Name: 鼻电位差量化小鼠跨上皮离子转运 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解鼻电位差测量技术，用于评估小鼠跨上皮离子转运功能。该方法可量化CFTR和ENaC等离子通道活性，为囊性纤维化新疗法研究提供可靠数据，支持连续繁殖小鼠模型并降低死亡率。

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作者感谢 J. Lebacq 教授对稿件的审阅。Cftrtm1Eur （纯合 F508del-CFTR（FVB/129）小鼠）由荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）在欧洲经济共同体囊性纤维化研究协调行动（European Coordination Action for Research in Cystic Fibrosis）EU FP6 LHHM-CT-2005-018932 项目支持下培育而成。

本研究及相关操作已获得伦敦大学学院动物研究伦理委员会批准（2017/UCL/MD/015），并符合欧洲共同体关于实验动物使用的规定（CEE n° 86/609）。研究人员具备动物实验资格，符合2010年9月22日欧洲议会和理事会关于保护用于科学目的动物的第2010/63/EU号指令。
1. 检测前评估与管理
<ol>
	<li>准备双腔鼻导管。 
	​注意：鼻导管由双腔毛细管制成，其中一个腔用于溶液的连续灌注，另一个腔作为测量通道。
	<ol>
		<li>取一段长约20 cm的聚乙烯管（内径2.0 mm，外径3.0 mm；图1a），将其中部在燃气灯火焰上加热，直至足够软化以便拉伸（10–15 s）。</li>
		<li>将两端拉开，拉制成适当长度（约15 cm）和外径（约0.1 mm）的细毛细管，用于制作鼻探针（图1b）。</li>
		<li>用纯乙醇清洗并脱脂两根此类毛细管，用胶带将它们并排固定（图1c），然后使用氰基丙烯酸酯胶水将其粘合在一起。</li>
		<li>用剃刀或解剖刀切去探针多余部分，使双腔导管的最终长度约为8 cm（图1d）。</li>
		<li>通过两个腔分别注入水，以确认其通畅性。</li>
		<li>在探针尖端5 mm处做一标记。 
		注意：探针插入鼻孔时以该标记为限，确保所有测量均在鼻腔内相同位置进行。</li>
		<li>将双腔鼻导管存放于干燥箱中。 
		注意：若测试后立即适当清洁，该导管可重复使用6–10次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备乳膏混合物。
	<ol>
		<li>将电解质乳膏与饱和3 M KCl溶液按1:1体积比轻轻混合，避免产生微小气泡。 
		注意：如图1所示，该乳膏混合物用于构建测量电极和参比Ag/AgCl电极的电极桥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="静脉输液系统示意图；组件标记为 a-g；用于液体输送研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：带电极和桥接结构的探针。 该图展示了聚乙烯管在加热和拉伸前（a）和拉伸后（b）的状态、连接双腔导管两个毛细部分（c）的胶带（d）、硅胶管接头（e）以及电极（f）。为便于图像清晰，图中接头未填充乳膏混合物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液标签</td>
			<td>溶液描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>基础缓冲盐溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>无氯缓冲盐溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>10-2 M 氨氯吡脒储备液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>10-3 M 福斯科林储备液</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：小鼠鼻部电位差测试用储备溶液。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>盐</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子量</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钠 (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二水合氯化钙 (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>六水合氯化镁 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸氢二钾 (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸二氢钾 (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：基础缓冲盐溶液（储存液A）的成分。
<ol start="3">
	<li>配制溶液。
	<ol>
		<li>配制实验方案所需的四种储备液（表 1）。
		<ol>
			<li>通过在室温下将盐类溶解于纯水中，配制基础缓冲溶液（储备液 A；表 2）和无氯缓冲溶液（储备液 B；表 3）。使用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.4（范围 7.0–7.6），若需降低 pH 则使用 1 N HCl。检测溶液的渗透压（275 mOsm/L）。</li>
			<li>将溶液储存于带标签的玻璃瓶中，4 °C 下可保存最多 3 个月，或分装于塑料瓶中冷冻保存最多 6 个月。</li>
			<li>通过将 26.6 mg 氨氯吡脒盐酸盐加入 10 mL 纯水中，配制 10-2 M 氨氯吡脒溶液（储备液 C）。将混合物在 70 °C 下加热 5 至 10 分钟。由于氨氯吡脒对光敏感，需将溶液 C 储存于避光容器中。标记容器，并在 4 °C 下保存最多 3 个月。</li>
			<li>通过将 10 mg 福斯科林加入 24.36 mL 纯水中，配制 10-3 M 福斯科林溶液（储备液 D）。将福斯科林储备液分装为 0.1 mL 份量，标记后于 -20 °C 保存最多 6 个月。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制新鲜溶液 A1、B1 和 B2（表 4）。
	<ol>
		<li>通过取 10 mL 基础盐溶液（储备液 A）并加入 0.1 mL 10-2 M 氨氯吡脒溶液（储备液 C），配制新鲜溶液 A1（基础缓冲盐溶液 加 10-4 M 氨氯吡脒）。标记容器，并在配制后 24 小时内使用。</li>
		<li>通过取 10 mL 无氯缓冲盐溶液（储备液 B）并加入 0.1 mL 10-2 M 氨氯吡脒溶液（储备液 C），配制新鲜溶液 B1（无氯缓冲盐溶液 加 10-4 M 氨氯吡脒）。标记容器，并在配制后 24 小时内使用。</li>
		<li>通过取 10 mL 无氯缓冲盐溶液（储备液 B），加入 0.1 mL 10-2 M 氨氯吡脒溶液（储备液 C）和 0.1 mL 10-3 M 福斯科林溶液（储备液 D），配制新鲜溶液 B2（无氯缓冲盐溶液 加 10-4 M 氨氯吡脒和 10-5 M 福斯科林）。标记容器，并在配制后 2 小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>盐</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子量</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖酸钠（单钠盐）</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖酸钙（无水粉末）</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>七水合硫酸镁（MgCl2.6H2O）</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸氢二钾（K2HPO4）</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：无氯缓冲液（储备液B）的成分。
<img alt="动物生理记录装置；包含用于科研实验中数据分析的传感器和导管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：灌注鼻黏膜期间小鼠的体位。 该图显示了加热垫（a）、电压表（b）、插入后肢皮下空间的参考电极（c）、蠕动泵的近端（d）和远端（e）出口、枕头（f）以及床单（g）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
2. 检测过程中的评估与管理
<ol>
	<li>准备实验装置。
	<ol>
		<li>为防止测试期间及测试后发生低体温，使用两个维持在生理温度的加热垫，一个用于测量装置（18.8 x 37.5 cm；图2a），另一个（15.5 x 15.5 cm）用于动物测试结束后恢复时所放置的盒子。</li>
		<li>启动连接数据采集软件的计算机，该计算机连接高输入阻抗（>1012Ω）和高分辨率（0.1 mV）电压表（图2b）。</li>
		<li>将电极连接至电压表。将正极测量电极连接至鼻导管，负极参考电极连接至插入后肢皮下空间的导管，如图2c所示。</li>
		<li>将电极尖端共同浸入电解质乳剂混合物中。检查初始电极偏移值。若该值大于（±）2 mV（理想为0 mV），则弃用该电极。</li>
		<li>启动蠕动泵，并将泵管插入指定位置，如图2所示。</li>
		<li>将泵管近端出口连接至盛有选定鼻灌注溶液的小瓶（图2d）。将泵管远端出口连接至鼻导管的灌注通道（图2e）。</li>
		<li>通过10 µL移液器吸头将电解质乳剂混合物填充至鼻导管的一个通道中。将导管连接至硅胶管接头（图1e），用乳剂混合物填充接头，并将正极电极插入接头中（图1f）。检查测量电极桥偏移值。若该值大于（±）2 mV（理想为0 mV），则弃用该桥。</li>
		<li>将鼻导管的第二个通道用新鲜溶液A1填充。将鼻导管尖端浸入盛有溶液A的小瓶中。反转蠕动泵方向，使鼻导管中填充相当于10秒灌注长度的液体。 
		注：这可在施加阿米洛利前记录10秒的基础电位差（PD）值。将鼻导管尖端浸入参考电极接头内的乳剂混合物中（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始处理小鼠。
	<ol>
		<li>记录小鼠体重，以计算需通过腹腔（ip）途径注射的麻醉剂精确剂量17。</li>
		<li>使用26G（0.45 x 10 mm）针头，腹腔注射预麻醉药物以促进麻醉诱导：固定剂量50 µL的5 mg/mL咪达唑仑。等待5分钟。</li>
		<li>配制麻醉混合液（芬太尼、美托咪啶、氟哌啶醇的终浓度分别为0.05、0.40和20 mg/kg体重，可乐定为固定剂量0.375 µg），以实现最佳且稳定的麻醉深度（III期，2平面）17。腹腔注射麻醉混合液，随后注射可乐定剂量。 
		注：15分钟后，小鼠应已入睡，麻醉可持续至少30分钟。</li>
		<li>折叠一张吸水纸，制成宽约3 cm的“枕头”（图2f），覆盖在加热垫上部（图2a），作为小鼠头部的支撑。</li>
		<li>用一张吸水纸覆盖加热垫（“床单”；图2g）。将小鼠仰卧置于加热垫上。用胶带固定四肢和尾巴（图2）。</li>
		<li>将参考静脉导管（图1g）插入后肢皮下空间。拔出针头，并连接硅胶管接头（图1e, 2c）。</li>
		<li>用乳剂混合物填充导管和接头，并将负极电极插入接头中（图1f）。</li>
		<li>根据需要，用胶带固定导管和电极，防止任何移位。在放置参考电极和桥之后，再次将鼻导管尖端浸入静脉导管接头内的电极乳剂混合物中，验证测量电极桥偏移值。记录稳定的最终偏移值（理想小于（±）2 mV）。</li>
		<li>用“温和”胶带将小鼠耳朵固定在加热垫上，位置位于两片吸水纸（“枕头”（图2f）与“床单”（图2g））之间的空隙处。固定触须（鼻孔附近生长的硬毛），但不要触碰眼睛。</li>
		<li>为吸收口腔内的液体，将舌头侧向移动（图3a），并将约1 cm长的滤纸尖端（“导流管”；图3b）插入嘴中。为吸收从灌注鼻孔流出的液体，在鼻尖处放置第二片滤纸（“手帕”；图3c）。</li>
		<li>通过将鼻导管尖端接触口腔内侧，检查上皮电位的阳性对照值。 
		注：读数应稳定，范围在-10 mV至-20 mV之间。</li>
		<li>在良好直视照明下，用精细镊子轻柔地将鼻导管插入一侧鼻孔，深入距鼻尖4–6 mm处。 
		注：鼻PD导管位于中鼻甲处，该位置可提供最大且稳定的基线PD值17,20。</li>
		<li>注射麻醉药物5分钟后，将加热垫轻轻倾斜约30°，使动物头部向下。监测最大基础PD值。</li>
		<li>当PD值在约30秒内保持稳定后，以10 µL/min的恒定速率依次对鼻黏膜灌注4种缓冲溶液（A、A1、B1、B2）。第一种溶液（步骤1.3.1.1）灌注10秒，后续每种溶液（步骤1.4）灌注5分钟或直至达到稳定值。当佛司可林（B2）的瞬时反应开始下降时，停止灌注佛司可林。</li>
		<li>选择1秒时间间隔进行数据记录。从开始灌注时起开始记录数据。在计算机屏幕上以时间为横轴显示数据。</li>
		<li>在溶液B2灌注结束后停止数据采集。将数据保存为电子表格文件。</li>
		<li>通过减去最终偏移值对数据进行校正。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="啮齿类动物手术操作示意图，标注了解剖结构；展示解剖技术的实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠在加热垫上的位置，鼻导管和滤纸已放置就位。 该图显示了舌头被置于一侧（a）、导管（b）以及纱布（c）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 检后评估与管理
<ol>
	<li>将小鼠从加热垫上移开。</li>
	<li>用“床单”擦拭小鼠鼻部（图 2g）。</li>
	<li>通过腹腔注射给予麻醉拮抗剂混合物，包含固定剂量（4 µg）的纳洛酮（一种竞争性吗啡拮抗剂）和阿替美唑（美托咪啶特异性解毒剂，剂量为 2 mg/kg 体重）。</li>
	<li>将小鼠置于恢复箱内的小型加热垫上，直至完全恢复，通常在 1 至 2 小时内观察到。 
	注意：在 UCL 实验室中，约有 10% 的死亡率，主要与测试过程中灌注于鼻腔的溶液引起支气管误吸有关，且与性别或基因型无关。</li>
</ol>

<ol><li>Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bioelectric+potential+difference+across+respiratory+epithelia+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).</li>
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<li>Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nasal+potential+difference%3A+techniques+and+protocols+for+assessing+efficacy+of+gene+transfer+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis.</a> Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文旨在描述一种在自主呼吸的小鼠中，通过持续灌注溶液来测量鼻部电位差（PD）的适当方案，实验时长足以检测离子转运蛋白（主要是CFTR和ENaC）功能的完整性。该方案的各个步骤均已经过仔细优化，以确保动物完全恢复，并获得高质量且可重复的数据。其中，关键步骤包括麻醉的评估与管理，以及实验过程中和实验后动物体位的恰当安置与护理。
既往研究表明，通过使用此处所述的混合麻醉剂可达到麻醉暴露的二期平面III17，与规律呼吸以及无负性肌力效应和无眨眼、瞳孔及足底回缩反射相关。在此麻醉深度下，可保留鼻导管 原位 用于鼻腔持续灌注以及作为测量电极的桥接，具有良好的耐受性。将导管插入皮下空间作为参考电极的桥接时，亦未出现任何疼痛反应或有害效应的迹象。在啮齿类动物中，来自鼻面部区域的感觉输入在行为调控中具有重要作用 与……相比 外部环境因素，包括威胁性刺激，使得在鼻腔内手术时维持适当的麻醉深度尤为困难。在一些小鼠研究中，已采用雾化给药替代持续鼻腔灌注来进行鼻腔PD检测。33...

近三十年来，人们一直通过测量电势差（PD）来评估鼻黏膜上表达的跨膜离子转运体的功能状态，以代表远端气道的情况1。作为一种多步骤动态检测方法2,3，鼻电势差（nasal PD）可对定位于上皮细胞顶膜、并在气道表面液化中发挥关键作用的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和上皮钠通道（ENaC）的功能进行解析。鼻PD检测最主要的临床应用是辅助诊断囊性纤维化（CF），后者是高加索人群中最常见的致死性遗传病，在欧洲国家的平均发病率约为每2,500名活产婴儿中1例。该检测长期以来在诊断迟发性的、症状轻微或单一症状型的CF方面具有重要价值，同时也用于诊断与CF相关的疾病，如先天性双侧输精管缺如、特发性慢性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病以及支气管扩张症4。近年来，在对CFTR基本缺陷的治疗性调节进行临床计量学评估时5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，鼻PD已被广泛应用于新型CF疗法的临床试验中。在临床前研究中，该技术已成功应用于小鼠模型17，以评估针对CF新靶点疗法的生物活性18,19,20,21。由于啮齿类动物与人类在鼻部解剖结构大小上的物种差异，以及感觉输入在啮齿类动物鼻面部区域中的重要作用，该技术在小鼠中的操作较为精细，需要经过专门培训的技术人员以及专用的设备和耗材。
囊性纤维化是一种外分泌腺的多系统性疾病，其临床表现以慢性呼吸系统疾病为主。该病由编码环磷酸腺苷（cAMP）调节的CFTR氯离子通道的基因突变所致22。迄今为止，已发现超过2000种CFTR突变23。其中最常见的突变24,25出现在近90%的囊性纤维化等位基因中，表现为蛋白质多肽链第508位苯丙氨酸缺失（F508del-CFTR）。CFTR蛋白是一种纯欧姆性、小电导氯离子通道。还有大量证据表明，CFTR可调节其他转运机制，特别是ENaC26,27。电解质转运功能障碍，包括CFTR依赖性氯离子电导降低和ENaC依赖性钠离子电导增强，是囊性纤维化上皮组织的典型特征。前者缺陷表现为：在有利于氯离子外流的电化学梯度条件下，或加入异丙肾上腺素（一种可升高细胞内cAMP的β-肾上腺素能激动剂）或佛司可林（一种腺苷酸环化酶激动剂，尚未获准用于临床）后，去极化反应减弱或消失；后者缺陷则表现为鼻黏膜基础电位超极化（电位更负）以及对阿米洛利（一种可阻断ENaC的利尿药物）的反应增强28。
囊性纤维化小鼠模型在囊性纤维化研究中被广泛使用，对于解析囊性纤维化的病理机制具有重要价值。目前，已有至少十五种模型被报道29，其中三个为临床上最相关的F508del突变纯合子30,31,32. 这三种菌株之一30，由鹿特丹伊拉斯姆斯大学开发，已在比利时天主教鲁汶大学（UCL）实验室中使用了近20年。Cftrtm1Eur 模型30 已被证明在研究囊性纤维化疾病的多器官病理生理学以及评估新治疗策略的有效性方面非常有用18,19,20,21. 在操作过程中或操作后早期可能出现多种问题（&#60;24 小时）小鼠鼻部电位差检测。本文中，维持鼻部导管所需的最佳麻醉深度 原位 用于持续灌注，同时描述了防止鼻腔灌注液发生支气管吸入的措施。实验结束后的动物护理也进行了说明，包括给予麻醉药物的复合解毒剂，可迅速逆转麻醉状态，使动物完全恢复。总体而言，这些操作可在自主呼吸的小鼠中实现可靠的测量，降低与实验相关的死亡率，并允许在同一只动物上重复实验。文中展示了囊性纤维化（CF）小鼠与野生型小鼠鼻电位差（nasal PD）实验的代表性数据，并进行了分析与讨论。
小鼠鼻部电位差（PD）检测方案分为三个阶段进行报告：检测前、检测中和检测后的评估与管理。在检测前的评估与管理部分，详细描述了用于持续鼻腔灌注的双腔鼻导管及溶液的制备步骤。在检测过程中的评估与管理部分，对实验装置的搭建以及小鼠的操作进行了细致说明。最后，介绍了检测结束后的动物管理措施，以促进小鼠的完全恢复。

<table><tbody><tr><td>Portex 聚乙烯管&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500；2.0 mm 内径，3.0 mm 外径</td><td>用于制备鼻部探针的毛细管</td></tr><tr><td>电极膏</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux 奶油</td><td>用于构建电极桥</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 电极</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>作为测量电极和参比电极</td></tr><tr><td>盐酸阿米洛利</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>用于配制灌注溶液</td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>用于配制灌注溶液</td></tr><tr><td>Knick Portamess 电压表</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Portavo 904 pH</td><td>用于测量电位差</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 软件&amp;nbsp;</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Paraly SW112 软件</td><td>用于采集电位差数据</td></tr><tr><td>咪达唑仑&amp;nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgium</td><td>Dormicum 15 mg/3 ml</td><td>作为麻醉前用药</td></tr><tr><td>芬太尼</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td><td>作为麻醉用药</td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>作为麻醉用药</td></tr><tr><td>滴定哌醇&amp;nbsp;</td><td>Janssen&amp;nbsp; Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td><td>作为麻醉用药</td></tr><tr><td>可乐定&amp;nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml</td><td>作为麻醉用药</td></tr><tr><td>参考用静脉导管</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA × 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>用于构建电极桥</td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>Dumont #5, Fine Science Tools</td><td>用于放置鼻导管</td></tr><tr><td>纳洛酮&amp;nbsp;</td><td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td><td>Narcan, 0.4 mg/ml</td><td>作为麻醉拮抗剂</td></tr><tr><td>阿替咪唑&amp;nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>作为美托咪定的特异性解毒剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热垫&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18.8×37.5 cm；15.5×15.5 cm</td><td>用于避免测试期间及之后的低体温</td></tr><tr><td>蠕动泵 P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td><td>18111091</td><td>用于向小鼠鼻腔灌注溶液</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶</td><td>Loctite, Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>超级胶水 3</td><td>用于将两根毛细管粘合在一起&amp;nbsp;以制备鼻部探针</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>CaCl₂·2H₂O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>MgCl₂·6H₂O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>K₂HPO₄</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钠</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钙</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>MgSO₄·7H₂O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>药用级，USP</td></tr><tr><td>BD 针头&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0.45×10 mm)</td><td>用于腹腔注射</td></tr></tbody></table>

小鼠鼻上皮电位差测定法量化跨上皮离子转运

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

鼻电位差检测已用于辅助诊断囊性纤维化（CF）近三十年。该检测在临床表现较轻、寡症状或单症状型CF（通常在较晚年龄确诊）以及CF相关疾病（如先天性双侧输精管缺如、特发性慢性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病和支气管扩张）的诊断中具有重要价值。在临床和临床前研究中，该检测还被用作生物标志物，以量化CF靶向治疗策略的疗效反应。将该检测技术应用于小鼠具有挑战性，可能伴随一定的死亡率。本文描述了维持鼻导管所需的最佳麻醉深度 原位 用于持续灌注。文中列出了避免鼻腔灌注溶液发生支气管误吸的措施，并描述了实验结束后的动物护理，包括给予麻醉药物的复合解毒剂，从而迅速逆转麻醉状态，使动物完全恢复。来自囊性纤维化（CF）小鼠和野生型小鼠的代表性数据表明，该检测方法能够有效区分CF与非CF小鼠。综上所述，本方案可对自由呼吸小鼠的跨上皮氯离子和钠离子转运功能状态进行可靠测量，允许在同一动物上进行多次检测，并降低与检测相关的死亡率。

为了阐明囊性纤维化（CF）中特征性的离子转运异常，按照上述方案对中国台湾布鲁塞尔品系的F508del-CF小鼠及FVB/129遗传背景的野生型对照小鼠进行了鼻部电位差（PD）测量，这些小鼠属于Cftrtm1Eur小鼠模型30。这一具有临床相关性的模型携带最常见的、也是最严重的F508del-CFTR突变之一23,24,25，是目前最理想的CF小鼠模型30,31,32。
代表性鼻部电位差（PD）记录图，来自一只4月龄...

本文介绍了一种用于测量小鼠鼻电位差的实验方案。该检测方法可定量分析跨膜离子转运蛋白（如囊性纤维化跨膜传导调节因子和上皮钠离子通道）的功能，对于评估囊性纤维化新型疗法的有效性具有重要价值。

鼻部电位差检测已用于辅助诊断囊性纤维化（CF）近三十年，已被证实具有重要帮助……

鼻电位差是一种用于表征模拟囊性纤维化的转基因小鼠表型的重要方法。该方法可用于评估新型囊性纤维化疗法的有效性。该技术的主要优势在于，能够在持续繁殖的小鼠中提供可靠的测量结果。它可降低相关死亡率，并允许在同一只动物上重复进行测试。制备双腔鼻导管时，将一根20厘米长的聚乙烯管中部置于火焰上约10至15秒，直至其软化至可拉伸状态。随后，将两端拉开，得到一段长约15厘米、外径为0.1毫米的极细毛细管，用作鼻部探针。随后，使用纯乙醇清洗并脱脂两根毛细管。用胶带将它们固定在一起，并使用氰基丙烯酸酯胶水粘合。用剃刀片切除探针多余的长度，制备成约八厘米长的双腔导管。然后，通过两个腔道注入水，以确认其通畅性，并在距离尖端五毫米处做一标记。随后，将电解质膏与饱和的三摩尔钾溶液按1:1的比例混合，配制乳膏混合物，注意避免产生微小气泡。对于实验装置，为防止测试期间及测试后动物发生低体温，使用两个加热垫，一个用于测量装置，另一个用于动物测试结束后恢复期间所放置的盒子。打开连接至数据存储高输入阻抗、高分辨率电压表的计算机，然后启动数据采集软件。将电极连接至电压表。将电极的尖端共同浸入乳霜混合物中。检查初始电极偏移值，如果该值超过正负两毫伏，则弃用这些电极。然后，打开蠕动泵，并将泵管插入鼻导管的灌注腔内。使用10微升移液器吸头将电解质乳膏混合物填充至鼻导管的一个管腔内。将导管连接至硅胶管连接头，并用乳膏混合物填充该连接头。随后，将正极电极插入连接头中。检查测量电极桥的偏移值，如果偏移值大于正负两毫伏，则弃用该电极桥。随后，将泵管的近端出口连接至盛有所选鼻腔灌注溶液的小瓶。然后，将泵管的远端出口连接至鼻导管的灌注腔。接下来，用新鲜的A1溶液填充鼻导管的第二个管腔。将鼻导管的尖端浸入装有A溶液的小瓶中。反转蠕动泵的方向，使鼻导管中相当于10秒灌注长度的部分充满液体。随后，将一张吸水纸折叠成一个宽约三厘米的垫子，用于支撑小鼠头部。用吸水纸覆盖加热垫。然后，将小鼠仰卧置于加热垫上，并用胶带固定其四肢和尾巴。随后，将参考静脉导管插入后肢的皮下空间。拔出针头，并连接至硅胶管接头。用奶油混合物填充导管和连接器。接下来，将正极测量电极连接到鼻导管，将负极参考电极连接到插入动物后肢皮下空间的导管。然后，根据需要使用胶带固定导管和电极，以防止任何移位。放置参考电极和盐桥后，将鼻导管尖端浸入静脉导管连接器内的电极膏混合物中，再次验证测量电极盐桥的偏移值。记录稳定后的最终偏移值。现在，用胶带将小鼠耳朵固定在加热垫上，位置位于两片吸水组织之间的空旷区域。在不触碰眼睛的情况下固定活力。为吸收口腔内的液体，将舌头向一侧移动，并将约一厘米长的尖头滤纸条插入嘴中。为吸收从灌注鼻孔流出的液体，在鼻尖处放置第二块滤纸。通过将鼻导管尖端置于口腔内，检测上皮电位的阳性对照值。使用精细镊子夹持导管，并在良好直视照明下，轻柔地将鼻导管插入一个鼻孔，深度达距鼻尖4至6毫米处。注射麻醉药物5分钟后，将加热垫轻轻倾斜约30度，使动物头部朝下。监测最大基础电位差（PD）值。当该值在30秒内保持稳定时，依次以每分钟10微升的速度向鼻黏膜灌注四种缓冲溶液。第一种溶液灌注10秒，随后每种溶液灌注5分钟，或直至达到稳定电压为止。当福斯科林的瞬时反应开始下降时，停止灌注福斯科林。评估完成后，将小鼠从加热垫上移开，给予麻醉拮抗剂混合物，并将其转移至带有加热垫的恢复箱中，直至完全恢复。以下是来自一只纯合型正常小鼠和一只携带F508缺失CFTR突变纯合型小鼠的代表性鼻部电位差（PD）记录图，以及所获得的鼻部PD参数的各个具体数值。阿米洛利反应值是指用含阿米洛利的基础缓冲盐溶液灌注鼻黏膜期间，鼻部PD在结束时与开始时数值之间的差值。无氯反应值是指用无氯缓冲盐溶液（含阿米洛利）灌注鼻黏膜期间，鼻部PD在结束时与开始时数值之间的差值。佛司可林反应是指在用无氯缓冲盐溶液加佛司可林和阿米洛利灌注鼻黏膜期间，鼻电位差（PD）在灌注结束时与开始时的数值之差。总氯离子反应是在零氯灌注条件下获得的最后两个参数之和。该项目可用于研究小鼠中的转运缺陷，也可用于大鼠、大鼠以及雪貂囊性纤维化模型中的相关研究。以及在阉鼠模型中钠离子转运缺陷的研究。所有转运蛋白均可通过采用该方案进行研究。由于来自鼻面部区域的感觉输入具有重要功能，因此在啮齿类动物鼻腔内操作极为精细。 在小鼠鼻腔内进行操作时，麻醉剂量的充分控制尤为困难。

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

鼻电位差量化小鼠跨上皮离子转运

电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的可靠、易于实施且信息丰富的检测方法。本方案描述了记录装置的搭建、小鼠组织样本的制备、数据采集以及基本的数据分析方法。...

利用气相电嗅觉图记录分析小鼠嗅觉感觉神经元的反应

本视频演示了使用穿孔膜片钳技术对小鼠嗅觉感觉神经元（OSNs）进行电生理记录的方法。从小鼠中分离出含有表达荧光标记气味受体的OSNs的嗅觉上皮组织，并将其固定在记录室中。将记录电极夹持在OSN的树突 knob...

小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录

哺乳动物的鼻子是一个具有复杂内部结构的多功能器官。鼻腔内衬有多种上皮组织，例如嗅觉上皮、……...

一种有效的手工去骨方法以制备保持解剖结构完整的小鼠鼻组织

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。...

完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

本文介绍了一种生理学方法，该方法利用全细胞膜片钳记录技术，在小鼠犁鼻器急性冠状组织切片中对特定感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。...

小鼠犁鼻器急性组织切片中特定细胞群体的深入生理学分析

本方案描述了实时离子电渗法，这是一种用于测量活体脑组织细胞外间隙（ECS）物理参数的方法。通过检测惰性分子在细胞外间隙中的扩散情况，可计算出细胞外间隙的体积分数和迂曲度。该方法适用于研究脑细胞外间隙的急性可逆性变化。...

利用四甲基铵实时离子电渗法量化脑细胞外间隙的容积分数与迂曲度

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。...

电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

本文介绍了一种测量鼻电位差（NPD）的标准方案。通过灌注可调节离子通道活性的溶液，测定鼻黏膜上皮电压的变化，从而评估囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和上皮钠离子通道（ENaC）的功能，获得相应的检测结果。...

标准化鼻黏膜跨上皮电位差（NPD）测量方法

肠上皮不仅具有营养吸收功能，还能防止有害物质侵入。位于上皮细胞间连接最顶端的紧密连接可调节溶质和离子的细胞旁通透性。本文介绍了一种制备黏膜片并利用尤斯 chamber...

利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。...

原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

了解鼻电位差测量技术，用于评估小鼠跨上皮离子转运功能。该方法可量化CFTR和ENaC等离子通道活性，为囊性纤维化新疗法研究提供可靠数据，支持连续繁殖小鼠模型并降低死亡率。

小鼠鼻上皮电位差测定法量化跨上皮离子转运

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