洗涤载玻片5分钟，随后在PBST中洗涤5分钟，最后在1x PBS中洗涤5分钟。
此时，RNA-RNA 杂交体已稳定，不再需要严格的 RNA 条件。进行 DIG 抗体检测时，首先修整疏水屏障，加入 500 微升封闭液，孵育 30 分钟。将切片置于湿盒中，室温下孵育。
接下来，移除封闭液，并加入500微升DIG抗体溶液。将载玻片置于湿盒中，室温孵育1小时。然后，使用考普林瓶在PBST中洗涤载玻片三次，每次5分钟。
接着，用预染色溶液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤两次。然后，将载玻片转移至聚丙烯载玻片邮寄罐中，并加入20毫升碱性磷酸酶底物溶液。现在，将载玻片在37°C孵育6至24小时，避光保存。
首次使用碱性磷酸酶底物（AP substrate）时，需密切观察反应过程。应每隔两小时在显微镜下检查切片的显色情况，直至确定最佳孵育时间。为去除多余的AP底物，先将切片在KTBT溶液中洗涤两次，每次五分钟，随后在PBS中洗涤一次，每次五分钟。
为了检测cTNT抗体，首先将组织在室温下封闭1小时。然后，加入200微升cTNT抗体溶液，将切片置于湿盒中，在4摄氏度下孵育过夜。次日，将切片放入盛有PBS的考普林瓶中洗涤5分钟。
重复此步骤三次。然后，加入250 µL的抗兔568抗体溶液，在湿盒中室温孵育1小时。为洗去未结合的二抗，用PBS洗涤三次，每次5分钟。
然后，根据需要，加入250 µL DAPI工作液，避光孵育1分钟。为去除多余的DAPI染料，使用两次五分钟的PBS洗涤，洗涤后封片。微小RNA原位杂交实验在小鼠心脏切片上进行优化，以错配微小RNA作为阴性对照，U6 snRNA作为阳性对照。
通过对照组和PlGF过表达小鼠的心脏切片，评估了心肌细胞特异性microRNA-182的表达情况。这些小鼠在α-MHC启动子驱动下携带PlGF转基因，在转基因激活后六周内因血管生成增加而出现心脏肥厚。染色结果显示，PlGF小鼠心脏中microRNA-182的表达水平升高。
接下来，为了确定哪些细胞类型表达 microRNA-182，对相同切片进行 cTNT 免疫染色，并同时使用 DAPI 染色。在对照组和 PlGF 小鼠心脏切片中，microRNA-182 均存在于 cTNT 阳性心肌细胞的细胞核区室中。
观看本视频后，您应能充分理解如何进行微小RNA原位杂交，随后进行蛋白质免疫染色。在操作该实验流程时，必须特别注意在第一天的所有步骤中，直至原位杂交前，始终保持无RNA酶的环境。完成本实验流程后，还可进一步采用其他方法，如蛋白质印迹（Western blot）或实时PCR，以回答诸如：该特定微小RNA在不同组织中的相对表达水平如何，或该特定蛋白质在同一组织切片中的表达情况如何等问题。
请注意，使用PFA和ADC等固定剂可能具有极高危险性。进行此操作时，必须采取预防措施，包括佩戴手套和实验服，并使用通风橱。
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概述
本文介绍了一种在小鼠心脏组织切片中同时检测微小RNA（miRNA）和蛋白质分子的实验方案。该方法结合了原位杂交与免疫染色技术，增强了对这些生物分子定位研究的能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 基因组学
背景
- 微小RNA（micro-RNAs）是关键的转录后调控因子。
- 现有的检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。
- 了解miRNA的定位有助于揭示其功能。
- 本研究聚焦于一种新型检测技术。
研究目的
- 建立一种同时检测miRNA和蛋白质的方法。
- 加深对miRNA在组织中定位的理解。
- 为该领域的研究人员提供可靠的实验方案。
使用的方法
- 载玻片上组织的复水。
- 在杂交炉中加热载玻片。
- 在透明剂中孵育。
- 原位杂交与免疫染色结合。
主要结果
- 在同一组织切片中成功检测到 microRNA 和蛋白质。
- 增强了生物分子定位的可视化效果。
- 验证了该联合方法的有效性。
- 为 microRNA 领域的研究提供了一种新工具。
结论
- 该方案在miRNA研究领域具有重要意义。
- 它能够实现对生物分子相互作用的全面分析。
- 该方法可促进对miRNA功能的进一步研究。
常见问题
行业高管相关性
在组织切片中对miRNA与蛋白质标志物进行可靠检测及空间定位，对于早期心血管药物研发中的机制去风险化和靶点验证至关重要。该双重检测方案可实现miRNA表达在特定细胞类型中的精确定位，有助于提高疾病相关模型的预测可信度。整合miRNA与蛋白质的共定位数据，可为心脏治疗项目的候选药物筛选及转化研究的连续性提供支持。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与疾病相关的 cardiac 组织中探究 miRNA 的功能与定位。
- 通过将 miRNA 表达与特定细胞群体关联，支持生物学风险降低。
- 通过与蛋白标志物的共定位，促进功能靶点的验证。
- 提高推进 miRNA 调控策略的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的基于组织的miRNA和蛋白质检测方法。
- 提供可重复的定量结果，用于不同条件间的比较分析。
- 支持miRNA靶向化合物下游筛选的检测标准化。
- 实现对化合物在miRNA和蛋白质表达水平上作用效果的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将miRNA表达模式与临床前心脏模型中的疾病表型进行关联。
- 通过实现生物标志物的共定位，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 基于组织特异性的分子读数，促进经风险调整的转化推进决策。
- 提供关于miRNA驱动的心脏病理机制的深入见解。
流程与工作流整合
本方案通过实现组织切片中miRNA和蛋白质的空间分辨分析，融入从发现到临床前研究的连续过程，既支持假设验证，也支持转化生物标志物的开发。
- 发现生物学：通过将miRNA表达谱映射到疾病模型中的心肌细胞群体，支持假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的基于组织的读数，用于检测方法开发和化合物评估。
- 分析：提供共定位数据和定量测量结果，以进行可靠的统计学比较。
- 转化研究：通过将分子标志物与疾病表型相匹配，连接发现研究与临床前验证。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，用于在多种心脏研究项目中检测miRNA和蛋白质。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化基于组织的检测工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持科学的“推进/终止”决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持基于风险调整的miRNA靶向资产优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备组织处理、原位杂交和免疫染色技术方面的专业知识。
- 需要具备显微镜、成像及定量分析基础设施的使用权限。
- 必须维持严格的无RNA酶环境，并实现跨团队实验方案的标准化。
- 针对不同组织类型或miRNA靶标可能需要进行方法调整。
- 探针浓度和孵育参数的优化对于确保信号特异性至关重要。
