体外细胞生理学研究中视网膜微动脉的分离

这篇手稿描述了一个简单的协议, 从大鼠视网膜分离的小动脉, 可用于电生理, 钙成像和压力 myography 研究。

了解如何控制视网膜中的血流是一个重要目标，因为异常血流与各种威胁视力的视网膜疾病的发展有关，例如糖尿病视网膜病变、青光眼和分支静脉阻塞。视网膜小动脉通过扩张和收缩其管腔直径在调节视网膜中的血流中起关键作用，这是由围绕这些血管的平滑肌细胞的收缩力变化介导的。因此，了解视网膜灌注调节的分子机制需要制备可以在尽可能接近生理的条件下接触和研究视网膜小动脉平滑肌细胞的准备工作。

在本视频中，我们演示了一种从大鼠视网膜中分离小动脉的简单方案，可用于膜片钳、钙成像和压力肌层造影研究。在过去的几年里，这种制剂已被用于进一步了解健康和疾病中视网膜血管平滑肌收缩力和血流的调节。配制一升含 Hanks 或 LCH 的低钙溶液，如材料表所示。

在收集组织之前组装隔离设备。玻璃巴斯德移液器必须经过火抛光以平滑，但不能使尖端变窄。将塑料移液器修剪到大约 5 到 7 毫米的孔径。

将眼睛放在解剖皿上，浸入 LCH 溶液中。使用一副镊子通过握住眼眶肌附件或视神经，将眼睛固定在培养皿上。确保锚定点尽可能靠近巩膜以稳定眼睛。

使用刀片，沿着 ora serrata 切开角膜，然后用镊子轻轻按压巩膜取下晶状体。在这张图片中，我们在眼睛后部看到的小圆形区域是视神经。使用刀片，通过光学盘将眼罩对称地切成两半。

使用闭合的镊子轻轻地从眼罩的两半刷出视网膜，注意去除视盘上的任何剩余附件。用第二只眼睛重复该过程，并使用塑料移液管和一小滴 LCH 培养基将解剖的视网膜转移到试管中。使用塑料移液管，用 LCH 填充试管至约 5 毫升，并让视网膜沉淀到试管底部。

从试管中取出大约 4 毫升溶液并使用塑料移液管加入新鲜的 LCH，将组织洗涤大约 3 次。必要时，应去除外来组织。用 LCH 抛光尖端清洗玻璃巴斯德移液器的内部，以防止组织粘在移液器上。

使用相同的移液器，从试管中取出大约 4 毫升的溶液，并加入大约 2 毫升的新鲜 LCH。通过玻璃移液管的尖端缓慢抽取组织，轻轻地分离视网膜，然后将内容物排入试管中。在这个阶段尽量不要引入气泡，并重复这个过程，直到视网膜破裂到大约 2 到 3 平方毫米的大小。

用大约 2 毫升 LCH 清洗移液器内部，然后将其排出到试管中。让内容物在 5 到 10 分钟内沉淀到底部。如前所述重复研磨过程，用更大的力，直到组织块的大小约为 1 平方毫米。

让组织沉淀，然后用更大的力再次重复，直到内容物完全匀浆并且没有视网膜碎片残留。这个阶段的溶液应该看起来呈乳白色。该技术每次分离将产生多达 8 个小动脉段，长度为 200 至 2， 500 微米。

小动脉一端的插管与另一端的闭塞可以测量压力诱导的血管收缩，也称为肌源性反应。小动脉压迫肌层造影按如下方式进行。将等分的视黄醛匀浆转移到安装在倒置显微镜载物台上的生理记录室中。

让匀浆在腔室底部沉淀至少 5 分钟。目视扫描整个记录室，以识别长度大于 200 微米且具有开口端的小动脉，可以通过该小动脉插管。使用细镊子和放置在容器上的小钨丝滑片在容器的一端锚定。

使用钨丝的重叠端，纵容器水平穿过浴槽，使开口端与加压套管对齐。在 37 摄氏度时用零钙 Hanks' 灌注腔室。用玻璃移液器进行插管。

使用精细的显微作器将套管定位在血管的开口端。通过调整显微镜上的聚焦平面来评估尖端紧邻开口的位置，使得血管末端和套管尖端同时聚焦，并且加压套管推进到血管孔中。需要一个辅助移液器来协助插管过程，用于轻轻地抑制小动脉并引导小动脉壁越过加压套管，同时将套管推进到血管腔中。

该程序需要两个机械手同时、受控地移动和大量练习，以实现高成功率。在零毫米汞柱下记录 1 分钟后，腔内压力增加到 40 毫米汞柱，血管应迅速扩张，确认插管成功。压力诱发的血管收缩，即肌源性反应，随后将在大约 15 分钟内发展。

来自视网膜血管平滑肌细胞的膜片钳记录能够研究调节细胞内钙和细胞收缩力的质膜离子电流。从仍嵌入其母小动脉内的单个平滑肌细胞中可以进行全细胞和单通道记录，如下所示。视网膜小动脉被分离并用钨丝片固定在记录室中。

基底层需要被消化掉，以便在贴片移液管和小动脉平滑肌细胞膜之间形成高阻力密封。小动脉在 37 摄氏度下与一系列连续的酶溶液融合，这也导致相邻细胞的电解耦，如图像上的箭头所示。在胶原酶步骤中，最初通过内皮层和平滑肌层的视觉分离来评估消化水平。

通过沿着血管表面小心地扫动细钳的闭合尖端，可以去除任何剩余的基底层和/或周围神经桩。对于膜片钳，将膜片移液管的尖端垂直放置在感兴趣的细胞上，并使用显微作器的精细、缓慢的运动逐渐降低，以与小动脉平滑肌膜接触。这是通过细胞移动和移液器阻力的变化来判断的，使用采集软件中的细胞密封测试方案进行测量。

当移液器下降到比色皿上时，密封阻力将增加约五倍。将负压瞬时施加到移液器的背面，并逐渐形成 gigaseal。这需要在 1 到 5 分钟内反复施加负压。

对于全细胞记录，主要使用穿孔膜片钳方法。如前所述，用含有细胞内样溶液和两性霉素 B 的移液管形成 gigaseal.使用采集软件中的膜测试方案监测访问电阻。一旦访问电阻降至 15 兆欧以下，则执行串联电阻补偿。

通常，在穿孔贴片模式下，可以将串联电阻补偿大约 75%。然后可以使用电压阶跃或斜坡协议来测量全电池电流。视网膜解离后，可以根据其口径和血管平滑肌细胞的排列来识别原发性、次级和毛细血管前小动脉。

一级和二级小动脉在明场显微镜下看起来相似，但可以根据它们的大小进行区分。毛细血管前小动脉是制剂中最小的动脉血管，由于血管平滑肌细胞的间歇性排列，很容易识别。分离的小动脉可以与分离内的毛细血管和小静脉明显区分开来。

毛细血管明显为直径约 4 至 10 μm 的小口径血管的网状结构，而小静脉壁较薄，缺乏平滑肌细胞覆盖。原发性、继发性和毛细血管前小动脉适用于压力肌层造影、钙成像和膜片钳研究。使用加压小动脉，我们研究了参与产生肌原反应的分子机制。

该图像中的显微照片显示了压力肌层摄影实验过程中不同时间点的大鼠视网膜小动脉。下面的时程图显示了整个实验过程中血管直径的变化。加压后，血管立即扩张，然后是主动的肌源性收缩，15 分钟后达到稳态水平。

在实验结束时，在零钙 Hanks 溶液中添加渥曼青霉素可将血管扩张至其被动直径以达到正常化目的。这张幻灯片显示了膜拉伸前后视网膜小动脉平滑肌细胞的单通道膜片钳记录示例。该细胞贴剂包含两个拉伸激活的 TRPV2 通道，其活性随着对贴剂移液管施加负压而增加。

此处描述的协议需要练习，但应该可以通过最少的故障排除来实现。我们建议在隔离的同一天使用分离的小动脉。该方法针对大鼠视网膜小动脉进行了优化，但可用于小鼠视网膜。

现在我们已经广泛使用了这种制剂，但在可能的情况下，我们也尝试使用离体视网膜整片和血管直径和血流的体内测量来验证我们的主要发现。