Name: 体内结肠细胞 Photolabeling 对新生小鼠造血细胞迁移潜能的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 了解光标记技术用于评估新生小鼠结肠细胞迁移潜能的方法。该技术可追踪免疫细胞从结肠迁移至肠外部位，有助于研究早期生命阶段的宿主-微生物群相互作用。

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Nitya Jain 获得了美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所职业转型奖 1K22AI116661-01 的资助。

所有动物实验均经麻省总医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其规定执行。
警告：本实验方案涉及使用3b类激光器（LG3）。操作该激光器时必须始终佩戴LG3激光防护眼镜。必须遵循相应的培训和安全准则，以避免受伤风险。
1. 激光器的设计与组装
<ol>
	<li>将发光二极管（LED）（405 nm，19.3 mW，1400 mA，光纤耦合）连接至LED驱动器 通过 连接LED附带的4针M8连接器电缆。小心拧紧螺丝以固定连接。</li>
	<li>在将光遗传学补丁电缆连接到LED之前，将LED的连接器开口朝向光源，检查是否有可见的阻塞物。如有必要，向开口吹气以清除任何阻塞物，然后将光遗传学补丁电缆插入开口中。</li>
	<li>将光纤套管插入连接套管的任一端，将其与光遗传学连接线相连。将连接套管的另一端连接至连接线。&#160; 施加足够的压力以确保连接牢固，但需小心避免弯曲或折断导管中的光纤。 
	注意：激光未使用时，应使用保护帽覆盖脆弱的光纤套管。</li>
	<li>将LED驱动器设置为连续波（CW）模式，连续调节旋钮调至0，电流限制设为1.2 A。</li>
</ol>
2. 结肠细胞的光转化
注意：在出生后1至2天，将雄性和雌性小鼠暴露于结肠内405 nm光照下，并在1周龄前处死。
<ol>
	<li>选择一个有电源插座的黑暗环境。将LED驱动器插入电源插座。 
	注意：该操作应在尽可能少的白光条件下进行，因为长时间暴露于环境光下可能导致细胞发生非预期的光转化。可使用红光作为替代光源。 
	警告：&#160;以下步骤涉及使用动物麻醉剂。麻醉剂的给药应在II级生物安全柜中或使用其他适当的废气清除系统中进行。吸入麻醉剂可能导致头晕、嗜睡，甚至意识丧失。</li>
	<li>在诱导箱中通过吸入4 - 5%异氟烷（溶于100% O₂）对小鼠进行麻醉。通过用力夹捏后肢足垫（无反应）确认麻醉深度。通过鼻罩维持约2%异氟烷的麻醉状态。使用适当的通风柜或麻醉废气清除装置，防止操作人员接触异氟烷。</li>
	<li>用一只手的拇指和食指轻轻抓握小鼠背部皮肤以固定麻醉后的小鼠，进行直肠内照射操作。将小鼠翻转以暴露腹部。若小鼠皮肤开始失去粉红色或呼吸频率减慢，应适当放松抓握力度。将小鼠尾巴固定于无名指和小指之间。</li>
	<li>用另一只手取下套管的保护帽。在保持套管长轴与小鼠身体中线平行的同时，轻柔地将光纤套管经肛门插入结肠，使光纤的全部5 mm均进入小鼠体内。 
	注意：该操作应缓慢且小心进行，避免穿破结肠壁。轻微地来回移动和旋转套管有助于其顺利进入结肠。</li>
	<li>佩戴激光防护眼镜，并将激光器电流调至最大值（顺时针旋转到底）。通过观察小鼠半透明的腹部确认紫外光的存在。 
	注意：LG3型激光防护眼镜会显著降低可见度。应由一名佩戴适当防护装备的同事协助佩戴眼镜并开启激光器。</li>
	<li>用激光照射结肠共2分钟。每30秒将套管缓慢撤回约1 mm，以最大化光照覆盖的管腔面积。2分钟后，关闭激光器。</li>
	<li>缓慢将套管从小鼠体内取出。待小鼠在温暖的空笼中恢复意识后，将其放回原饲养笼。&#160;</li>
</ol>
3. 肠道淋巴细胞的分离
<ol>
	<li>配制1 L Hank平衡盐溶液/小牛血清（HBSS/CS）缓冲液、200 mL上皮组织剥离缓冲液、500 mL洗涤培养基以及200 mL不含乙二胺四乙酸（EDTA）的洗涤培养基。 
	注意：试剂体积是针对9个样本量计算的。
	<ol>
		<li>将50 mL CS加入950 mL HBSS中，配制HBSS/CS缓冲液（HBSS；5% CS）。置于冰上保存。</li>
		<li>配制上皮细胞剥离缓冲液 [HBSS；5% CS；1 mM 二硫苏糖醇（DTT）；5 mM EDTA；15 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（pH 7.2 - 7.5）]：向185 mL HBSS中加入10 mL CS、200 µL 1 M DTT、2 mL 0.5 M EDTA和3 mL 1 M HEPES缓冲液。将上皮细胞剥离缓冲液置于37 °C水浴中。</li>
		<li>将5 mL CS和1 mL 0.5 M EDTA加入494 mL HBSS中，配制洗涤液（HBSS；1% CS；1 mM EDTA）。室温保存。</li>
		<li>将2 mL CS和3 mL 1 M HEPES加入195 mL HBSS中，配制无EDTA洗涤液（HBSS；1% CS；15 mM HEPES）。室温保存。</li>
		<li>配制FACS缓冲液：将10 mL CS加入490 mL PBS（1×磷酸盐缓冲液，pH = 7.2）中，得到含2% CS的PBS缓冲液。置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在60 × 10 mm培养皿中放置一个70 µm细胞筛网，用于组织收集。向培养皿中加入10 mL HBSS/CS缓冲液（HBSS；5% CS缓冲液，按步骤3.1.1配制并置于冰上保存），并将培养皿放在冰上。</li>
	<li>处死小鼠 通过 使用适当的麻醉气体回收装置，通过吸入过量异氟烷（暴露时间约3分钟） &#62;4% 异氟烷置于室内空气或 100% O₂ 中2）。在呼吸和反射性运动明显停止后，通过用力捏住后肢足垫以确认深部疼痛反应消失（建议使用镊子）。确保安乐死 通过 使用手术剪或新的剃须刀进行断头。 
	注意：由于动物的体型和年龄，不建议在此步骤中使用颈椎脱位法。这些方法符合2013年美国兽医协会（AVMA）安乐死指南，并已获得麻省总医院动物护理与使用委员会（MGH IACUC）批准。</li>
	<li>使用洁净的镊子和剪刀打开腹腔以获取结肠。将小肠推向小鼠腹腔的一侧，暴露结肠。首先在盲肠远端（朝向肛门方向）横断结肠，以切除整个结肠。然后，用镊子牢固夹住结肠，用剪刀从尿道剪至直肠，并尽可能靠近肛门处切断结肠。在取出结肠后，采集脾脏（见下文步骤4.1–4.2）。 
	注意：尽管光转换方案仅针对新生儿结肠的约25%区域（光纤套管5 mm范围），但仍需采集整个结肠以辅助细胞分离。</li>
	<li>使用镊子将结肠内容物推出并置于干燥的纸巾上以清洁结肠。用刀片在培养皿盖上将结肠组织精细切碎成糊状，随后将该糊状物转移至置于培养皿中的细胞筛中进行匀浆。</li>
	<li>向滤器中加入一支洁净的8 mm长磁力搅拌子，将培养皿置于9孔磁力搅拌器上。将磁力搅拌子的转速设为800 rpm，在室温下孵育细胞5分钟。弃去缓冲液，用10 mL HBSS/CS（步骤3.1.1中配制并冰上保存的含5% CS的HBSS缓冲液）重复洗涤一次。洗涤结束后弃去缓冲液。</li>
	<li>加入10 mL预热的上皮细胞分离缓冲液（HBSS；5% CS；1 mM DTT；5 mM EDTA；15 mM HEPES [pH 7.2 - 7.5]，该缓冲液于步骤3.1.2中配制并置于37 °C水浴中保存）至细胞筛中，于37 °C培养箱中以800 rpm搅拌30分钟，以解离上皮细胞。孵育结束后，将富含上皮细胞组分的缓冲液转移至一支洁净的15 mL离心管中。 
	注意：上皮层及关联细胞（肠上皮细胞和肠上皮内淋巴细胞）会释放到缓冲液中，而完整组织中的细胞则保留在组织内 固有层 此步骤中保留在细胞筛上11.
	<ol>
		<li>将富集的肠上皮细胞组分（IELs）在室温下以700 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中，置于冰上保存，用于步骤3.15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤 固有层 用 HBSS/CS 缓冲液将细胞滤筛中的样品洗涤 2 次。具体操作如下：向细胞滤筛中加入 10 mL HBSS/CS 溶液（HBSS；含 5% CS 的缓冲液，于步骤 3.1.1 中配制并置于冰上保存），在 37 °C 培养箱中以 800 rpm 搅拌 5 分钟。每次洗涤后弃去上清液。</li>
	<li>用洗涤液清洗样本2次。向细胞筛中加入10 mL洗涤液（HBSS；1% CS；1 mM EDTA缓冲液，按步骤3.1.3配制并室温保存），在37 °C培养箱中以800 rpm搅拌15分钟。每次洗涤后弃去上清液。
	<ol>
		<li>使用洗涤培养基后，将其置于冰上，用于步骤3.14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用HBSS/CS缓冲液清洗样本2次。向细胞滤筛中加入10 mL HBSS/CS缓冲液（HBSS；5% CS缓冲液，步骤3.1.1中配制并置于冰上保存），在37 °C培养箱中以800 rpm搅拌5分钟。每次清洗后弃去缓冲液。</li>
	<li>将组织置于无EDTA洗涤缓冲液中孵育。向细胞滤筛中加入10 mL无EDTA洗涤缓冲液（HBSS；1% CS；15 mM HEPES缓冲液，按步骤3.1.4配制并室温保存），于室温孵育培养板10分钟，不搅拌。此步骤结束后弃去缓冲液。</li>
	<li>用HBSS/CS缓冲液洗涤样本2次，并准备酶溶液。向细胞滤筛中加入10 mL HBSS/CS缓冲液（HBSS；第3.1.1步配制并置于冰上保存的含5% CS的缓冲液），在37 °C培养箱中以800 rpm搅拌10分钟。每次洗涤后弃去缓冲液。
	<ol>
		<li>在第二次洗涤期间配制酶溶液（无EDTA洗涤缓冲液；0.1 mg/mL DNase I；167 mg/mL胶原酶）：将9 mg DNase I和15 mg冻干胶原酶加入90 mL无EDTA洗涤缓冲液中。室温保存该溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化 固有层 细胞滤筛中所含的组分以获得 固有层 淋巴细胞（LPLs）。向细胞筛中加入10 mL酶解液（无EDTA洗涤缓冲液；0.1 mg/mL DNase I；在步骤3.12.1中配制并室温保存的167 mg/mL胶原酶缓冲液），在37 °C培养箱中以800 rpm搅拌45分钟。 
	注意：LPLs 在酶消化后释放到溶液中。
	<ol>
		<li>收集含有细胞的酶溶液，通过新的细胞滤网过滤至50 mL锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入20 mL预冷的洗涤液（HBSS；1% CS；1 mM EDTA缓冲液，按步骤3.1.3配制并于步骤3.9.1中冰上保存）至滤过的细胞中，以终止酶溶液中的胶原酶活性。在室温下以700 × g离心6分钟。弃去上清液，将含有LPLs的沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中。</li>
	<li>将步骤 3.7.1 中的 IEL 与步骤 3.14 中的 LPL 组分混合，并用荧光标记抗体进行染色，用于流式细胞术分析（见步骤 5）。 
	注意：如果需要获取区室信息，可分别对 IEL 和 LPL 组分进行染色。</li>
</ol>
4. 从脾脏中分离淋巴细胞
<ol>
	<li>在微量离心管中加入 500 µL FACS 缓冲液，制备收集管。将收集管置于冰上保存。</li>
	<li>取出结肠（步骤 3.4）后，完整收获脾脏并放入收集管中。将组织置于冰上保存。</li>
	<li>使用电动组织匀浆器，在微量离心管中将脾脏匀浆约 1 分钟。&#160;在室温下以 300 × g [微量离心机] 离心 5 分钟，并吸除上清液。</li>
	<li>通过将样品重悬于 500 µL 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，进行红细胞裂解，以渗透裂解方式诱导细胞死亡。在室温下孵育 1 - 2 分钟后，再将样品重悬于 725 µL FACS 缓冲液中。</li>
	<li>在室温下以 300 × g [微量离心机] 离心 5 分钟，并吸除上清液。将沉淀物重悬于 500 µL FACS 缓冲液中，通过 40 µm 细胞滤网过滤至新的微量离心管中。&#160;将全部样品转移至新的微量离心管，并加入荧光标记抗体进行流式细胞术分析（见步骤 5）。</li>
</ol>
5. 使用流式细胞术鉴定 Dendra-r+ 细胞
<ol>
	<li>将IEL/LPL和脾脏样品在室温下以300 × g [微量离心机] 离心5分钟，并吸除上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于100 µL抗体染色混合液中。每份样品在100 µL FACS缓冲液中加入1 µL荧光标记的抗-CD45抗体，配制抗体染色混合液。 
	注意：实验前必须对用于流式细胞术的抗体进行滴定，以确定发生结合饱和的最佳浓度。</li>
	<li>将样品在冰上（避光条件下）孵育35分钟。</li>
	<li>将样品重悬于300 µL FACS缓冲液中，在室温下以300 × g [微量离心机] 离心5分钟。吸除上清液后，将样品重悬于325 µL FACS缓冲液中，随后在流式细胞仪上进行分析。</li>
</ol>

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<li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li>
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<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴定和表征与结肠微生物群相互作用并受其影响的细胞具有重要意义，有助于阐明黏膜微环境中的信息如何传递至机体其他部位。研究肠道相关细胞迁移的一种方法是分离肠道相关细胞，随后将其过继转移至受体小鼠，以确定这些细胞的组织趋向性分布模式及其功能。12,13这种方法存在局限性，因为仅能追踪被转移的特定细胞类型。此外，从组织中分离细胞及纯化过程可能产生的假象会阻碍 体内 迁移过程。最近，有研究报道了一种利用Kaede小鼠通过内窥镜光转换技术标记肠细胞的方案14该研究发现，在成年小鼠中存在白细胞向肠道及自肠道的广泛迁移。
本报告描述了一种标记新生小鼠结肠细胞并追踪其迁移至肠外部位（如脾脏）的方法。PhAMexcised 小鼠在全身广泛表达一种可光转换的绿色荧光蛋白 Dendra2，该蛋白在紫外光照射下可被不可逆地转化为红色荧光。对新生小鼠结肠施加 405 nm 光照后，可标记 CD45...

哺乳动物的胃肠道中栖息着数百种细菌，这些细菌与宿主之间存在着共生关系1。存在于局部微环境中的免疫细胞可促进宿主与这些微生物之间的和平共存，并建立抵御病原体入侵的保护屏障。因此，免疫细胞与微生物群之间的双向相互作用对于建立共生菌群至关重要，这类菌群能够训练宿主免疫系统，并设定免疫系统对病原体反应的阈值。微生物组成的变化，即菌群失调，可能破坏免疫稳态，干扰抑制肠道炎症的调控回路，从而导致1型糖尿病和炎症性肠病（IBD）等免疫介导的疾病2,3。
出生后的时期是一个独特的发育窗口期，在此期间，肠道微生物群落开始建立，同时免疫系统也在逐渐成熟4。出生后的微生物群并不稳定，其群落组成会自然且频繁地发生变化5。与微生物群相互作用的免疫细胞存在于肠道的两个不同解剖位置——固有层和肠上皮6。肠道中存在多种类型的免疫细胞，包括淋巴细胞（如T细胞、B细胞和先天性淋巴样细胞）以及髓系细胞（包括树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞）。这些细胞也被称为造血细胞，具有多种功能，可维持肠道屏障并保持稳态。
除了在肠道部位发挥调节功能外，黏膜免疫细胞还可能将微生物信号传递至肠外部位，从而调节全身免疫7,8,9。这一领域正日益受到研究关注，也凸显了建立识别从肠道组织迁移而出的免疫细胞的方法的重要性，以进一步探究其功能。本方案采用一种 commercially available 小鼠模型，利用光转化荧光蛋白对细胞进行标记。PhAMexcised 小鼠普遍表达一种绿色荧光的 Dendra2 蛋白，在紫外光（UV）照射后可不可逆地转变为红色荧光10。通过光纤套管将 405 nm 光照导入新生小鼠的结肠，我们证实了起源于结肠或曾经过结肠的光转化造血细胞可在脾脏中被检测到。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;激光&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>发光二极管（LED）</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>警告：此为3b类激光器。使用激光时必须佩戴安全护目镜。其发射波长为405 nm，电流为1400 mA。该设备为光纤耦合，接受SMA接口。https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED驱动器</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>向激光器提供1200 mA的恒定电流。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>光遗传学补光光纤线</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>长度为1 m、带SMA接口的光纤线。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>光纤套管</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>长度为5 mm的套管，外径为500 &amp;micro;m，内径为480 &amp;micro;m。数值孔径（NA）值为0.5。套管材质为氧化锆，外径1.25 mm。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>电源</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>提供15 V电压，电流为2.4 A。https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3激光安全护目镜&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>橙色镜片，可见光透过率为47%。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>红光&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W灯泡。https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;肠细胞分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>警告：吸入该麻醉剂可能导致头晕、嗜睡，甚至意识丧失。应在II级生物安全柜中使用该麻醉剂。&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1× HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>无钙镁。https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>小牛血清</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>浓度为0.5 M。https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>警告：吞食有害，可引起皮肤刺激。浓度为1 M。https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>浓度为1 M。https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70微米细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>微型磁力搅拌子</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>每次使用后需用70%乙醇冲洗，使用前需用蒸馏水冲洗数次。搅拌子长度为8 mm，呈八角形。https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL刻度移液管</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL刻度移液管</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;单细胞悬液制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>容量为1.5 mL。https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>组织匀浆器&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>需使用2节AA电池。https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>匀浆器头&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>塑料材质，0.5 mL规格的头。https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40微米细胞筛</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786抗小鼠CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>克隆号3O-F11。https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>活/死细胞染色试剂</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>用于断头处死。https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

体内光标记结肠细胞以评估新生小鼠造血细胞的迁移潜能

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

肠道菌群在生命早期即建立，并影响免疫细胞的发育与功能。新生儿微生物群易受到多种外界因素的影响，包括抗生素使用和饮食，这些因素会影响个体对自身免疫性疾病和炎症性疾病的易感性。诸如炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）等疾病的特点是大量免疫细胞浸润至肠道。然而，受微生物群调控的免疫细胞还可能从肠道向外迁移，进而影响肠外部位的免疫应答。因此，有必要识别并表征那些可能将微生物信号从肠道传递至远端部位的细胞。本文描述了一种在新生小鼠结肠中标记细胞的方法 体内 可在迁移后于肠外位点对其进行鉴定。

使用光纤电缆将405 nm的光传递至2日龄PhAMexcised小鼠的结肠中。在先前的实验中，确定30秒的照射时间可在最小细胞毒性的情况下实现结肠细胞最大程度的光转化（图1A）。因此，按照本方案所述，对结肠的不同节段依次进行30秒的照射。激光照射后，立即处死小鼠，并检测细胞的光转化情况。将全部结肠组织制备为单细胞悬液，用荧光标记的抗CD45抗体染色，并通过流式细胞术分析检测光转化效果。未转化的Dendra2-绿色（Dendra-g）蛋白的激发和发射波长最大值分别为490 nm和553 nm，可在FITC通道中检测；而光转化后的Dendra2-红色（Dendra-r）蛋白的激发和发射波长最大值分别为507 nm和573 nm，可在流式细胞仪的PE通道中检测。Dendra2一旦不可逆地转化为红色形式，便具有高度的光稳定性，适用于长期示踪应用。
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本方案采用光标记方法，在新生小鼠中特异性识别从结肠迁移至肠外部位的免疫细胞。该策略将有助于研究生命早期宿主与微生物组之间的相互作用。

肠道菌群在生命早期即建立，并影响免疫细胞的发育与功能。新生儿微生物群易受……影响。

该方法有助于解答黏膜免疫学领域中关于新生儿宿主免疫系统与微生物组相互作用的关键问题，例如：细胞是否会携带微生物信息，如果会，是哪些细胞？该技术的主要优势在于能够非特异性且不可逆地标记幼鼠结肠定植细胞，从而让我们确定这些细胞向肠外组织的迁移模式。组装激光器时，需通过LED上的四针M8连接线将发光二极管（LED）连接至LED驱动器，并小心拧紧螺丝以固定连接。将LED的连接器开口朝向光源，检查是否存在可见的阻塞物。将光遗传学连接光纤插入开口中。将套管插入连接器套筒的任一端。然后将连接套管的另一端连接到跳线电缆的末端，从而将光纤插管与光纤跳线电缆连接起来。使用连续调节旋钮将LED驱动器设置为连续波模式，并将电流限制设为1.2安培。当激光器准备就绪后，在暗处将LED驱动器接入电源。用一只手的食指和拇指轻轻捏住已麻醉的出生后第10至12天小鼠背部的皮肤。将动物翻转以暴露腹部，并用无名指和小指夹住尾巴固定。用另一只手取下导管的保护帽，然后将光纤导管经肛门轻柔插入结肠，确保光纤的全部五毫米均进入小鼠体内，同时保持导管的长轴与小鼠身体中线平行。套管的设计，包括其柔韧性、直径和长度，对本操作的成功至关重要。新生幼鼠非常脆弱，必须格外小心以避免刺穿结肠。佩戴安全护目镜后，将激光电流调至最大值，并通过观察动物半透明的腹部来确认紫外光的存在。每30秒将导管回撤约一毫米，以最大化暴露于光照下的管腔面积。在紫外光照射总共两分钟后，缓慢将导管从小鼠体内取出，并关闭激光器。待小鼠从麻醉状态恢复后，将其放回饲养笼中。为获取肠道淋巴细胞，使用洁净的镊子和剪刀打开腹腔，并将肠管移向一侧以暴露结肠。为完整切除结肠，首先在盲肠远端稍远处横断组织，然后用镊子牢固夹住结肠，用剪刀从尿道剪至直肠。接着在尽可能靠近肛门处切断结肠，将整个结肠从腹腔中取出。用镊子将结肠内容物推出，置于干燥的纸巾上。将清洁后的结肠转移至组织培养皿的盖子上。使用刀片将样本仔细切碎，并将所得组织糊转移至置于含有10毫升冰冷的、添加小牛血清的Hank's平衡盐溶液（HBSS-CS）的培养皿中的细胞筛中。向过滤器中加入一个洁净的、长8毫米的磁力搅拌子，将培养皿置于九孔磁力搅拌器上，设置磁力搅拌子转速为800 RPM。室温孵育5分钟后，弃去缓冲液，并用10毫升HBSS-CS再次洗涤。加入10毫升预热的上皮细胞消化缓冲液以解离上皮细胞，在37摄氏度培养箱中以800 RPM转速搅拌30分钟。孵育结束后，将富集的肠上皮细胞组分转移至15毫升离心管中进行离心。然后将沉淀物在冰上用1毫升FACS缓冲液重悬。接下来，用HBSS-CS在过滤器中将剩余的固有层组织清洗两次，操作如前所述，随后在37摄氏度下，用10毫升含EDTA的洗涤缓冲液分两次孵育，每次15分钟，并持续搅拌。随后用 HBSS-CS 再洗涤样本两次，接着在室温下不搅拌条件下，用 10 毫升无

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科研

JoVE Journal

Medicine

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