化学重编程常规人类多能干细胞至类似原始态并增强多向分化潜能

LIF-3i 方法可将传统的人多能干细胞逆转为更原始的多能状态，使其具有人类着床前上胚层细胞的生化、转录和表观遗传特征。该方法通过降低谱系启动基因的表达，并消除不同人多能干细胞系间定向分化过程中常见的谱系间差异，从而提升传统人多能干细胞的功能性。采用此方法，经化学逆转的人多能干细胞在长期传代后仍能维持核型和表观基因组的稳定性，包括在印记基因位点，并且无需重新启动步骤即可直接进行高效分化。

LIF-3i 方法将为早期人类发育生物学的研究开辟新的途径，并可能通过改善人类多能干细胞的分化、基因靶向以及种间嵌合体的生成，推动再生医学的发展。开始本实验方案时，应在饲养层细胞共培养体系（基于小鼠胚胎成纤维细胞，即 MEF 饲养层体系）或无饲养层培养体系中，维持和扩增具有经验证正常核型的传统人类多能干细胞（hPSCs）。在传代经 LIF-5i 适应的传统 hPSC 培养物前一天，需在预先制备的明胶包被六孔板中准备好 MEF 饲养层细胞。

当传统 hPSC 培养物达到约 50% 汇合度时，将标准 hESC 培养基更换为每孔 2 毫升的白血病抑制因子 5i（Leukemia Inhibitory Factor 5i）或 LIF-5i 培养基。在 CO₂ 培养箱中，使用 LIF-5i 培养并维持传统 hPSC 和 MEF 最多两天。每日更换 LIF-5i 培养基，以使其适应后续传代及在 LIF-3i 中的稳定逆转。

对于无饲养层的传统培养，在传代的次日早晨前，仅需在LIF-5i培养基中将hPSC培养过夜。传代前，先用PBS洗涤经LIF-5i适应的传统hPSC一次，然后向每孔加入1毫升细胞解离试剂。接着，将培养板置于37°C的CO2培养箱中孵育5分钟。

孵育后，用移液器将细胞轻柔吹打成单细胞悬液。将细胞悬液收集至无菌15毫升锥形管中，用hESC培养基至少稀释两倍，并通过移液轻柔吹打细胞，以获得单细胞悬液。在300 g离心5分钟。

离心后，吸除并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于一至二毫升 LIF-5i 培养基中。随后进行细胞计数。用每孔两毫升的 PBS 将预先包被的六孔 MEF 培养板洗涤两次。

将一至两乘以十的六次方个细胞加入两毫升LIF-5i培养基中，接种至经PBS洗涤的MEF培养板的一个孔内。将培养板放入CO₂培养箱中。次日，轻轻摇晃培养板以悬浮所有未贴壁细胞，吸除培养基，并更换为两毫升LIF-5i培养基。

每天重复此步骤，持续三至五天，或直至细胞融合度达到60%至70%。只要仔细排除已明显分化或核型异常的人多能干细胞样品，本方案可支持多种人胚胎干细胞及诱导性多能干细胞系快速、大规模地逆转为类 naive 状态。在完成初始的 LIF-5i 适应后，后续稳定的 LIF-3i 培养物应在生物安全柜中每三至四天传代一次，或在培养物融合度达到60%至70%时进行传代。

弃去培养基，每孔加入两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤LIF-5i-LIF-3i培养物。弃去PBS，每孔加入一毫升细胞解离液。将细胞置于37摄氏度的CO2培养箱中孵育五分钟。

孵育后，收集细胞悬液，加入两倍体积未处理的hESC培养基，通过移液轻轻吹打细胞以获得单细胞悬液。将悬液转移至无菌的15毫升锥形离心管中。在300 ×g下离心5分钟，吸除并弃去上清液。

用LIF-3i培养基重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数。随后，将每孔2 × 10⁵个细胞接种至已接种在明胶包被的六孔板中的辐照MEF上，用于LIF-3i培养物的常规传代。对于初始的LIF-5i适应性培养物，在首次传代至LIF-3i MEF前，应先以较高的初始密度接种。

如有需要，应针对单个人类多能干细胞系优化并调整其较高的初始接种密度，以在LIF-3i重编程培养的早期传代过程中维持连续的大规模传代。将适应LIF-5i的hPSCs重新接种并分配至新鲜的、经PBS洗涤并经照射处理的MEF饲养层平板中，使用LIF-3i培养基进行培养。每日更换LIF-3i培养基。

在将N-hPSC用于功能研究或冻存之前，需在LIF-3i培养基中连续传代至少4至7次。记录N-hPSC在常规培养基或LIF-3i培养基中的传代次数。通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测STAT3和Erk1/2的活化磷酸化形式及总蛋白异构体的表达，这些是分子多能性的关键标志物。

畸胎瘤微切片的苏木精和伊红染色显示，三个胚层均表现出强烈的分化能力，具有结构良好的外胚层、中胚层和内胚层谱系。观看本视频后，您应能充分理解如何利用连续的通用LIF-5i至LIF-3i化学方法，高效地将传统人多能干细胞大规模逆转至类似原始态的多能状态。在实施本方案前，重要的是应从低传代次数、核型正常的人多能干细胞系开始培养。

传统的人多能干细胞培养物在开始实验前应基本保持未分化状态，并仅含有少量自发分化的细胞。初始阶段短暂的LIF-5i适应步骤可显著增强传统人多能干细胞的克隆扩增能力，并使其后续能够仅通过LIF-3i在大量细胞中实现原始态逆转，从而避免了后期需挑选或亚克隆稀有的原始态人多能干细胞集落的繁琐步骤。进一步优化这种利用tankyrase抑制剂的化学方法，在明确的无饲养层、符合GMP标准的培养条件下，将有助于高效地生成多种功能完整且可移植的细胞类型，用于临床治疗。