Name: 纳米传感器检测体内蛋白酶活性的无创诊断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学习利用纳米传感器在体内检测蛋白酶活性的无创诊断方法。该技术通过尿液样本中的切割信号实现疾病进展的实时监测，为癌症等多种疾病的早期诊断提供了高灵敏度的新型工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）院长创新者奖资助（项目编号：DP2HD091793）。Q.D.M. 由美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目支持（资助编号：DGE-1650044）。B.A.H. 由美国国立卫生研究院 GT BioMAT 培训项目（项目编号：5T32EB006343）以及佐治亚理工学院校长奖学金支持。G.A.K. 获得伯勒斯威康基金科学交叉领域职业奖。本文内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

研究人员所在机构的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准是开展以下动物实验的必要条件。此外，需具备标准的动物护理设施（例如， 饲养室、无菌动物操作罩、异氟烷麻醉室以及 CO2 用于实施人道终点安乐死的装置）对于正确开展这些实验是必要的。相关机构的生理学研究实验室（PRL）可提供针对这些设施的专门培训与协助。所有动物实验均经佐治亚理工学院IACUC批准（方案编号：A14100）。
1. 氧化铁纳米颗粒（IONP）的合成
注意：安全事项：整个氧化铁纳米颗粒的合成过程必须在佩戴个人防护装备并在化学通风橱下进行。
<ol>
	<li>在15 mL锥形管中，将1 mL 30%氢氧化铵置于冰桶中冷却30 min。</li>
	<li>用去离子水清洗一个 250 mL 的锥形瓶，并加入 10 mL 双蒸水（ddH₂O）。2O）。将烧瓶外部浸入置于搅拌/加热板上的冰浴中。使用塑料移液管通入 N2 气体通入 ddH₂O2O₂ 置于烧瓶中。用 N₂ 鼓泡 15 分钟2 去氧。</li>
	<li>称重 224 µmol (4.5 克) 右旋糖酐（分子量 (MW) = 20 kDa）加入 50 mL 一次性无菌离心管中。加入 H2使终体积（包括葡聚糖）为 20 mL。充分涡旋振荡以溶解葡聚糖。</li>
	<li>称重 290 µmol (78.5 克) 六水合三氯化铁，加入葡聚糖溶液中，涡旋溶解。</li>
	<li>将所得溶液通过滤器过滤 0.2 µm 过滤器</li>
	<li>将1 mL 冰冻的氨水转移至9 mL 去氧水中。返回 4 °C.</li>
	<li>称重 367 µmol (73.0 克) 四水合氯化亚铁，溶于 1 mL 无氧 ddH₂O 中2O，然后过滤 0.2 µm 过滤器</li>
	<li>将葡聚糖-铁(III)溶液转移至250 mL锥形瓶中，并用N₂脱氧2 冰上孵育15分钟。使用以1600 rpm转速旋转的磁力搅拌子混合。</li>
	<li>为创建均匀的氮气环境，用橡胶隔垫密封烧瓶。用18号针头刺穿隔垫，通入N₂2 插入一个单独的18号针头作为流出通道。</li>
	<li>添加 467 µL 用1 mL注射器将铁(II)溶液加入右旋糖酐-铁(III)溶液中，同时使用磁力搅拌子以1600 rpm的速度搅拌。该铁(II)与铁(III)的比例可实现反应平衡，生成磁铁矿（Fe₃O₄）。3O4.</li>
	<li>将冷却的稀氨水逐滴加入铁(II)-铁(III)-右旋糖酐溶液中，以引发成核过程21确保每个液滴充分混合后再加入下一个。加入1-2 mL氢氧化铵后结束反应。</li>
	<li>停止氮气的流动2 并移除橡胶隔垫。撤去冰浴，换用温水浴，同时继续搅拌溶液。确保溶液温度达到 75 °C 孵育75分钟。</li>
	<li>将烧瓶从搅拌/加热板上取下，并通过双层滤膜过滤溶液 0.2 µm 然后 0.1 µm 用于去除粗颗粒的滤器。</li>
	<li>将颗粒置换到 ddH₂O 中2使用100 kDa分子量截留值（m.w.c.o.）的浓缩器去除溶液中过量的葡聚糖，此时溶液应非常黏稠。若经过2–3次离心后滤液仍呈深色，表明滤膜可能已破损，应更换滤器。
	<ol>
		<li>使用旋转滤器进行缓冲液置换时，离心处理 4 °C 在4800 × g下离心15分钟，弃去流出液，并向IONP溶液中加入新的缓冲液。重复3至5次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计或酶标仪测定纳米颗粒的浓度。在400 nm波长处测定吸光度，并采用该波长下IONP的摩尔吸光系数（ε = 2.07 x 106 厘米-1 M-1) 以测定 IO 颗粒的浓度。</li>
	<li>将IONPs重悬于ddH₂O中，浓度为10 mg/mL2O（通常总体积约为 3 mL），此步骤须使用聚丙烯管以确保化学相容性。加入 1.6 倍体积的 5 M NaOH，然后加入 0.65 倍体积的环氧氯丙烷。于室温下在平板振荡器上剧烈振荡混合 12 小时，以实现葡聚糖的交联。</li>
	<li>使用带有18号针头的20 mL注射器将IONP溶液转移至50 kDa分子量截留值透析膜中。将透析膜置于4 L ddH₂O中2O 并替换 H2每隔2-3小时轻摇数次，过夜孵育。</li>
	<li>测定浓度并将 IONPs 调整至 5 mg/mL（参见步骤 1.15）。加入氨水至终浓度为 20%（v/v），室温下振荡反应 &gt; 12 小时以使 IONPs 表面氨基化。使用 30 kDa 分子量截留值滤器进行缓冲液置换（见 1.14）。</li>
	<li>在最终通过快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化前，将体积调至2.5 - 3.5 mL（参见 材料清单 用于凝胶过滤柱。</li>
	<li>使用动态光散射（DLS）测定IONPs的流体动力学半径（预期范围10 - 100 nm，平均粒径40 - 50 nm）。取1 mL经100倍稀释的IONP样品置于比色皿中，放入仪器，利用厂商提供的软件进行测量。 
	注意：通过动态光散射（DLS）测量，IONPs 的总体粒径分布范围为 10 至 100 nm，但大多数颗粒的粒径集中在平均直径 40–50 nm 附近。若需进一步限定粒径范围，可采用尺寸排阻色谱法分离不同直径的组分。IONPs 应储存于 4 °C.</li>
</ol>
2. 肽的设计、与IONP的偶联及 体外 验证
<ol>
	<li>合成一种肽底物（例如， 由核心设施或商业途径获得的靶向蛋白酶，其N端带有荧光报告基团（如异硫氰酸荧光素（FITC）），C端带有半胱氨酸残基，以实现巯基介导的偶联。 
	注意：在本研究中针对 MMP9 所使用的肽为 FITC-PLGVRGK-C，其中 k猫/m ~ 2.0 × 105 M-1s-1.</li>
	<li>取0.5 mg的IONP（浓度为1 mg/mL），使用10 kDa截留分子量的离心滤膜，在偶联缓冲液（50 mM硼酸钠含1 mM EDTA，pH = 8.5）中进行缓冲液置换（参见步骤1.14）。</li>
	<li>将琥珀酰亚胺碘乙酸酯（SIA）溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成浓度约为 30 mg/mL 的溶液，并按 500:1 的摩尔比将 SIA 加入 IONP 中。 
	注意：SIA 是一种异双功能交联剂，可介导 IONPs 上的氨基与肽底物上的巯基之间的偶联。</li>
	<li>在室温避光条件下孵育1 - 2小时。若需过夜孵育，则置于 4 °C.</li>
	<li>使用10 kDa 分子截留量（m.w.c.o.）离心滤膜将缓冲液置换为偶联缓冲液，以去除未反应的SIA（参见步骤1.14）。</li>
	<li>将终产物溶液调整至1 mg/mL（0.5 mL溶液）。按90:1的摩尔比（肽:IONP）将目标肽与20 kDa巯基封端的聚乙二醇（PEG）混合，PEG与IONP的摩尔比为20:1（PEG:IONP）。将该肽-PEG溶液与IONP混合。</li>
	<li>在室温下，以最高转速在平板摇床上孵育过夜，用铝箔包裹管子以防止荧光分子发生光漂白。</li>
	<li>以500:1（C:IONP）的摩尔比加入L-半胱氨酸，以中和任何未反应的SIA分子。在室温下孵育1小时 25 °C 在室温下以最高速度振荡。</li>
	<li>通过FPLC进行纯化（参见1.1.19）。使用分光光度计测量样品溶液的吸光度，并根据以下方法计算肽：IONP比率。纯化后，将产物以1 mg/mL浓度储存于 4 °C 在 PBS 中。
	<ol>
		<li>使用分光光度计在 400 nm 处测定样品溶液的吸光度（A样本,400）以及所用荧光染料的最大吸收波长，FITC 的最大吸收波长为 488 nm（A样本，488）。在相同两个波长（400 nm 和 488 nm）下测定储备胺类 IONP 溶液的吸光度，分别记为 ANP,400 和 ANP,488.</li>
		<li>使用公式 1 和 2 计算归一化的 A400 和 A488 值。 
		<img alt="平衡方程图：A&lt;sub&gt;400&lt;/sub&gt; = A&lt;sub&gt;NP,400&lt;/sub&gt;，用于吸收分析。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">          公式 1 
		<img alt="488 nm 处吸光度计算公式：A = ANP,400 / Asample,400 - Asample,488 - ANP,488，用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2">          公式 2</li>
		<li>A400 和 A488 表示样品的归一化值。使用这些值并根据公式3计算肽与IONP的比率。 
		<img alt="多肽-IONP配方，用于吸光度比值A488/A400的光谱分析方程。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3">          方程 3</li>
		<li>何处 <img alt="离子纳米颗粒方程，εIONP，在研究示意图中，与纳米化学研究相关。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 和 <img alt="荧光量子产率方程符号 ε_荧光团用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"> 分别为IONP和荧光团的摩尔吸光系数。对于这些颗粒 <img alt="离子纳米颗粒方程，εIONP，在研究示意图中，与纳米化学研究相关。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 4"> = 2.06 × 106 M-1cm-1 以及用于 FITC <img alt="荧光量子产率方程符号 ε_荧光团用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"> = 72,000 M-1cm-1，因此该值为  <img alt="摩尔消光系数比 εIONP/ε荧光团，光谱分析中的方程。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6"> 应为28.75。典型的多肽：IONP比例应在20:1至50:1范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过执行以下步骤验证探针的功能性： 体外 切割实验
	<ol>
		<li>用 PBS（1% BSA）配制 18 µL 含200 nM肽浓度的纳米颗粒溶液。混合 2 µL 目的蛋白酶（MMP9；0.1 - 1 mg/mL）。</li>
		<li>在酶标仪中孵育 37 °C 孵育1小时，每隔1-2分钟进行荧光检测（使用相应的激发和发射波长，FITC的激发波长为485 nm，发射波长为528 nm），以监测切割反应进程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 纳米传感器的施用及癌症的尿液检测
注意：有关示例模型的更多细节，请参见我们之前的报告13。
<ol>
	<li>通过将圆筒形套管固定在96孔板顶部，制备用于尿液收集的代谢笼。在收集尿液期间，将小鼠放入套管内，并用培养皿盖覆盖，以防止动物逃逸。</li>
	<li>在无菌生理盐水中配制注射溶液（最大体积200 µL），其中纳米传感器的浓度为每肽段3000 mg/kg（约50 µmol）。</li>
	<li>对8周龄雌性裸鼠（nude mice），其携带负荷约为100–300 mm3的LS174T结肠直肠癌异种移植瘤（通常在第10天左右达到该负荷），通过尾静脉注射给予纳米传感器溶液。注射后立即把小鼠放入代谢笼中，并记录每只小鼠的注射时间。</li>
	<li>注射后60–90分钟，从96孔板上取下圆筒形套管。固定小鼠并轻压膀胱，促使小鼠将残留尿液排入孔板。收集全部尿液（200–500 µL）。</li>
	<li>通过免疫沉淀法分析尿液样本，以纯化尿液中的FITC并提高检测灵敏度。使用偶联了抗FITC抗体的磁珠。
	<ol>
		<li>首先，用包被缓冲液清洗磁珠25 mg，共清洗3次，并将最终体积调至225 µL。 
		注意：每次均需新鲜配制包被缓冲液（0.1 M硼酸钠，pH 9.5）、封闭缓冲液（PBS，0.5% BSA，0.05% Tween-20，pH 7.4）和洗涤缓冲液（PBS，0.1% BSA，0.05% Tween-20，pH 7.4），每种缓冲液约需20 mL。</li>
		<li>加入200 µL抗FITC抗体溶液（5 mg/mL）和200 µL硫酸铵溶液（3 M）。在旋转仪上37 °C孵育16–24小时。</li>
		<li>将溶液加入磁力分离器中，弃去上清液，替换为625 <img alt="静态平衡；ΣFx=0方程；力平衡；物理示意图；教学用途。" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程7">Λ封闭缓冲液，在37 °C过夜孵育。随后用洗涤缓冲液清洗3次，并储存于1.25 mL洗涤缓冲液中。</li>
		<li>将2 µL尿液与5 µL磁珠（20 mg/mL）混合，并用PBS（0.01% Tween 20）定容至总体积50 µL。孵育60分钟。</li>
		<li>每次使用50 µL PBS（0.01% Tween 20）洗涤，利用磁力分离器在每次洗涤后收集磁珠，共洗涤两次。</li>
		<li>用32.5 µL 5%冰醋酸洗脱两次。将合并的洗脱液（70 µL）用35 µL 2 M Tris中和，使最终pH值约为7。</li>
		<li>在酶标仪（见材料表）上选择适当的激发和发射波长读取荧光值，通过已知浓度游离荧光素的标准曲线计算尿液中荧光报告分子的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lopez-Otin, C., Bond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases%3A+Multifunctional+enzymes+in+life+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).</li>
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</ol>

Kwong 博士是 Glympse Bio 的联合创始人，并担任该公司的顾问，该公司正在开发与本文所述研究相关的产品。本研究可能影响其个人财务状况。该安排的条款已由佐治亚理工学院根据其利益冲突政策进行审查并批准。

本方法描述了基于活性的纳米传感器的开发，该传感器由蛋白酶底物与纳米颗粒核心偶联而成。蛋白水解切割事件被称为&#34;药代动力学开关&#34;，因为切割后的肽段产物小于肾脏滤过尺寸极限（5 nm）23&#160;，可滤入尿液从而产生无创信号。因此，使用流体动力学半径大于5 nm的纳米颗粒或载体至关重要，任何更小的颗粒都会被肾脏迅速清除，干扰尿液信号。我们采用聚乙二醇修饰的氧化铁纳米颗粒（IONPs），因为其已获美国FDA批准，生物相容性良好，且循环半衰期为3–5小时。13&#160;在纳米传感器的构建中，另一个重要考虑因素是聚乙二醇（PEG）与肽底物的摩尔比。24,25&#160;提高该比例可通过空间屏蔽作用减少非靶向蛋白酶引起的非特异性切割26，但也可能同时降低对靶标蛋白酶的反应活性；相反，较低的PEG与肽比例将增加蛋白酶对肽段的可及性和切割效率，从而增强检测信号，但可能同时增加...

蛋白酶是一类多功能酶，专司肽键的水解反应，在多种生物学过程（包括稳态、异稳态及疾病）中发挥重要调控作用1蛋白酶活性的改变与多种疾病相关，包括癌症和心血管疾病，这使得蛋白酶成为开发临床生物标志物的理想候选分子2,3此外，蛋白酶活性在功能上与不同的发病机制、患者预后及疾病转归密切相关。4生物传感器的开发广泛用于检测多种生物现象和疾病，例如癌症、神经退行性疾病以及电子转移过程。5,6,7,8,9更具体而言，已开发出基于底物的蛋白酶传感器用于检测蛋白酶活性，其中包括用于诊断成像的荧光探针10 以及同位素标记的肽类底物用于 体外 质谱检测11此外，已开发出基于活性的探针，这类探针含有类似底物的区域，可结合或修饰靶标蛋白酶12采用该方法时，目标蛋白酶的活性位点被修饰后将发生不可逆抑制，分析过程需要采集组织样本，因而受到限制 体内 应用。然而，检测蛋白酶活性非常重要 体内因为蛋白酶活性的调控在很大程度上依赖于其他生物学活动的背景，例如内源性抑制剂的存在。
本研究的目的是描述可检测蛋白酶活性的基于活性的纳米传感器的构建方法 体内 通过在尿液中产生可测量的信号。该平台作为一种无创诊断工具，利用失调的蛋白酶活性作为功能性生物标志物，以区分癌症等复杂疾病。我们的纳米传感器平台由与蛋白酶底物偶联的氧化铁纳米颗粒（IONP）组成。这些底物末端连接有荧光报告分子，当蛋白酶切割底物时，荧光报告分子被释放。这些IONP在体内循环 体内，定位于疾病部位，并使底物暴露于活性疾病相关蛋白酶。切割后，荧光报告分子被释放，因其分子量较小而进入尿液，而未切割的底物仍保留在IONP上并滞留于体内。因此，蛋白酶活性的升高 体内 将导致尿液中报告分子的浓度升高（图1）。由于我们的平台是一种尿液检测，因此无需影像学平台，诊断信号在尿液中即可富集。
该平台可被设计用于检测多种疾病，包括癌症、纤维化和血栓形成13,14。本文描述了用于检测基质金属蛋白酶9（Matrix metallopeptidase 9, MMP9）活性升高的纳米传感器的设计，以作为结直肠癌的生物标志物。结直肠癌是美国癌症死亡的第二大原因，仅2014年就估计有136,800例新发病例和50,300例死亡15。结直肠肿瘤细胞产生MMP9，研究表明该酶可促进恶性进展、基质降解以及转移16。此外，我们从文献中筛选出一种适用于MMP9的肽底物（PLGVRGK）17。该平台可用于癌症的早期检测以及低成本的即时诊断13,14,18,19,20,21。
<img alt="疾病相关蛋白水解通路示意图；IONP用于肾小球滤过及尿液诊断" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：纳米传感器活性示意图 在体. 纳米传感器在体内循环并定位于疾病部位。随后，与疾病相关的蛋白酶会切割由IONPs呈递的肽底物。切割后产生的片段尺寸允许其经由肾脏清除，从而在尿液中富集。动物排尿后，可通过其报告分子对这些肽片段进行分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>VWR</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>18G 针头</td><td>VWR</td><td>89134-024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>搅拌子</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td></td></tr><tr><td>加热板/磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>VWR</td><td>97064-482</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Thermo Fisher</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>六水合三氯化铁</td><td>Sigma</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>四水合二氯化铁</td><td>Sigma</td><td>44939</td><td></td></tr><tr><td>表氯醇</td><td>Sigma</td><td>45340-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Sigma</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Sigma</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>硼酸钠</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0020 9006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 10k 滤器，24 个装</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 30k 滤器，24 个装</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 100k 滤器，24 个装</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析盒</td><td>LifeTech</td><td>66130</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Tosylactivated</td><td>LifeTech</td><td>65501</td><td></td></tr><tr><td>SIA</td><td>Life Tech</td><td>22349</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20k</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>荧光素抗体 [2A3]</td><td>GeneTex</td><td>GTX10257</td><td></td></tr><tr><td>Hiload 16/600 Superdex 200</td><td>GE Healthcare</td><td>45-002-490</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Fisher</td><td>BTCYT5M</td><td></td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器</td><td>Fisher</td><td>NC0872854</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 用于无创诊断

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

蛋白酶是一类具有多种功能的酶，专门催化肽键的水解反应，调控包括稳态和异稳态在内的广泛生物学过程。此外，失调的蛋白酶活性可驱动疾病发生发展，并作为癌症等疾病的机能性生物标志物；因此，检测蛋白酶活性的能力 体内 可为生物医学诊断提供具有临床意义的信息。本实验方案的目的是构建用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 通过在尿液中产生可量化的信号。这些蛋白酶纳米传感器由两部分组成：纳米颗粒和底物。纳米颗粒的功能是延长血液循环半衰期，并将底物递送至目标疾病部位。底物为一段短肽序列（6-8个氨基酸），设计为特异性针对目标蛋白酶或一类蛋白酶。底物共价连接于纳米颗粒表面，并以报告分子（如荧光标记物）作为末端，用于检测。当失调的蛋白酶切割该肽段底物后，报告分子被过滤至尿液中，作为蛋白酶活性的生物标志物进行定量。本文描述了一种针对基质金属蛋白酶9（MMP9）的纳米传感器构建方法，MMP9与肿瘤进展和转移相关，在小鼠模型中用于结直肠癌的检测。

IONPs 群体中的大部分颗粒直径接近平均值，范围为 40 - 50 nm。聚乙二醇化（pegylation）后，该尺寸范围的颗粒在体内循环半衰期约为 6 小时13 in vivo（见图 2a）。若需选择特定尺寸范围的颗粒，可采用尺寸排阻色谱法分离出不同直径的 IONP 组分。透射电镜（TEM）下，这些纳米颗粒表现为由外层葡聚糖交联在一起的单个球形氧化铁纳米颗粒13 。IONPs 溶液呈半透明、无沉淀，颜色为浅棕色。成功进行肽段偶联后，光谱吸收分析将显示荧光报告分子最大激发波长处出现明显的吸收峰。以 FITC 为例，该吸收峰中心位于约 488 nm（见图 2b）。典型的肽段偶联反应经 FPLC 纯化后，可获得肽段与 IONP 的摩尔比为 20 - 50。为检测探针对蛋白酶活性的感应能力，可将一份纳米传感器样品...

蛋白酶是参与基本生物过程的严格调控酶类，而蛋白酶活性的失调会推动癌症等复杂疾病的进展。本方法旨在构建用于检测蛋白酶活性的纳米传感器 体内 通过产生可在宿主尿液中检测到并能区分疾病的裂解信号。

蛋白酶是一类具有多种功能的酶，专门催化肽键的水解反应，调控包括稳态在内的广泛生物学过程……

该方法有助于解答蛋白质组学与诊断学领域的一些关键问题，例如如何设计探针，通过在活体内测量蛋白酶的活性来检测疾病的进展。该方法的主要优势在于所开发的诊断技术具有非侵入性，并且能够真正放大生物信号的检测。由于许多蛋白酶实际上是疾病发病过程中的主要驱动因素，因此该方法可应用于多种疾病。在化学通风橱中，将 1 ml 30% 氨水转移至一个 15 ml 锥形管中。将该管放入装有冰的容器中，静置冷却 30 分钟。用去离子水清洗一个 250 ml 锥形瓶。然后加入 10 ml 双蒸水。将烧瓶浸入置于加热板上的冰浴中。使用塑料移液管，向烧瓶中的双蒸水中通入氮气。鼓泡15分钟以去除氧气。接下来，在15 ml锥形管中称取4.5 g糊精。加水，使包含糊精在内的混合物终体积为20 ml。剧烈涡旋以溶解糊精。称取78.5 mg三氯化铁六水合物，加入糊精溶液中，涡旋溶解。使用 0.2 µm 滤膜过滤所得溶液。随后，将 9 ml 去氧水转移至含有 1 ml 冰冻氨水的 15 ml 无菌锥形管中。将锥形管放回冰桶中冷却。称取73 mg四水合氯化亚铁，溶于剩余的1 ml脱氧双蒸水中。使用0.2 µm滤膜过滤该溶液。然后将右旋糖酐铁3溶液转移至250 ml锥形瓶中。在冰上以1,600 rpm搅拌的同时，用氮气脱氧15分钟。用橡胶隔垫密封烧瓶。使用18号针头穿刺隔垫，向烧瓶内通入氮气。插入另一根18号针头，作为流出口。接着，使用1 ml注射器将467 µl的二价铁溶液加入到右旋糖酐三价铁溶液中。在1,600 rpm下搅拌。将冷却的稀氨水溶液逐滴加入，以启动成核过程。确保每滴加入后充分混合，再添加下一滴。停止通入氮气，并移除橡胶隔垫。移去冰浴，换为温水浴。将溶液加热至 75 摄氏度，然后孵育 75 分钟。从加热板上取下烧瓶。将溶液依次通过0.2 μm滤膜和0.1 μm滤膜进行双重过滤，以去除任何粗颗粒。使用100 kDa分子量截断的浓缩管，将颗粒置换到双蒸水中，以去除过量的糊精。如果经过两到三次离心后滤过液仍呈深色，则需更换滤膜，因其可能已破损。接下来，将氧化铁纳米颗粒重悬于双蒸水中，浓度为每毫升10毫克。加入1.6倍体积的5摩尔氢氧化钠，然后加入0.65倍体积的环氧氯丙烷。使用平板摇床，在室温下剧烈混合12小时。使用带有18号针头的20 ml注射器将氧化铁纳米颗粒溶液转移至截留分子量为50 kDa的透析膜中。将透析膜置于4升双蒸水中，室温下孵育过夜。确定浓度后，将氧化铁纳米颗粒调整至每毫升含5 mg。加入氢氧化铵至终浓度为20%，并在室温下振荡至少12小时，以修饰氧化铁纳米颗粒的表面。随后使用30 kDa分子量截断滤膜进行缓冲液置换。按照文本方案中所述，采用动态光散射法测定氧化铁纳米颗粒的流体动力学半径。合成肽底物后，取0.5 mg氧化铁纳米颗粒加入10 kDa分子量截断的离心过滤管中。按照文本

nanosensors-to-detect-protease-activity-vivo-for-noninvasive

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

纳米传感器检测体内蛋白酶活性的无创诊断

蛋白酶荧光检测试剂盒旨在利用荧光测定法检测蛋白酶活性，也可用于检测微量蛋白酶污染。该方法基于蛋白酶对一种FITC标记的酪蛋白底物专有配方进行蛋白水解反应。...

使用蛋白酶荧光检测试剂盒测定蛋白酶活性

我们实验室制备的荧光纳米颗粒可用于成像生物系统中的离子浓度和离子流，例如细胞在信号传导过程中以及生理稳态下间质液中的离子动态。...

用于生物系统中离子浓度检测的荧光纳米颗粒

本视频展示了一种体外检测痰液样本中中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性的实验方法。含有分泌型蛋白酶的样本与携带识别基序的荧光报告分子共同孵育。当蛋白酶切割该识别基序后，报告分子的供体和受体荧光基团得以分离，各自发出荧光信号，从而指示样本中蛋白酶的活性。...

一种利用荧光报告分子体外检测中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性的实验方法

在本研究中，我们报道了一种基于杂合β-内酰胺酶技术的电导型生物传感器新方法，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法依赖于β-内酰胺水解过程中质子的释放。...

基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。...

使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

本文介绍了近期开发的一种蛋白酶检测平台的详细操作流程，该平台利用固定在镍-氮川三乙酸磁性琼脂糖珠表面的N端六组氨酸/麦芽糖结合蛋白与荧光蛋白融合的重组底物进行检测。同时，还介绍了对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的检测样品进行凝胶内分析的方法。...

利用重组融合蛋白进行荧光蛋白酶检测平台及其凝胶内复性

本文介绍了一种改良的荧光肽底物酶谱法的详细实验方案，该方法采用荧光标记的肽段作为可降解底物，取代传统的天然蛋白质。通过在荧光肽酶谱中对生物样品进行电泳，能够检测到比以往酶谱技术更广泛种类的蛋白酶。...

荧光肽底物酶谱法检测蛋白酶活性

核酸酶活性的改变与多种人类疾病状态相关，表明其作为疾病生物标志物的潜力。本文介绍了一种模块化且易于实施的筛选方法，可用于选择特异性的核酸探针，从而利用核酸酶活性作为疾病的生物标志物。...

利用核酸探针进行核酸酶活性的动力学筛选

本文所述方案提供了可视化和定量人类痰液中中性粒细胞蛋白酶活性的指南。此类分析的应用范围广泛，包括抗炎治疗的评估、生物标志物验证、药物筛选以及大规模队列临床研究。...

监测人类痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性

本方案描述了一种由CRISPR-Cas介导的多组分合成尿液生物标志物检测方法，可通过体外分析肿瘤相关蛋白酶活性，实现癌症的即时诊断。...

基于CRISPR-Cas的多组分合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断

学习利用纳米传感器在体内检测蛋白酶活性的无创诊断方法。该技术通过尿液样本中的切割信号实现疾病进展的实时监测，为癌症等多种疾病的早期诊断提供了高灵敏度的新型工具。

用于检测蛋白酶活性的纳米传感器体内用于无创诊断

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