Name: 体外细胞生理学研究中视网膜微动脉的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学习从大鼠视网膜分离微动脉的方法，用于电生理、钙成像和压力肌动描记研究。该方案有助于深入理解视网膜血流调节机制及血管平滑肌收缩性，为糖尿病视网膜病变等疾病的病理研究提供可靠实验基础。

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本文所述方案的开发得到了以下资助机构的资助：英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC，项目号 BB/I026359/1）、Fight for Sight（项目号 1429 和 1822）、青少年糖尿病研究基金会（Juvenile Diabetes Research Foundation，项目号 2-2003-525）、惠康信托基金（Wellcome Trust，项目号 074648/Z/04）、英国心脏基金会（British Heart Foundation，项目号 PG/11/94/29169）、北爱尔兰卫生与社会保健研究与发展部（HSC R&amp;#38;D Division，项目号 STL/4748/13）以及英国医学研究理事会（MRC，项目号 MC_PC_15026）。

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Joanna Kur 博士现就职于美敦力公司（美国明尼苏达州双子城），其目前的工作与本文所述内容无利益冲突。

上述方案需要练习，但经过少量调试后应可顺利实现。通常情况下，我们每天可从分离过程中获得 6 至 8 条可用的动脉小血管，并完成 3 至 4 次成功的实验。然而，若遇到问题，可采取一些措施以提高成功率。我们偶尔发现，特别是在使用较年轻的动物（< 8 周）时，动脉小血管的收获量可能较低。为解决此问题，建议在步骤 1.12 至 1.14 的每次吹打操作之间对视网膜组织进行离心（500 × g，10 至 30 秒）。这通常有助于提高血管的收获量，但同时也会增加制备物中的细胞碎片含量。
在为压力肌动图研究进行血管套管操作时，必须仔细检查微动脉是否存在在分叉部位附近被切断的侧支。这是实验过程中发生渗漏和压力丧失的常见原因。在[Ca2+]i实验方案中可能出现的主要问题是染料负载水平。染料负载不足会导致信噪比降低，而过度负载则会破坏正常的Ca2+稳态。为降低这两种问题发生的可能性，可在染料负载过程中定期取出少量视网膜匀浆样本，并周期性检查分离的血管。在进行膜片钳实验时，吉欧封接（gigaseal）形成的成功率高度依赖于基底膜的消化程度。在初次测试该方案或使用新批次的酶时，可能需要调整酶消化的浓度或时间。密切监测内皮层与平滑肌层的分离情况，可确保基底膜被充分消化以暴露足够区域便于操作。同时必须仔细监控以避免过度消化，其表现通常为血管开始收缩。一旦发生此现象，平滑肌细胞往往过于脆弱，无法进行膜片钳记录。在使用酶处理时，应加入DNA酶I，以确保清除在分离过程中受损细胞释放的DNA链。DNA片段具有黏性，会导致在清洗过程的最后阶段（步骤4.4）镊子黏附于微动脉，常导致血管丢失。血管清洗在技术上较为困难，最好在高倍放大（20X）下，使用尖端直径尽可能细的闭合镊子进行轻柔的扫动操作。每次扫动之间，应用实验纸巾清洁镊子。
如前所述，开发本论文所述方案的一个关键动机是深入理解视网膜血管疾病期间血流为何会受到破坏。迄今为止，我们的大部分工作集中于糖尿病性眼病28,33. 可使用第1节中描述的方法从糖尿病实验啮齿类动物模型的视网膜中分离小动脉。在对糖尿病动物的离体视网膜小动脉进行实验时，应尽量模拟这些血管所处的高血糖环境 在体因此，我们通常会将分离和实验溶液中的D-葡萄糖浓度提高至25 mM。血管基底膜增厚是糖尿病状态下视网膜血管中公认的现象。34,35. 当使用患有长期糖尿病的动物时（&#62; 1 个月病程），通常需要提高酶浓度或延长消化时间，以实现膜片钳记录技术的应用。
使用该方法的一个重要局限性 离体 分离的视网膜小动脉用于研究视网膜血管生理学与病理生理学时，一个主要问题是失去了周围视网膜神经组织的支持。尽管去除视网膜胶质细胞和神经元细胞可便于对视网膜血管平滑肌细胞进行细胞生理学研究，但血管对血管活性介质的反应在有或无视网膜组织存在的情况下可能发生显著变化。三磷酸腺苷（ATP）的作用即为说明这一问题的良好例证。在分离的大鼠视网膜小动脉中，加入ATP会引发血管强烈收缩36，而在神经纤维网完整存在的情况下，血管会舒张37因此，我们通常会尽可能利用分离的微动脉标本中的关键发现进行验证 离体 视网膜全层铺片和 在体 血管直径和血流量的测量16,37值得注意的是，近期已出现用于研究完整灌注猪视网膜中小动脉和毛细血管的新方法。 离体38,39此类制备方法有望极大增进我们对视网膜神经网如何调控视网膜小动脉和毛细血管张力，以及视网膜血流动力学变化如何调节视网膜内神经元活动的理解。
尽管本文所述方法主要聚焦于利用分离的大鼠视网膜小动脉研究小动脉平滑肌细胞的生理学特性，但我们目前正在开发新的方案，以实现对这些血管中内皮细胞功能的研究。在初步研究中，我们已成功优化了视网膜小动脉节段的酶消化方法，获得了具有活性的内皮细胞管，可用于Ca2+成像和膜片钳记录研究。未来，通过在两端对分离的小动脉进行插管，实现药物的管腔内递送，将有望用于研究这些血管中的内皮依赖性血管舒张反应。

了解视网膜血流的调控机制是一个重要的研究目标，因为异常的血流已被证实参与多种致盲性视网膜疾病的发病过程1,2,3,4。视网膜循环负责为内层视网膜神经元和胶质细胞供血，其血管结构为终动脉模式，即来自视网膜动脉和小动脉的所有血液均需流经毛细血管，再汇入视网膜小静脉，最终进入静脉5。视网膜内的血流由视网膜动脉和小动脉的张力，以及位于视网膜毛细血管和毛细血管后小静脉壁上的周细胞的收缩活性共同调节6,7,8。视网膜血管张力的调控机制十分复杂，受到循环系统及周围视网膜组织多种信号输入的调节，包括血液气体、循环分子和激素，以及由视网膜血管内皮细胞和大胶质细胞释放的血管活性物质9,10,11。视网膜小动脉是视网膜内的细小动脉分支，由单层血管平滑肌细胞和内层纵行排列的内皮细胞构成12,13,14。这些血管构成了视网膜循环中主要的血管阻力部位，因此在局部调控视网膜血流中发挥重要作用。视网膜小动脉通过血管平滑肌收缩性的变化，调节其管腔直径的舒张或收缩，从而调控视网膜毛细血管的血流10,15,16。因此，要理解视网膜小动脉调控视网膜灌注的分子机制，就需要建立一种能够接近并研究小动脉平滑肌细胞、且尽可能接近生理条件的实验体系。
离体分离的视网膜血管制备物可获取血管平滑肌细胞，同时仍保留其与底层血管内皮细胞之间的功能性和连接性。迄今为止，大多数使用分离血管的研究集中于大型动物（如牛或猪）的动脉血管（60 - 150 µm）。这些血管可安装于市售的导丝式或压力式肌动图系统中，以实现对血管平滑肌细胞收缩机制的药理学研究17,18。此类制备物极大地增进了我们对正常条件下视网膜血管生理学的认识。然而，极少研究采用从小型实验动物中分离的视网膜微动脉，因其直径较小（约 8 - 45 µm），难以适用于传统的肌动图系统19,20,21,22。但使用小型实验动物血管的一个重要优势在于，存在大量可获得的基因修饰、转基因及视网膜疾病模型。此外，小型实验动物也更适用于在体干预研究。
本文介绍了用于压力肌动图实验的大鼠视网膜小动脉分离与套管植入的简便方案。Ca2+ 使用这些血管的成像和电生理学方案也进行了详细说明。这些方法可为进一步了解视网膜血管平滑肌收缩性及血流调节机制提供新的见解。

<table><tbody><tr><td>烧杯</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>一次性塑料移液管/转移管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6 mL 最佳，但其他规格也可接受；移除枪头以扩大开口</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>任何同等精细的镊子</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>用火烧抛光以减少摩擦，但抛光程度不足以使尖端变窄</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>或任何等效的10 cm产品</td></tr><tr><td>移液管乳头</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>纯化水供应</td><td>Merek</td><td>Milli-Q Integral 水纯化系统</td><td>或任何等效系统</td></tr><tr><td>圆底试管</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL；任何等效产品</td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>单边刀片</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>道康宁</td><td>184</td><td>或任何柔韧的表面&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>试管架</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>压力肌动图</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三轴机械操纵器</td><td>科学仪器</td><td>LBM-7&amp;nbsp;</td><td>x2（或任何等效产品）</td></tr><tr><td>三通旋塞</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>防震台</td><td>Technical Manufacturing Corporation&amp;nbsp;</td><td>洁净台</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>分析软件&amp;nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td><td>免费成像软件</td></tr><tr><td>分析插件</td><td>Myotraker&amp;nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>ImageJ 的自定义插件，可免费下载</td></tr><tr><td>灌注移液管玻璃</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>用DMSO配制1 mM的母液</td></tr><tr><td>镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>任何同等精细的镊子</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>用DMSO配制1 mM的母液</td></tr><tr><td>玻璃底记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>辅助移液管玻璃</td><td>World Precision Instruments</td><td>IB150F-3</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>在线加热器</td><td>定制制作</td><td></td><td>Harvard Apparatus 公司生产的 SH-27B 溶液在线加热器</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclypse TE 300</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>压力计</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>微熔器 +&amp;nbsp; 奥林巴斯CX31显微镜</td><td>玻璃器皿</td><td>精细尖端 F-550</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter 仪器</td><td>MP-285</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>多通道输送歧管&amp;nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>灌流笔</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>移液管填充器&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 mL</td><td>注射器加热并拉制至移液管的内径</td></tr><tr><td>移液管固定器</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>吸气泵</td><td>解释</td><td>AP1</td><td>通过反转风箱改装通气泵</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>20 mL 鲁尔锁</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>钨丝</td><td>外膜</td><td>W558818</td><td>75&amp;mu;微米直径</td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>VWR</td><td>各种尺寸</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>USB摄像头</td><td>&amp;nbsp;罗技&amp;nbsp;</td><td>HD Pro 网络摄像头 C920</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>视频采集软件</td><td>Hypercam</td><td>版本 2.28.01</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>水浴</td><td>基金</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>x20物镜</td><td>尼康</td><td>20x/0.40 WD 3.8 &amp;infin;/0.17</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>x4 物镜</td><td>尼康</td><td>4倍/0.10，工作距离 30， &amp;infin;/-</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>膜片钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>三轴机械操纵器</td><td>科学仪器</td><td>LBM-7&amp;nbsp;</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>防震台</td><td>Technical Manufacturing Corporation&amp;nbsp;</td><td>洁净台</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>每日将3 mg溶解于50 &amp;mu;L 的 DMSO（超声助溶）</td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200a</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>模拟数字转换器</td><td>轴突</td><td>Digidata 1440A</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>I型胶原酶A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&amp;nbsp;</td><td>0.1 mg/mL in LCH</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>DNA酶 I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>工作液 1 MU mL-1（10 MU 溶于 10 mL LCH）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>定制生产</td><td></td><td>任何同等的商用产品</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Dumont</td><td>7号</td><td>任何超细镊子</td></tr><tr><td>玻璃底记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>在线加热器</td><td>定制</td><td></td><td>哈佛仪器公司生产的SH-27B溶液在线加热器</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclypse TE 300</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter instruments</td><td>P97</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>微熔器 +&amp;nbsp; 奥林巴斯CX 31显微镜</td><td>玻璃器皿</td><td>精细尖头 F-550</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter instruments</td><td>MP-285</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>多通道输送歧管&amp;nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>灌流笔</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>修补软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp v10.2</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>移液管填充器&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 mL</td><td>注射器加热并拉制至移液管的内径</td></tr><tr><td>移液管固定器</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>蛋白酶 XIV 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&amp;nbsp;</td><td>0.01 mg/mL，溶于LCH</td></tr><tr><td>单通道移液管玻璃</td><td>World Precision Instruments</td><td>IB150F-3</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>抽吸泵</td><td>解释</td><td>AP1</td><td>通过反转风箱改装通气泵</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>20 mL 鲁尔锁</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>钨丝</td><td>外膜</td><td>W557418</td><td>50&amp;mu;微米直径</td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>VWR</td><td>各种尺寸</td><td>任何可兼容的替代产品</td></tr><tr><td>USB摄像头</td><td>&amp;nbsp;罗技&amp;nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>水浴</td><td>基金</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>全细胞记录移液管玻璃</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>x20物镜</td><td>尼康</td><td>20x/0.40 WD 3.8 &amp;infin;/0.17</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>x4 物镜</td><td>尼康</td><td>4倍/0.10，工作距离 30， &amp;infin;/-</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>x40物镜</td><td>尼康</td><td>40x/0.55，WD 2.1 &amp;infin;/1.2</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>钙&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 成像</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>三轴机械操纵器</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&amp;nbsp;</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>采集软件&amp;nbsp;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>采集引擎 V1.1.5</td><td>或任何等效产品；微荧光测定法</td></tr><tr><td>防震台</td><td>Technical Manufacturing Corporation&amp;nbsp;</td><td>洁净台</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>共聚焦成像分析软件</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td><td>免费成像软件</td></tr><tr><td>计算机</td><td>戴尔</td><td>Optiplex 7010</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&amp;nbsp;</td><td>或任何等效产品；共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Dumont</td><td>7号</td><td>任何超细镊子</td></tr><tr><td>玻璃底记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>在线加热器</td><td>定制</td><td></td><td>哈佛仪器公司生产的SH-27B溶液在线加热器</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse TE2000</td><td>或任何等效产品；微荧光测定法</td></tr><tr><td>单色仪&amp;nbsp;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Optoscan</td><td>或任何等效产品；微荧光测定法</td></tr><tr><td>多通道输送歧管&amp;nbsp;</td><td>Automate Scientific</td><td>灌流笔</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>移液管填充器&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1 mL</td><td>注射器加热并拉制至移液管的内径</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜软件</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF 版本 3.3</td><td>或任何等效产品；共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>吸气泵</td><td>解释</td><td>AP1</td><td>通过反转风箱改装通气泵</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>20 mL 鲁尔锁</td><td>或任何等效产品</td></tr><tr><td>钨丝</td><td>外膜</td><td>W557418</td><td>50&amp;mu;微米直径</td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>VWR</td><td>各种尺寸</td><td>任何可兼容的替代产品</td></tr><tr><td>水浴</td><td>资助</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>x100物镜</td><td>尼康</td><td>x100 N.A. 1.3 油镜</td><td>或任何等效产品；微荧光测定法</td></tr><tr><td>x20物镜</td><td>尼康</td><td>20x/0.40 WD 3.8 &amp;infin;/0.17</td><td>或任何等效产品；微荧光测定法</td></tr><tr><td>x20物镜</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR，20x/0.50 &amp;infin;/0.17/D</td><td>或任何等效产品；共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>x4 物镜</td><td>尼康</td><td>4倍/0.10，工作距离 30 &amp;infin;/-</td><td>或任何等效产品；微区荧光测定法</td></tr><tr><td>x63 物镜</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO，63x/1.40 - 0.60 油镜 CS &amp;infin;/0.17/E</td><td>或任何等效产品；共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>Y型连接器</td><td>World Precision Instruments</td><td>14012</td><td>或任何同等产品</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;移液管&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;实验用移液管制作的规格与设置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>辅助移液管</td><td>World Precision Instruments</td><td>IB150F-3</td><td>内径：0.86 mm&lt;br/&gt; 斜率：261&lt;br/&gt; 压力：300&lt;br/&gt; 加热：280&lt;br/&gt; 拉：0&lt;br/&gt; 速度：56&lt;br/&gt; 时间：250&lt;br/&gt; 循环次数：4&lt;br/&gt; 尖端直径：0.5–2 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 抛光：是&lt;br/&gt; 终末阻力： &gt;10 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>灌注微管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>内径：1.17 mm&lt;br/&gt; 斜率：290&lt;br/&gt; 压力：300&lt;br/&gt; 加热：280&lt;br/&gt; 拉：0&lt;br/&gt; 速度：58&lt;br/&gt; 时间：150&lt;br/&gt; 循环次数：4&lt;br/&gt; 尖端直径：3-10 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 抛光：否&lt;br/&gt; 最终阻力： &amp;<1 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>细胞贴附式膜片钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>IB150F-3</td><td>内径：0.86 mm&lt;br/&gt; 斜率：261&lt;br/&gt; 压力：300&lt;br/&gt; 加热：280&lt;br/&gt; 拉力：0&lt;br/&gt; 速度：56&lt;br/&gt; 时间：250&lt;br/&gt; 循环次数：4&lt;br/&gt; 尖端直径：0.5–2 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 抛光：是&lt;br/&gt; 最终阻力： &gt;5 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>全细胞膜片钳</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>内径：1.17 mm&lt;br/&gt; 斜率：296&lt;br/&gt; 压力：200&lt;br/&gt; 加热：287&lt;br/&gt; 拉力：0&lt;br/&gt; 速度：50&lt;br/&gt; 时间：250&lt;br/&gt; 循环次数：4&lt;br/&gt; 尖端直径：2-3 &amp;mu;m&lt;br/&gt; 打磨：有帮助但非必需&lt;br/&gt; 最终电阻：1-2 MΩ&amp;Omega;</td></tr></tbody></table>

视网膜小动脉的分离用于 离体 细胞生理学研究

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

视网膜是一种代谢极为活跃的组织，需要充足的血液供应。视网膜循环为内层视网膜提供支持，而脉络膜血管则为感光细胞供血。视网膜灌注的改变与多种威胁视力的疾病相关，包括糖尿病性视网膜病变、青光眼和视网膜分支静脉阻塞。了解参与调控视网膜血流的分子机制及其在眼病过程中的变化，可能有助于发现治疗这些疾病的新靶点。视网膜小动脉是视网膜主要的阻力血管，因此通过管腔直径的变化在调节视网膜血流动力学中发挥关键作用。近年来，我们已建立了从大鼠视网膜分离小动脉的方法，适用于包括细胞生理学研究在内的多种应用。该制备方法已开始揭示视网膜血流调控的新机制，并使我们能够识别眼病过程中发生的一些关键改变。本文中，我们描述了大鼠视网膜小动脉的分离方法，并提供了其在膜片钳电生理、钙成像和压力肌图研究中的应用方案。这些血管也适用于基于PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学的研究。

本文描述了一种从大鼠视网膜分离小动脉的简便方案，可用于电生理学、钙成像和压力肌动图研究。

视网膜是一种代谢极为活跃的组织，需要充足的血液供应。视网膜循环为内层视网膜提供支持，而脉络膜血管则为光感受器提供营养。视网膜灌注的改变与多种威胁视力的疾病相关，包括糖尿病性视网膜病变、青光眼和视网膜分支静脉阻塞。深入了解调控视网膜血流的分子机制及其在眼病过程中的变化，可能有助于发现治疗这些疾病的新靶点。视网膜小动脉是视网膜主要的阻力血管，因此通过管腔直径的变化在调节视网膜血流动力学中发挥关键作用。近年来，我们已建立了适用于多种应用（包括细胞生理学研究）的大鼠视网膜小动脉分离方法。该制备技术已开始揭示视网膜血流调控的新机制，并使我们能够识别眼病过程中发生的一些关键改变。本文描述了大鼠视网膜小动脉的分离方法，并提供了其在膜片钳电生理、钙成像和压力肌图研究中的应用方案。这些血管也适用于基于PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学的研究。

了解视网膜血流的调控机制是一个重要的研究目标，因为异常的血流已被证实与多种威胁视力的视网膜疾病（如糖尿病性视网膜病变、青光眼和视网膜分支静脉阻塞）的发生发展密切相关。视网膜小动脉通过其管腔直径的舒张与收缩，在调节视网膜血流中发挥关键作用，这一过程由环绕这些血管的平滑肌细胞收缩性变化所介导。因此，要理解视网膜灌注调控背后的分子机制，就需要建立一种能够接近并研究视网膜小动脉平滑肌细胞的实验体系，且其研究条件应尽可能接近生理状态。在本视频中，我们演示了一种从大鼠视网膜分离小动脉的简便方案，该方案可用于膜片钳、钙成像和压力肌动图研究。近年来，该制备方法已被用于进一步揭示视网膜血管平滑肌收缩性及血流在生理和病理状态下的调控机制。按照材料表所示，配制一升含低钙的Hanks'溶液或LCH溶液。在采集组织前组装好分离所需的设备。玻璃巴斯德吸管必须经过火焰抛光，使管尖光滑但不收窄。将塑料吸管剪裁至开口直径约为五到七毫米。将眼球置于解剖皿中，浸入LCH溶液内。使用一对镊子夹住眼眶肌肉附着处或视神经，以固定眼球。固定点应尽可能靠近巩膜，以稳定眼球。使用刀片沿锯齿缘切开角膜，并用镊子轻轻按压巩膜以取出晶状体。在此图像中我们看到的眼球后部的小圆形区域是视神经。使用刀片通过视盘将眼杯对称地切成两半。使用闭合的镊子轻轻将视网膜从眼杯的两个半部分中刷出，注意清除视盘处任何残留的附着组织。用第二个眼球重复此操作，并用塑料移液管及少量LCH培养基将分离的视网膜转移至试管中。用塑料移液管向试管中加入LCH培养基至约五毫升，静置使视网膜沉降至管底。使用塑料移液管从管中移除约四毫升溶液，并加入新鲜的LCH，将组织清洗约三次。必要时，应去除多余的组织。用LCH清洗内壁光滑尖端的玻璃巴斯德移液管，以防止组织粘附在移液管上。使用同一根移液管，从试管中移除约四毫升溶液，并加入约两毫升新鲜的LCH。通过将组织缓慢地吸入玻璃移液管尖端并推出，轻柔地解离视网膜，将内容物排回试管中。此步骤应尽量避免产生气泡，重复操作直至视网膜组织被分散成约2至3平方毫米大小的碎片。用约两毫升 LCH 冲洗移液管内部，并将液体排入试管中。静置 5 到 10 分钟，使内容物沉降至管底。按照前述方法重复吹打操作，力度稍加大，直至组织块大小约为 1 平方毫米。让组织沉淀，再用更大的力度重复一次，直至内容物完全匀浆，无任何视网膜碎片残留。此时溶液应呈乳白色。该技术每次分离可获得最多八个动脉小段，长度为200至2,500微米。通过将小动脉一端插管并阻塞另一端，可测量压力诱导的血管收缩，即所谓的肌源性反应。小动脉压力血管成像操作步骤如下：取一份视网膜匀浆液，转移至倒置显微镜载物台上安装的生理记录室中。让匀浆在腔室底部静置至少五分钟。在记录腔室内进行目视扫描，找出长度超过200微米且具有一端开放末端的微动脉，以便对血管进行套管插管。使用精细镊子和置于血管上方的细钨丝环固定血管的一端。利用钨丝的重叠端，将血管移动至灌流槽中并使其水平横跨，使开口端与加压套管对齐。用37摄氏度的无钙Hanks液灌注腔室。套管插入操作使用玻璃移液管进行。使用精细的显微操作器将套管置于血管的开口端。通过调节显微镜的焦平面，使套管尖端紧邻开口处，确保血管末端与套管尖端同时处于焦点范围内，然后将加压套管推进至血管开口内。套管插入过程需要辅助移液管协助，用于轻柔地固定小动脉，并在套管插入血管腔的同时引导小动脉壁覆盖在加压套管上。该操作需要同时控制两个操纵器进行协调移动，并经过大量练习才能达到较高的成功率。在零毫米汞柱压力下记录一分钟后，将管腔内压力升高至40毫米汞柱，此时血管应迅速扩张，从而确认插管成功。随后，压力诱导的血管收缩（即肌源性反应）将在约15分钟的时间内逐渐形成。对视网膜血管平滑肌细胞进行膜片钳记录，可研究调控细胞内钙离子浓度及细胞收缩性的质膜离子电流。可在平滑肌细胞仍嵌于其来源小动脉组织中的情况下，对单个细胞进行全细胞和单通道记录，具体步骤如下：分离视网膜小动脉，并用钨丝固定于记录室中。需要消化基底膜，以便在膜片钳电极与小动脉平滑肌细胞膜之间形成高阻封接。小动脉在37摄氏度下依次用一系列酶溶液灌流，此过程还会导致相邻细胞的电耦合解除，如图中箭头所示。在胶原酶处理步骤中，通过观察内皮层与平滑肌层的分离情况，初步评估消化程度。通过用精细镊子的闭合尖端沿血管表面轻轻扫过，可去除残留的基膜细丝和/或周围神经网。进行膜片钳记录时，将膜片电极尖端垂直置于目标细胞上方，并利用显微操作器的精细缓慢移动逐步下放，直至与小动脉平滑肌细胞膜接触。此过程可通过观察细胞移动以及使用采集软件中的细胞封接测试程序测量电极电阻的变化来判断。当移液管下降至细胞表面时，封接电阻将增加约五倍。此时向移液管后端短暂施加负压，逐渐形成吉欧封接（gigaseal）。此过程需要在1至5分钟内反复施加负压。对于全细胞记录，主要采用穿孔膜片钳技术。如前所述，使用含有细胞内液类似溶液和两性霉素B的玻璃微电极形成吉欧封接。通过采集软件中的膜特性测试程序监测接入电阻。当接入电阻降至15兆欧以下时，进行串联电阻补偿。在穿孔膜片钳模式下，通常可将串联电阻补偿约75%。随后可使用电压阶跃或电压斜坡程序来测量全细胞电流。在视网膜解离后，可根据血管口径以及血管平滑肌细胞的排列方式，识别出一级、二级和前毛细血管微动脉。一级和二级动脉在明场显微镜下外观相似，但可根据其大小加以区分。前毛细血管小动脉是制备样本中最小的动脉血管，因其血管平滑肌细胞呈间断性排列而易于识别。分离得到的小动脉在分离过程中可明显区别于毛细血管和微静脉。毛细血管表现为直径约4至10微米的小口径血管网状结构，而微静脉管壁较薄，缺乏平滑肌细胞包绕。初级、次级及前毛细血管微动脉适用于压力肌图法、钙成像和膜片钳研究。利用加压的微动脉，我们已探究了参与肌源性反应产生的分子机制。本图中的显微照片显示了在压力肌动描记实验过程中不同时间点的大鼠视网膜小动脉。下方的时间进程图展示了整个实验过程中血管直径的变化。在加压后，血管立即发生扩张，随后出现主动的肌源性收缩，并在15分钟后达到稳态水平。实验结束时，在无钙汉克斯溶液中加入渥曼青霉素，使血管扩张至其被动直径，以用于归一化处理。此幻灯片展示了一个视网膜小动脉平滑肌细胞在膜拉伸前后单通道膜片钳记录的示例。该细胞附着式膜片包含两个牵张激活的TRPV2通道，其活性随着对膜片钳电极施加负压而增加。本文所述方案需要一定练习，但经过少量调试后应可顺利实现。我们建议在分离 arterioles 的当天立即使用。该方法针对大鼠视网膜 arterioles 优化，但也可用于小鼠视网膜。目前我们已广泛使用这一制备方法，但尽可能地，我们也尝试利用离体视网膜铺片以及血管直径和血流的在体测量来验证我们的关键发现。

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生物学

体外细胞生理学研究中视网膜微动脉的分离

离体视网膜电图（ex vivo ERG）可用于直接记录动物或人离体完整视网膜中视网膜细胞的电活动。本文展示了如何改造常用的活体视网膜电图（in vivo ERG）系统，以用于离体视网膜电图（ex vivo...

同时 离体 通过双视网膜功能测试 体内 视网膜电图系统

许多威胁视力的眼部疾病与视网膜微血管功能障碍相关。因此，测量视网膜小动脉反应对于研究其潜在的病理生理机制具有重要意义。本文介绍了一种详细的小鼠视网膜小动脉分离与制备方案，用于评估血管活性物质对血管直径的影响。...

小鼠视网膜小动脉反应性测定前的准备步骤 离体

我们展示了三种不同的组织制备技术，用于免疫组织化学可视化大鼠视网膜微血管周细胞， 即，...

视网膜冷冻切片、全层铺片及低渗分离血管制备用于微血管周细胞的免疫组织化学可视化

该方案描述了小鼠器官型外植体的制备方法 神经视网膜，与视网膜色素上皮（RPE）共同培养于R16定义培养基中，该培养基不含血清和抗生素。与传统方法相比，该方法操作相对简便、成本较低且耗时较少。 体内...

长期无血清培养具有完整视网膜色素上皮的小鼠视网膜组织外植体

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色实验方法，适用于整体视网膜标本，以及用于定量测量在增殖性和非增殖性视网膜病变中常发生变化的血管参数所需的相关实验方案。...

非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

本方案描述了一种用于分离小鼠出生后视网膜内皮细胞的方法，该方法在细胞得率、纯度和活力方面均经过优化。这些细胞适用于下一代测序技术。...

从小鼠视网膜中分离内皮细胞用于下一代测序

本文展示了从小鼠脑实质小动脉中大量制备完整脑微血管内皮"管状结构"的方法，用于研究脑血流调节机制。此外，我们还阐述了该内皮细胞研究模型在荧光成像和电生理学检测中的实验优势，可应用于关键细胞信号通路的分析，包括细胞内[Ca2+]浓度变化和膜电位变化。...

小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。...

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

本方案介绍并描述了从成年小鼠获取的视网膜外植体的分离、解剖、培养和染色步骤。该方法作为一种离体（ex...

成年小鼠视网膜外植体作为 离体 研究视网膜神经血管疾病的模型

已建立一种保护性检测方法，用于监测视网膜血管对糖尿病或糖尿病视网膜病变相关损伤（如氧化应激和细胞因子）导致的细胞死亡的抵抗能力。...

一种检测小鼠视网膜血管免受糖尿病相关死亡的保护作用的实验方法

此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位...

一个 离体 研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

学习从大鼠视网膜分离微动脉的方法，用于电生理、钙成像和压力肌动描记研究。该方案有助于深入理解视网膜血流调节机制及血管平滑肌收缩性，为糖尿病视网膜病变等疾病的病理研究提供可靠实验基础。

视网膜小动脉的分离用于离体细胞生理学研究

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视网膜小动脉的分离用于 离体 细胞生理学研究

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